用于人类癌症检测的双靶向磁性纳米粒子

介绍

恶性肿瘤对人类健康构成巨大威胁[1]。既往研究表明，肿瘤微环境会影响肿瘤的生物学特性，如肿瘤相关转移[2, 3]。然而，潜在的机制，特别是淋巴管内皮细胞 (LEC) 促进肿瘤转移的过程，仍不清楚 [4]。因此，有必要设计基于淋巴管的肿瘤诊断策略。缺乏淋巴特异性标志物，尤其是那些区分 LEC 与血管内皮的标志物，限制了对 LEC 功能的研究。近年来，LECs 特异性标志物，如淋巴管内皮透明质酸受体 1 (LYVE-1) [5, 6]、Podoplanin [7]、血管内皮生长因子受体 3 (VEGFR-3) [8] 和 Prox -1 已确定 [9]。这加速了对肿瘤淋巴管的研究，特别是通过靶向肿瘤内淋巴管来诊断肿瘤。它还通过使用免疫磁珠对肿瘤内淋巴内皮细胞进行分选来研究肿瘤转移的机制 [10]。然而，类似于分子病理学中使用的许多其他标记，LEC 相关的分子标记中没有一个是完全特异于 LEC 的。由于Prox-1在细胞核中的瞬时表达[11]，不适合临床应用。尽管 VEGFR-3 在 LEC 中表达，但它在癌症中缺乏淋巴特异性，因为它也在血管上皮中表达 [8]。 LYVE-1 在 LEC 以及正常肝窦、脾内皮、高内皮微静脉以及活化的组织巨噬细胞中特异性表达，但在血管上皮中不表达 [7]。 Podoplanin在血管上皮细胞中不表达，但它是LEC的特异性标志物[7, 12]。

磁性三氧化二铁、纳米金、量子点、脂质体、氧化钛等具有生物相容性高、比表面积大、易于与其他生物功能分子修饰等优点，被广泛应用于癌症的诊断和治疗[13, 14]。除上述特点外，磁性三氧化二铁（Fe3O4）粒径分布窄、分散性好、顺磁性高、尺寸可控，适用于磁共振成像[15]。其中，抗体包被的超顺磁性氧化铁已广泛应用于肿瘤的细胞分离、识别和早期诊断[16, 17]。作为一种天然高分子物质，壳聚糖表面富含羟基和氨基，因其生物相容性、血液相容性、安全性和微生物降解性等优异性能而得到广泛应用[18]。因此，壳聚糖或壳聚糖衍生物与磁性Fe3O4结合更有利于生物应用，因为它可以防止磁珠相互团聚形成磁性流体。因此，它产生了更好的分散性能。

在肿瘤研究中，检测肿瘤中的淋巴管是基于直接用抗体标记，或通过抗体结合磁珠对淋巴管内皮细胞进行分选。在这里，为了更准确地靶向肿瘤内淋巴管，我们设计了一种多靶向纳米探针，即两种针对淋巴内皮细胞的高度特异性抗体，抗 Lyve-1 抗体和抗 podplanin 抗体。这些抗体与壳聚糖包被的四氧化铁纳米颗粒结合。与其他纳米探针相比，本研究设计的含有两种抗体的纳米探针对淋巴管检测更准确，因此分离出的淋巴管内皮细胞更纯净。

在这项研究中，为了快速富集和分离人类癌细胞中的 LECs，使用对抗 LYVE-1 抗体和抗 podplanin 抗体具有较高特异性的配体促进与壳聚糖包被的超顺磁性纳米粒子的结合，以制备磁性用于选择 LEC 的珠子。也验证了该探针能够对实体瘤进行双峰诊断。

材料和方法

细胞系和细胞培养条件

结肠癌细胞系 (HT29) 购自 ATCC 细胞库，在含有 10% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA) 中于 37°C 培养。 Gibco, Grand Island, NY, USA)、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，5% CO2 下。

