HER2 靶向磁性纳米敏化剂增强 HER2 阳性癌症的体内 MRI 成像

摘要

本研究旨在开发一种针对人表皮生长因子受体 2（HER2）的高磁敏感性磁共振成像（MRI）造影剂。通过将 5'-巯基修饰的抗 HER2 核酸适配体与马来酰亚胺化磁性纳米晶（MNCs）偶联，制备了抗 HER2 适配体修饰的磁性纳米敏化剂（Apt_HER2-MNS）。经理化表征与靶向能力验证，Apt_HER2-MNS 对 HER2 蛋白的结合亲和力（K_d）为 0.57 ± 0.26 nM。在 HER2 阳性癌细胞（NIH3T6.7）异种移植小鼠模型（n=3）中，于 3T 临床 MRI 仪上验证了体内造影增强能力，对照实验使用未修饰 MNCs。结果显示，注射 Apt_HER2-MNS 后，小鼠肿瘤区 T2 加权 MR 图像信号增强高达 150%。

研究背景

人表皮生长因子受体 2（HER2）属于 EGFR 家族，在人类恶性肿瘤中扮演关键角色，约 30% 乳腺癌及许多胃、膀胱、卵巢、肺癌中过表达。HER2 过表达患者生存率显著降低，且导致乳腺癌转移增加。因此 HER2 是癌症诊断的重要生物标志物。临床上 HER2 与雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）并用于乳腺癌确诊，但组织学验证具有侵入性且仅限少数病灶。为此，各类研究致力于通过 CT、PET、SPECT、MRI 及多模态成像无创可视化诊断标志物。

氧化铁纳米颗粒（IONPs）用于无创放射学检测临床相关生物标志物。IONPs 磁敏感性和生物相容性优于钆基（GBCAs）、镍/钴基造影剂。商业化 MRI 造影剂和 GBCAs 因 Gd³⁺ 释放存在体内毒性问题，而 IONP 基造影剂可降解为铁并被吸收或清除，体内安全性更高。

将 IONPs 用于分子成像需靶向配体，可为化学物、糖类、蛋白、抗体或适配体。适配体为单链核酸稳定三维结构，对特定分子具高结合亲和力与特异性。其高亲和力源于系统化配体指数富集（SELEX）技术：利用化学合成的超大随机寡核苷酸文库（~10¹⁵）并行筛选高亲和力适配体。SELEX 筛选出的适配体亲和力通常达皮摩尔级，远优于其他生物分子的微摩尔至亚纳摩尔级。第三代适配体经核酸修饰具备抗 DNase/RNase 降解的体内外稳定性。因此适配体成为分子成像研究首选配体。

本研究目标是开发基于高磁敏感性磁性纳米晶（MNCs）的适配体修饰 T2 造影剂，特异性靶向 HER2 过表达癌细胞。采用热分解法制备 MNCs，选用 HER2 特异性适配体（K_d=0.42 nM）。合成造影剂经形貌、磁化性能、磁弛豫率表征，并在 HER2 表达癌细胞系移植瘤动物模型中开展体外/体内靶向实验。

实验方法

材料

TWEEN® 80 (T80)、4-(二甲氨基)吡啶、N,N'-二环己基碳二亚胺、三乙胺、无水二氯甲烷、乙酰乙酸铁(III)、1,2-十六烷二醇、十二烷酸、十二烷胺、苄基醚购自 Sigma-Aldrich（美国）；3-马来酰基丙酸（MPA）购自 TCI America（美国）。RPMI-1640、DMEM、胎牛血清、Gibco® 抗生素-抗真菌溶液购自 Life Technologies（美国）。NIH3T6.7 细胞株购自 American Tissue Type Culture（美国）。DEPC 处理水购自 Biosesang Inc.（韩国）。巯基修饰抗 HER2 适配体 [Apt_HER2，序列：5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3' (6: NapdU)，5'-SH 修饰，40-mer] 购自 Aptamer Science Inc.（韩国）。