实验动物模型

40 只 NOD/SCID 雌性小鼠（4-6 周龄）购自北京维塔尔河实验动物技术公司（中国北京）。以对数期生长的 HT29 细胞用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤 3 次。用胰蛋白酶消化后，将细胞以 1000 rpm 离心 5 分钟。然后将细胞重悬于PBS中，将细胞浓度调整为2 × 10 ⁷ /毫升。每只小鼠注射 200 μL 细胞悬液。所有实验方案均经广西医科大学（中国广西）动物伦理委员会批准。

Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米探针的制备和表征

壳聚糖（西安瑞熙生物科技有限公司）用α-酮戊二酸羧化得到表面富含CO-基团的α-酮戊二酸羧甲基壳聚糖（KCTS）[19]。 Fe3O4（西安瑞熙生物科技）为核心，KCTS为基本骨架结构。用碳二亚胺活化 Fe3O4 纳米粒子后，通过 KCTS-COOH 和表面-OH 的共价键结合形成 Fe3O4@KCTS。所选的 LEC 抗体特异性针对人 LYVE-1 APC 偶联抗体（R&D Systems®，货号 FAB20892A）和抗足蛋白抗体 (FITC)（Abcam，货号 ab205333）。这些抗体使用活化的 EDC/NHS 与羧化 Fe3O4@KCTS 共价交联。因此，获得了用 LECs 双抗体修饰的磁性纳米探针，称为 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米探针 (0.1 mg/mL)。双抗体偶联的纳米颗粒在4°C下避光保存。

使用透射电子显微镜（TEM；H-7650，日本）评估制备的 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米粒子的形态和尺寸分布。 Fe3O4@KCTS-Double 抗体的粒径 (Size)、Zeta 电位和粒子分散指数 (PDI) 使用动态光散射法 (DLS; PRO3000, Japan) 测量，其光致发光使用荧光分光光度计 (FL -7000，美国珀金埃尔默）。

免疫组织化学和免疫荧光

制备冷冻组织切片并放入冰丙酮中 10 分钟，然后浸入 PBS 溶液中 10 分钟。在 1% BSA 中封闭并用 PBS 洗涤 3 次后，将切片与人 LYVE-1 APC 偶联抗体和抗足蛋白抗体 (FITC) 在 4°C 下孵育 30 分钟。孵育后，将切片在PBS溶液中浸泡3次，然后在肿瘤组织中加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液以完全覆盖组织。将切片在室温下再次温育 5 分钟。然后用PBS洗涤3次，待切片完全干燥后加入抗荧光猝灭剂。最后，将切片固定在盖玻片上，在共聚焦显微镜（Nikon DS-Ri1；Nikon，Tokyo，Japan）下观察。

保存在福尔马林中的结肠癌组织被石蜡包埋用于本研究。 HT29 癌症异种移植物的脱蜡切片用 3% 过氧化氢封闭，在 5% 正常血清中封闭，并与抗 LYVE-1 抗体（Abcam，ab10278，英国）在 4°C 下孵育过夜。接下来，将生物素标记的二抗山羊抗兔 IgG H&L (HRP) (ab205718) 在辣根过氧化物酶偶联的超级链霉亲和素标记试剂中孵育 30 分钟。颜色用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液测定。

细胞纯化

肿瘤的平均体积约为 1.5 × 1 × 1 cm ³ .在去除肿瘤之前，将小鼠浸泡在 75% 乙醇中 3-5 分钟进行消毒。在干净的工作台上用无菌剪刀和无菌镊子切割消毒的小鼠皮肤。小心切除肿瘤组织并置于含有 PBS 的培养皿中。然后用眼科剪刀剪下浸湿的肿瘤组织并置于无菌盘中。使用巴氏消毒管将切碎的组织移液到 50 mL 离心管中。然后将三倍体积的胶原酶 I 加入管中，涡旋 10 分钟以获得胶原酶 I-肿瘤组织混合物。然后将混合物置于 37°C 水浴中 20 分钟，并重复五次。消化结束时，加入完全培养基停止胶原酶 I，让混合物静置 2 分钟。以 300 g 离心 10 分钟后，将肿瘤用 PBS 洗涤两次，然后重新悬浮在 10 mL PBS 中，并通过孔径为 75 μm（200 目）的筛子缓慢过滤。对过滤的细胞进行计数，平均放入两个 15 mL 离心管中，重新悬浮在 PBS 中，然后以 300 g 离心 10 分钟，然后洗涤 3 次。 (1) MACS 磁珠分选法：洗涤后的细胞重悬于 100 μL 缓冲液中。含有 PBS pH 7.2、0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的溶液是通过使用自动 MACS™ 冲洗液（货号 130）将 MACS BSA 储备液（货号 130-091-376）稀释至 1:20 来制备的-091-222）。接下来，加入 10 μL 人 LYVE-1 APC 偶联抗体，然后在 4°C 下避光孵育 15 分钟。最后，用 2 mL 缓冲溶液洗涤 3 次。离心后加入80 μL缓冲液重悬细胞，加入20 μL抗APC荧光素磁珠溶液。将混合物孵育 15 分钟，洗涤 3 次，然后离心，并与 300 μL 缓冲溶液充分混合。最后，柱中的阳性细胞被 3 mL 缓冲溶液迅速击倒。所得细胞在六孔板中培养。 (2) Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米颗粒分选法：洗涤后的细胞重悬于200μL缓冲液中，与Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米颗粒混合，4℃孵育20分钟黑暗，然后用 4 mL 缓冲液洗涤 3 次，离心，并重新悬浮在 160 μL 缓冲液中。最后，用磁铁洗脱细胞，在6孔板中培养。

不同方法分选细胞的免疫荧光

将不同分选方法分选的细胞调整至细胞浓度为5 × 10 ⁴ /mL 用 PBS，均匀铺在 12 孔板中。将一毫升细胞悬液加入每个孔中，然后在 5% CO2 环境中在 37°C 下培养 24 小时。然后弃去旧培养基，用PBS溶液洗涤细胞3次。然后，在每孔中加入 200 μL 4% 多聚甲醛，并将细胞在室温下放置 10 分钟。然后用PBS溶液洗涤细胞3次，加入人LYVE-1 APC偶联抗体和抗podoplanin抗体(FITC)。 4°C 避光孵育 2 小时后，洗涤细胞 3 次。此外，每孔加入 50 μL DAPI，室温孵育 10 分钟，将细胞核染成蓝色，然后用 PBS 洗涤 3 次。最后将抗荧光猝灭剂滴在载玻片中央，将细胞覆盖的一侧置于载玻片上，用激光扫描共聚焦显微镜观察。

不同方法分选细胞的流式细胞术

通过不同方法分选的细胞在 200 μL 结合缓冲液（10 mM HEPES/NaOH pH 7.4、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl）中用人 LYVE-1 APC 偶联抗体和抗足蛋白抗体 (FITC) 抗体重悬，并在 4°C 下避光孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤 3 次。用流式细胞术（BD Accury6；Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）检测和分析细胞，然后用FlowJo软件（Tree Star Inc.，Ashland，OR，USA）分析。

检测 LEC 活动

收集、消化和计数通过不同方法分选的对数生长期细胞。细胞浓度调整为2 × 10 ⁵ 将这些细胞的 50 μL 和 50 μL 添加到 Matrigel 包被的 μ 载玻片的每个孔中，并在 5% CO2 培养箱中在 37°C 下培养 6 小时。分离培养基并用巴氏消毒的滴管丢弃，然后加入含有 1 μg/mL 钙黄绿素 AM（Invitrogen，目录号 c3099）的 PBS 溶液。然后将细胞在室温下避光孵育 1 小时，用 PBS 洗涤，并在显微镜（尼康，日本）下拍照。此后，1 × 10 ⁵ 将细胞与含有 20 μg/mL DiI-ac-LDL（Molecular Probes，Invitrogen）的 500 μL 完全培养基混合，然后接种在 24 孔板中，37°C 培养 4 小时。去除旧的培养液，用 PBS 洗涤细胞 3 次。然后，将 50 μL DAPI 溶液添加到每个孔中，并在室温下孵育 10 分钟以将细胞核染成蓝色。用PBS洗涤3次后，最终在显微镜下成像。