MNCs 合成

采用 Sun 热分解法合成单分散磁性氧化铁纳米颗粒。因前驱体为乙酰乙酸铁(III) 和油酸，称产物为 MNCs。简述：三口烧瓶中混合乙酰乙酸铁(III) (2 mmol)、油酸 (6 mmol)、1-十八烯 (6 mmol)、1,2-十六烷二醇 (10 mmol)、苄基醚 (20 mL) 机械搅拌。100 °C 预热 30 min 除氧脱水，升温至 200 °C 反应 2 h，再在氮气流中 300 °C 回流 30 min。冷却后用无水乙醇沉淀纯化，离心三次分离产物。Fe₃O₄ 纳米颗粒重悬于 5 mL 正己烷。用 100 mg Fe₃O₄ 及前驱体重复上述步骤得最终产物。HR-TEM (JEM-2100) 观察形貌，振动样品磁强计 (VSM, MODEL-7300) 测室温饱和磁化强度，热重分析仪 (SDT-Q600) 称量 Fe₃O₄ 含量，反复洗涤至 Fe₃O₄ 含量约 80%。

马来酰亚胺基 TWEEN® 80 合成

制备马来酰亚胺基 T80 (Tm80)：15.3 mmol MPA 与 22.9 mmol N,N'-二环己基碳二亚胺分别溶于 10 mL 二氯甲烷后混合，加入含 7.6 mmol T80 的 20 mL 二氯甲烷，再加 3.2 mL 三乙胺，最后溶解 22.9 mmol 4-(二甲氨基)吡啶于 10 mL 二氯甲烷，所有试剂在 70 mL 瓶中混合，磁力搅拌 48 h。混合物颜色由杏黄转酒红。过滤除去结晶脲，旋转蒸发除二氯甲烷，产物悬浮于去离子水，透析 (Spectra/Por®, 1 kDa MWCO) 除未反应试剂，冻干得最终产物。通过 UV-Vis、FT-IR、¹H-NMR 与 MPA、T80 对比确认结构（见附件 1：Figure S1）。

马来酰亚胺基 MNCs 制备

水分散马来酰亚胺基 MNCs (mWMNCs) 采用纳米乳液法制备。100 mg Tm80 溶于 20 mL 去离子水，含 20 mg MNCs 的 4 mL 正己烷在超声 (190 W) 和搅拌 (1200 rpm) 下快速注入，冰浴乳化 10 min。室温蒸发残留有机溶剂 12 h，透析 (3.5 kDa MWCO) 3 天除去多余表面活性剂。mWMNCs 用离心浓缩管 (NMWL 3000) 浓缩至 1.25 mg_Fe/mL（DEPC 水）。同法制备 T80 包裹 MNCs (WMNCs)。

Apt_HER2-MNS 制备

偶联前先还原巯基适配体：1 nmol 适配体溶于 0.3 mL 水，加入乙酸三乙胺和 1,4-二硫苏糖醇终浓度分别 50 和 25 mM，室温振荡 1.5 h，乙醇沉淀纯化脱盐。理论计算 MNCs 分子量（见附件 1：Figure S2），设定 mWMNCs 与适配体摩尔比 1:7。100 µg (Fe) mWMNCs (45 pmol) 溶于 1 mL PBS，加 5 µg (0.35 nmol) 适配体，室温搅拌 5 min、4 °C 孵育 2 h。动态光散射仪 (ELS-Z) 分析 Apt_HER2-MNS 水动力直径分布。为确认 MRI 造影能力，用 1.5 T 临床 MRI 仪配微表面线圈 (Intera) 对不同浓度 Apt_HER2-MNS 幻像进行 CPMG 序列测 T2 弛豫率 (R2)：TR=10 s，32 个回波，回波间距 12 ms，平均 1 次，分辨率 156×156 µm，层厚 0.6 mm。R2 定义为 1/T2 (s⁻¹)。