体内磁共振和荧光成像

按照以下步骤确定Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米粒子在动物体内是否靶向肿瘤。结肠癌的 NOD/SCID 小鼠皮下异种移植模型用于磁共振或荧光扫描。使用 3.0T MRI 扫描仪（Discovery 750，gE，德国）在特定条件下进行 T2 加权成像，包括视野（80 × 80 毫米）、回波时间（69 毫秒）和层厚（2.0 毫米） ，具有 40 毫米直径的鼠标音量线圈。 NOD/SCID 小鼠分为两组（n =3);实验组和受体阻断组。所有小鼠均通过尾静脉注射 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体 (0.5 mmol/kg) 磁性纳米颗粒。在四个特定时间点对每只小鼠进行扫描：注射前、注射后 0.5 小时、12 小时和 24 小时。在受体阻断组中，每只小鼠注射抗LYVE-1抗体（Abcam，ab10278，UK）和抗podoplanin抗体（Abcam，ab10288，UK），然后注射Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体。 MRI 扫描在相同的四个时间点进行。使用小动物体内成像系统（Bruker，USA）拍摄荧光图像。分组、注药、扫描时间点同上。

Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米探针的毒性

Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米探针对LECs的毒性通过CCK-8测定进行评估。细胞（100 μL 培养基，2 × 10 ⁵ /mL) 在 96 孔板中于 37°C 在含有 5% CO2 的人源化气氛中培养过夜，然后用 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米探针（0.1、0.5、1.0、2.0 mg/mL）处理 24 ，或在相同条件下 48 小时。孵育后，向每个孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，然后再孵育 2 小时。通过ELISA酶标仪（Thermo Scientific，USA）在450 nm处测量光密度（OD）。

为了评估 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米探针在体内的毒性，NOD/SCID 雌性小鼠接受单次尾静脉注射 200 μL PBS（对照组）或 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米探针（2毫克/毫升) (n =每组 3 只动物）。 1 周后，处死小鼠，取主要组织（心、肺、肝、脾、肾）切片，浸入 10% 甲醛溶液中，脱水，石蜡包埋。切割石蜡切片（4 μm 厚）并用苏木精-伊红染色。

日期分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以x ± s表示，组间比较采用方差分析，计数资料比较采用卡方检验。 P <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

用于检测人类癌症的双靶向磁性纳米粒子的原理

在本研究中，如方案 1 所示，Fe3O4@KCTS 是一种核壳型磁性纳米粒子，通过用碳二亚胺活化 Fe3O4 并将其与 α-酮戊二酸壳聚糖 (KCTS) 交联来制备。然后将 LYVE-1 和 podoplanin 抗体添加到这些磁性纳米粒子的表面，从而形成双靶向磁性纳米探针。这些探针通过尾静脉注射到小鼠模型中，通过 T2 加权 MR 成像和荧光成像诊断肿瘤。切除肿瘤后，将肿瘤捣碎成单个细胞，然后与探针孵育，通过磁铁识别纯度更高的淋巴细胞内皮细胞，探索肿瘤转移的机制。结果表明，成功开发了一种从肿瘤组织中提供高纯度LEC的双靶向磁性纳米探针，为LEC在大肠癌中的临床应用以及大肠癌双模成像的早期临床诊断提供了基础。

Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米颗粒示意图

Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米颗粒的表征

TEM 图像（图 1a）显示裸露的 Fe3O4 呈不规则球形，颗粒之间有团聚体。 Fe3O4经KCTS改性后（图1b），颗粒呈规则的球形或椭圆形，颗粒分布均匀。如图 1c 所示，Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米粒子在 Fe3O4@KCTS 表面被带负电荷的抗体修饰，赋予负电荷，从而增加了纳米粒子之间的静电斥力。 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米颗粒呈球形、均匀、无颗粒聚集、无损伤。平均直径为 91.28 ± 2.31 nm，PDI 为 0.207 ± 0.015（图 1d）。该图显示纳米颗粒的尺寸分布较窄并且在水中表现出良好的分散性。带负电表面的zeta电位为- 32.8 ± 1.51 mV，绝对值超过- 30，表明材料具有良好的稳定性（图1e）。