Apt_HER2-MNS 结合亲和力测定

采用硝酸纤维素滤膜结合法验证 HER2 特异性。裸 Apt_HER2 和 Apt_HER2-MNS 用碱性磷酸酶去磷酸化，T4 多核苷酸激酶和 [³²P]-ATP 标记 5' 或 3' 端。10 pM ³²P 标记适配体与 100–10 pM HER2 蛋白在选择缓冲液 (20 mM Tris·HCl pH 7.5, 6 mM NaCl, 5 mM 2-巯基乙醇, 1 mM Na₃EDTA, 10% v/v 甘油) 中 37 °C 孵育 30 min。G-50 柱 (GE Healthcare) 除游离同位素，薄层显影，荧光成像仪 (Fuji FLA-5100) 定量结合分数。以仅含 ³²P 适配体实验校正非特异性背景结合。

体内 MRI

动物实验经 AAALAC 批准。采用同系小鼠肿瘤模型：将 NIH3T6.7 细胞 (1.0×10⁷) 植入 5 周龄雌性 BALB/c 裸鼠大腿。2 周后 MRI 评估肿瘤大小，达 ~500 mm³ 时尾静脉注射 100 µg (5 mg/kg) Apt_HER2-MNS。3.0 T 临床 MRI 仪配 8 通道人腕线圈进行 T2 加权成像：TR/TE=1054/70 ms，平均 2 次，分辨率 400×319 mm，层厚 1 mm，TSE 因子 8。对照组同法用 WMNCs。所有 T2 信号强度取每只小鼠约 5 个 ROI 平均，用 R2 (或 R2*) 即 T2 反值分析信号强度。相对信号强度变化以注射前初始值归一化，并对 ROI 内体素 R2 信号强度做直方图分析。

组织学分析

采用普鲁士蓝染色检测肿瘤组织铁离子，确认 Apt_HER2-MNS 对 HER2 阳性癌细胞的靶向。收获肿瘤组织 10% 福尔马林固定 24 h，梯度乙醇脱水、Histo-Clear® 透明后石蜡包埋。切片 (5 µm) 脱蜡水化后，普鲁士蓝工作液 (10% 铁氰化钾 + 20% 盐酸 = 1:1) 染色 1 h，核快红染核，洗片 3 次每次 30 min，封片观察 (Olympus BX51, Olyvia 软件)。

结果与讨论

Apt_HER2-MNS 设计为基于 IONPs 的单分子靶向剂，用于 MRI 分子成像 HER2 阳性肿瘤，需兼具高靶向特异性和大磁化率。为获高磁敏感性，先采用热分解和种子生长法合成单分散 Fe₃O₄ 纳米颗粒 MNCs。图 1 示制备与体内应用流程。HR-TEM 确认 MNCs 尺寸形貌（图 2a,b）。随机选取 130 个 MNCs 测得平均粒径 10.49 ± 1.74 nm，分布极窄，球形（图 2c）。VSM 测得饱和磁化强度 98.8 emu/g_Fe（图 2d）。目前临床静脉注射 T2 造影剂基于超顺磁性氧化铁 (SPIO) 或超小粒超顺磁性氧化铁 (USPIO)，饱和磁化强度 <70 emu/g_Fe。超顺磁性使 IONPs 仅在磁场中显磁性、防止聚集，是静脉造影剂必要条件。MNCs 更高饱和磁化强度有助于降低注射剂量。

为体内应用，分别用 T80 和 Tm80 通过纳米乳液法制备 WMNCs 和 mWMNCs。Tm80 及其前驱体 MPA、T80 的理化性质经吸收光谱、FT-IR、¹H-NMR 确认（见附件 1：Figure S1）。文献 [44] 证实 Tm80 纳米乳液法制得的 mWMNCs 稳定分散于水，且马来酰亚胺基易与中性 pH 巯基分子偶联且无副产物。NapdU 修饰适配体延长体内半衰期，人血清中半衰期 151 h（见附件 1：Figure S3）。Apt_HER2-MNS 由 mWMNCs 与 Apt_HER2-SH 偶联制得，经动态光散射和 MR 弛豫分析表征水动力学性质（图 3）。WMNCs 与 Apt_HER2-MNS 水动力直径分别为 28.8 ± 7.2 nm 和 34.1 ± 8.2 nm（图 3a），差异源于 ~5–10 nm 长的 40-mer 适配体。弛豫率分别为 265.7 和 257.2 mM⁻¹_Fe s⁻¹（图 3b），均 R²=0.99。FDA 批准的 SPIO/USPIO 基 T2 造影剂多为共沉淀法制备，结晶度低致弛豫率 <190 mM⁻¹_Fe s⁻¹。本研究 MNCs 使 Apt_HER2-MNS 磁弛豫率较 SPIO/USPIO 基剂提升 35–500%。