磁性纳米探针的表征。 一 Fe3O4 纳米探针的透射电子显微照片（比例尺，100 nm）。 b Fe3O4@KCTS 纳米探针的透射电子显微照片（比例尺，100 nm）。 c Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米探针的透射电子显微照片（比例尺，100 nm）。 d 通过粒径分析检测粒径，探针平均粒径为91.28 nm。 e Zeta 电位约为 - 32.8 mv。 f Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体纳米探针在488和545的激发光下具有发射峰

荧光光谱仪的结果如图 1f 所示。在 488 度激发光下的抗足蛋白抗体 (FITC) 和 545 度激发光下的抗 LYVE-1 抗体 (APC) 中观察到明显的发射峰。 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体复合物在488和545激发下出现发射峰表明材料偶联成功。

免疫组织化学和免疫荧光

如图 2a、b 所示，观察到 LYVE-1 在结肠癌组织中的表达以及 LYVE-1 和 podoplanin 抗体在冷冻肿瘤组织中的表达。这说明结肠癌组织中存在少量淋巴管内皮细胞。

淋巴管在结直肠癌组织中的表达。 一 通过免疫组织化学（比例尺，100 μm），组织切片中扩张的血管内皮细胞膜上的 LYVE-1 呈阳性。右边是放大图。 b 免疫荧光显示，组织切片中扩张的血管内皮细胞膜上的 LYVE-1 和 podoplanin 呈阳性（比例尺，50 μm）

LEC 的分离和富集

对通过两种不同分选方法获得的细胞进行免疫荧光染色。发现通过LYVE-1 MicroBeads磁珠分选的细胞表达蛋白LYVE-1，但不表达podoplanin，而通过Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米颗粒获得的细胞表达蛋白LYVE-1和蛋白podoplanin（图3）。 3a)。此外，分析了不同方法分选的细胞的流式细胞术结果。如图 3b 所示，LYVE-1 MicroBeads 磁珠共表达蛋白 LYVE-1 和蛋白 podoplanin 为 71.2%，而通过 Fe3O4@KCTS-LECs 分选得到的两种标记共表达率-双抗体磁性纳米粒子为88.9%。两个独立样本t 检验表明，两组间差异有统计学意义（P <0.05)（图 3c）。

淋巴管内皮细胞纯度分析。 一 使用 LYVE-1 微珠和 Fe3O4 分选的分离的人类结直肠癌 LEC 中 LYVE-1（红色）和足蛋白（绿色）/细胞核 [4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）的双色荧光显微成像@KCTS-LECs-双抗体（比例尺，100 μm）。 b 流式细胞仪检测显示 LYVE-1 (APC) 和 podoplanin (FITC) 的共表达。 c 流式细胞术结果，*P <0.05

两种不同排序方法获得的LEC的生物学功能比较

我们进一步比较了通过两种不同分选方法获得的淋巴管内皮细胞的生物学特性。基质胶胶管测试结果如图 4a 所示。 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米粒子分选得到的细胞具有较强的成管能力。图4b所示的Dil-ac-LDL内皮细胞摄取测定结果表明，LYVE-1 MicroBeads磁珠分选的细胞中观察到红色荧光，而Fe3O4@KCTS分选的细胞中观察到更强的红色荧光-LECs-双抗体磁性纳米粒子。这些结果表明，Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米粒子获得的细胞纯度更高，成管能力更强，内皮细胞吞噬能力更强，更适合于肿瘤淋巴管内皮细胞的研究。 <图片>

LECs生物学功能的比较。 一 Calcein AM（绿色）体外（比例尺，50 μm）测定体外 LEC 管形成能力。 b 使用 LYVE-1 微珠和 Fe3O4@KCTS-LEC-双抗体（比例尺，100 μm）分离的 LEC 对内皮细胞功能的内皮细胞吞噬测定（DiI 标记，红色；DAPI，蓝色）

体内双峰成像分析

体内成像的结果如图 5a 所示。发现注射Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米粒子前肿瘤无荧光。注射后，来自肿瘤的荧光增加，在 12 小时达到峰值。此后，荧光随时间逐渐减弱。在对照组中，整个实验过程中几乎没有来自肿瘤的荧光。 24小时后，观察到材料已从两组小鼠体内完全代谢掉。同样，图 5b 所示的磁共振成像显示肿瘤成像逐渐减弱，12 小时后达到最弱水平，然后随着时间的推移逐渐恢复。而对照组的肿瘤成像能力几乎没有变化。可以推断Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米粒子在体内具有较高的肿瘤靶向性。

NOD/SCID 小鼠结直肠癌皮下移植瘤模型的荧光成像和 MRI。 一 NOD/SCID 小鼠在注射前和注射后 0.5 小时、12 小时和 24 小时被麻醉并用荧光成像系统成像。 b 在注射前和注射后 0.5 小时、12 小时和 24 小时，NOD/SCID 小鼠被麻醉并用 3.0T MRI 扫描仪成像

磁性纳米粒子的体外和体内毒性

在通过 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米粒子分选的 LECs 中评估磁性纳米探针的体外细胞毒性。 CCK-8 测定结果表明，在与不同浓度的磁性纳米探针孵育后，细胞的活力很高（图 6a）。这表明 Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米粒子具有最小的细胞毒性。我们进一步评估了磁性纳米粒子在体内的毒性。用磁性纳米探针处理雌性 NOD/SCID 小鼠，然后检查用苏木精-伊红染色后主要器官的组织切片。如图 6b 所示，未观察到明显的坏死或炎症迹象。这些结果表明磁性纳米探针在体内不会产生毒性作用。这些结果表明，本研究设计的磁性纳米探针适合作为检测探针用于动物和人类研究。

Fe3O4@KCTS-LECs-双抗体磁性纳米探针的毒性。 一 LEC 与不同浓度的磁性纳米探针一起孵育，并在 24 小时和 48 小时测量细胞活力。 b NOD/SCID 小鼠用 PBS 或磁性纳米探针处理，主要器官切片用苏木精-伊红染色并通过光学显微镜检查（比例尺，100 μm）

讨论

人们早就知道，通过淋巴系统的运输是肿瘤细胞增殖的重要途径。然而，与血管中的血管内皮细胞（BECs）相比，LECs作为淋巴管的主要成分，尚未得到充分研究。 Identification of LECs markers will promote investigations on LECs and make it easier to distinguish them from BECs. LYVE-1 is a type I intact transmembrane glycoprotein receptor composed of 322 amino acid residues [20, 21], and it is presently considered to be the most specific lymphatic endothelial cells marker [22, 23]. Podoplanin is a type I transmembrane salivary mucin-like glycoprotein with a molecular weight of 38 kDa. Current research shows that podoplanin can distinguish lymphatic vessels and blood vessels very well [24, 25]. Therefore, it can be combined with other lymphatic markers to identify LECs. In this study, two antibodies were used to sort LECs, and the purity of the sorted cells was verified by immunofluorescence co-localization, flow double staining, and co-expression. The cells sorted by Fe3O4@KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles displayed similar biological characteristics with LECs, and had stronger tube-forming ability and better phagocytic ability.

Recently, immunomagnetic-based purification methods have been used to separate different cells from mixed cultures, while magnetic beads coated with LYVE-1 or podoplanin antibodies have been used to separate specific subpopulations from crude cells populations [10, 26]. These methods only purify the target subgroups from mixed cultures. It is likely that this not only leads to incomplete isolation of LECs, but also causes contamination of heterogeneous cells such as vascular endothelial cells. Furthermore, these methods are time-consuming and are costly. Previously, several specific lymphoid markers were reported, e.g., LECs were isolated from different tissues primarily by the means of collagenase treatment. However, during primary culture, collagenase treatment may produce a mixture of cells, including vascular endothelial cells and interstitial cells.