滤膜结合法评估 Apt_HER2-MNS 对 HER2 蛋白结合亲和力（图 4a），Apt_HER2-SH 与 Apt_HER2-MNS 的 K_d 分别为 26.88 ± 8.24 nM 和 0.57 ± 0.26 nM（图 4b,c）。裸 Apt_HER2-OH 对 HER2 K_d=0.42 ± 0.05 nM，比 Herceptin® (5 nM) 高 ~10 倍。但巯基修饰使 Apt_HER2-SH 亲和力下降，因巯基可与蛋白质巯基或其他巯基适配体结合。然而 Apt_HER2-MNS 亲和力恢复至接近裸适配体水平，说明无过量游离 Apt_HER2-SH 干扰，且 mWMNCs 对适配体亲和力影响极小。

利用同系小鼠肿瘤模型开展体内 MRI 评估 Apt_HER2-MNS 靶向 HER2 过表达肿瘤能力。NIH3T6.7 细胞植入大腿构建模型，注射 WMNCs 或 Apt_HER2-MNS 后从注射前至 120 min 连续 MRI（图 5，附件 1：Figure S4）。IONP 基造影剂引起质子 T2 缩短，T2 加权图表现为信号变暗。信号强度分析用 R2 或 R2* (T2 反值) 以正值比较。WMNCs 组：注射 30 min R2 信号强度峰值后逐渐下降，120 min 接近注射前状态，平均 R2 变化率 <10%，肉眼难辨 T2 加权图变化。文献 [46] 曾证实无靶向基团的 T80 包裹氧化铁纳米颗粒仍聚集于肿瘤周围，但该研究剂量 1.4 mg_Fe/只，为本研究 (0.1 mg_Fe/只, 5 mg_Fe/kg) 的 14 倍，故本实验剂量下 WMNCs 无有效造影增强。R2* 变化亦 <10% 且无统计学意义。相比之下，同剂量下 Apt_HER2-MNS 注射 120 min 使信号强度较注射前增强 130%（图 5c,d），剂量比其他适配体修饰磁性纳米颗粒造影剂研究低 2–30 倍。这表明 Apt_HER2-MNS 靶向能力优于 WMNCs 和其他适配体修饰造影剂，且有望在更低剂量下实现高造影增强。造影增强主要出现在肿瘤外周血管和中心区。外周血管注射后即变暗，肿瘤中心造影增强 60 min 首现并持续增至 120 min。

为直观展示造影增强变化，对 T2 加权图 ROI 内 R2 信号强度做直方图分析（图 5e）。T2 信号在 T2 加权图表现为负增强，故用 R2 表示。注射 Apt_HER2-MNS 后直方图中心右移，中心差值计算显示约 10% 造影增强。

普鲁士蓝染色组织学确认 Apt_HER2-MNS 在肿瘤内富集（图 5f）。染色中细胞核和浆呈深/浅粉色，肿瘤细胞周围观察到蓝色颗粒。假设若 Apt_HER2-MNS 靶向肿瘤则组织呈蓝色。结果显示 Apt_HER2-MNS 组织切片蓝点数量约为 WMNCs 组的 3 倍。普鲁士蓝可检测组织铁离子，用于确认 IONP 基造影剂在肿瘤组织的富集 [44, 49, 50]。

结论

综上，通过理化表征和 HER2 阳性小鼠肿瘤模型体内 MRI 实验，确认 Apt_HER2-MNS 作为体内 HER2 靶向 MRI 造影剂有效。其具高弛豫率和 HER2 特异性，虽给药剂量低于其他 T2 造影剂，却因氧化铁纳米颗粒展现显著造影增强效应。该造影剂有望提供癌症患者 HER2 表达信息，并可用于监测接受 HER2 靶向药物化疗的 HER2+ 癌症患者。期望本工作为 HER2 过表达癌症诊断和患者治疗提供有前景策略。