In this study, the Fe3O4@KCTS-LECs-diabody magnetic nano-double targeting probe was constructed using chitosan-coated ferroferric oxide which binds to highly specific target molecules LYVE-1 and podoplanin expressed on lymphatic endothelial cells. The electron microscope analysis showed that the probe had uniform appearance and good dispersibility. Zeta potential reflects the stability of a molecular probe. Highly positive or negative zeta potential values reflect high stability and low capacity to aggregate. It is generally believed that molecules with zeta potential greater than + 30 mV or less than − 30 mV have good stability. In this experiment, the probe had a zeta potential of − 32.8 ± 1.51 mV, which indicates that the probe had good stability.

Fe3O4 is a magnetic nanoparticle oxide which has been widely used in modern medicine and biology because of its unique physical properties. It is particularly used in diagnosis systems based on magnetic resonance imaging and magnetic hyperthermia as well as in cell separation applications. The contrast agents used in MR imaging can be divided into paramagnetic iron oxide nanoparticles (T2-negative contrast agent) and Gd compounds (T1-positive contrast agent). Fe3O4 nanoparticle resonance contrast agent is considered to be a R2-weighted, and its performance is often affected by some factors, such as (a) composition, (b) NP size, (c) surface coating, and (d) synergistic magnetic effect produced by multiple superparamagnetic Fe3O4 NP centers in a small volume [27]. In addition, it can be used in sorting of target cells under the magnetic field effect, that is, after the target cells are combined with specific probes, the target cells are sorted by magnet adsorption. For example, the lymphatic endothelial cells sorted using the probe designed in this study had better tube forming ability and endothelial cell phagocytosis. The relaxation parameter R1 or R2 is typically used to measure the quality of the MRI contrast agent, which describes the ability of the contrast agent T1 or T2 relaxation time [28]. The current NP-based T1 contrast agents are associated with cell toxicity, generating the need for better alternatives. Fe3O4 provides good biocompatibility compared to the above-described cerium-based materials [29]. In this study, we studied the in vitro and in vivo toxicity of the nano-probes modified by chitosan on the surface of Fe3O4. Our results showed that the probe was suitable for sorting of specific cells, and had low toxicity. It is therefore an ideal material that can be used for culturing of the sorted cells and further research on tumor metastasis through lymphatic vessels.

Here, specific target molecules such as peptides, antibodies, aptamers, etc. were attached to the surface of magnetic nanomaterials, thereby facilitating tumor diagnosis and treatment [30, 31]. This study successfully constructed the Fe3O4@KCTS-LECs-double antibody magnetic nano-double targeting probe. This probe could bind to specific target molecules, and hence can be used to separate lymphatic endothelial cells and MR/fluorescence imaging.

Conclusions

In summary, a dual targeting magnetic nanoparticle that can detect human cancer is presented in this study. The magnetic nanoparticle probe displays high biosafety and stability. The probe could bind to specific target molecules, thereby enabling sorting of lymphatic endothelial cells. The double antibody coating customized by incorporating self-made magnetic beads produced enabled separation of pure LECs, which reduced sorting time, improved cell activity, and reduced cost. These findings indicate that the magnetic nanoprobe designed in this study is suitable for application as a detection probe in animal and human investigations. This study provides a platform for studying the mechanisms of lymphatic metastasis and role of lymphatic endothelial cells in tumors. Moreover, the Fe3O4@KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles can be applied in fluorescence/MR molecular imaging in vivo, enabling clinical diagnosis of cancer.

缩写

DAPI：

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DMEM：

Dulbecco’s modified Eagle medium

EDC：

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

FBS：

Containing no fetal bovine serum

Fe3O4 :

Magnetic ferroferric oxide

HT29:

Human colon cancer cell

KCT:

α-Ketoglutarate carboxymethyl chitosan

LECs:

Lymphatic endothelial cells

LYVE-1:

Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1

MR:

Magnetic resonance

NHS：

N-hydroxysuccinimide

T2:

Transverse (spin-spin) relaxation time

TEM：

透射电子显微镜

VEGFR-3:

Vascular endothelial growth factor receptor 3