负载原卟啉 IX 的海带多糖纳米颗粒用于抗癌治疗、它们的细胞行为、ROS 检测和动物研究

介绍

光动力疗法 (PDT) [1,2,3] 是一种受光源、光敏剂和分子氧影响的成熟疗法 [4]，可产生活性氧 (ROS) 介导的 [5, 6] 直接致死性在微创性[6]、低毒的条件下，对照射区域内的癌细胞产生影响。它可以引起 DNA 损伤 [7]，激活信号通路以促进血管毒性反应，阻断肿瘤区域的血液供应 [8]，并引起免疫系统对肿瘤细胞的识别和破坏 [9]。最终的作用是克服耐药性[10, 11]并引发选择性抗肿瘤作用，导致癌细胞死亡。

目前临床上广泛采用放疗、化疗、手术等传统的肿瘤治疗方法[12]，但这些方法毒副作用大、创伤大、风险大、有一定局限性、易复发。 PDT用于广泛性癌症的治疗，包括乳腺癌[13,14,15]、肝细胞[14]、肺癌[16]、黑色素瘤[17]和皮肤[18]癌症，成为国内外研究人员关注的焦点.经验证明，在各种疾病和肿瘤的治疗中，PDT是替代化学疗法[19]和手术[20]等常规方法的更好选择，因为它具有抑制癌症转移[21]以及选择性和适应性等优点。然而，大多数光敏剂在肿瘤部位的积累有限，在癌症治疗中的应用受到限制[22]。

原卟啉 IX (Pp IX) 是一种疏水性光敏剂 [23, 24]，在诊断和 PDT 中具有巨大的潜力。 Pp IX是一种血卟啉衍生物，在没有外部刺激（如激光[25]）的情况下也能引起细胞凋亡，表明它可能具有治疗癌症的新功能[26]。

因此，在癌前病变和恶性病变中局部积累 Pp IX 是一种有趣的策略 [27]，因为其荧光提供了一种方便的肿瘤定位方法 [28]。

然而，Pp IX 存在一些缺点需要解决[29]，如溶解性差，在水溶液中容易聚集，导致疗效降低。因此，昆布多糖[30]是一种海洋纳米药物载体生物材料，作为亲水基团载体，改善光敏剂的不利特性。已经证明海带多糖具有有效的生物活性，包括抗肿瘤、抗病毒等。越来越多的证据表明[31]对不同类型的癌细胞（如乳腺癌和结肠癌细胞[32]）具有良好的体外和体内治疗效果。

刺激响应性聚合物纳米粒子，如脂质体和胶束，可以进一步确保药物递送并减少副作用。脂质体 [33] 可用作诊断和治疗工具，两性霉素 B 可掺入脂质体中以治疗真菌感染 [34]。聚合物胶束纳米粒子 [35] 是一种智能药物递送 [36]。负载 Pp IX 的血红素-海带多糖-二硫代二丙酸-MGK (HLDM) 胶束具有双重 pH/氧化还原敏感和光响应，包含用于加载 Pp IX 的疏水核以及海带多糖亲水壳。它们已成为改善光敏剂不利特征（如药物生物分布、不良反应和载药释放 [38, 39]）的最重要的纳米药物递送之一。

对此，我们因此设计了一种基于海带多糖的多功能药物递送纳米平台 [40] 以响应 pH [41] 和氧化还原特性 [42]，它可以保持在水中的溶解度并淬灭人体血液循环中的 Pp IX，同时去淬灭目标位点的 Pp IX [43]。内部和外部刺激响应类型的药物递送受到广泛关注，例如温度[44]、超声[45]、pH和氧化还原。已经研究了一种热敏系统来控制药物输送，显示出更好的药物输送潜力 [46]。刺激响应型给药系统促进了药物的持续按需释放 [47] 不可逆和快速分布。

在这项研究中，制备了负载 Pp IX 的 HLDM 胶束以克服 Pp IX [48] 的一些缺点，例如在水溶液中不稳定和聚集。我们假设从 HLDM 纳米载体自组装的 Pp IX 负载的 HLDM 胶束 [49] 应该在肿瘤微环境中积累和释放 Pp IX [50]。在 Pp IX 在肿瘤细胞中积累后，Pp IX 被刺激以促进 ROS 的产生，这可能导致癌细胞死亡（如图 1 所示）。 HLDM 材料的合成和表征已通过 1H-NMR 证明，如先前报道的 [51]。因此，在目前的工作中，研究了负载Pp IX的HLDM胶束的细胞摄取、光毒性、ROS产生、核形态观察和体内PDT效应。

基于海带多糖的纳米药物（HLDM）用于递送光敏剂用于肿瘤治疗的示意图

方法

材料

海带多糖购自 Sigma-Aldrich（中国上海）。二甲基亚砜 (DMSO) 由天津博迪有限公司提供。 l-谷胱甘肽 (GSH)、Hoechst 33342 由 Sigma-Aldrich（中国上海）提供。 Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自Science Biotechnology Co. Ltd.（山东，烟台，中国）。活性氧 (ROS) 检测试剂盒由 Beyotime Biotechnology（中国上海）提供。 H& E 购自 Bioworld Technology Co. Ltd.（中国南京）。 Pp IX 由阿拉丁试剂网（中国上海）提供。其他试剂和溶剂均为化学纯。

人乳腺癌细胞（MCF-7）由烟台大学（中国山东）药学院分子药理学实验室提供。

14-18 g（3-4周）雌性裸鼠购自北京维塔尔河实验动物技术有限公司

HLDM 材料的合成和表征

HLDM 材料是通过使用先前报告中介绍的方法合成和提供的 [51]。首先用草酰氯将二硫代丙酸活化成酰氯，再用MGK酰化得到HOOC-S-S-MGK。之后，用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)活化HOOC-S-S-MGK，然后在40°C下与海带多糖进行酯化反应。最后，我们使用 EDC/DMAP 作为催化剂通过酯化合成了 HLDM 材料。选择 DMSO-D6 和 D2O 作为溶剂来分析化合物的组成。还有 ¹ 在室温下测试并测定了 HLDM 材料的 H-NMR（Advance Bruker 400M；瑞士布鲁克公司，麦迪逊，威斯康星州，美国）光谱、红外光谱和紫外-可见吸收光谱（200-700 nm）。

制备自组装胶束（Pp IX-Loaded HLDM 胶束）

Pp IX 负载的 HLDM 胶束是通过透析方法开发的。简而言之，由MGK、二硫代二丙酸和血红素组成的疏水核以及海带多糖亲水壳可以在水中自组装形成聚胶束。在搅拌过程中将 Pp IX 加载到疏水核中以获得加载 Pp IX 的 HLDM 胶束。 HLDM 和 Pp IX 在去离子水 (MWCO 2000 Da) 中在 90-1 搅拌器中以 600 rpm 的速度在有机试剂中搅拌适当时间以溶解后透析，然后进行后续处理，以获得负载 Pp IX 的 HLDM 胶束。整个过程在室温下进行。

胶束的表征

使用贝克曼库尔特粒子分析仪（部件号：A35878）在室温下测定负载 Pp IX 的 HLDM 胶束的粒径和 zeta 电位。加载 Pp IX 的 HLDM 胶束的形态通过 H-600 透射电子显微镜（H-600 TEM；日立，东京，日本）进行可视化。为了确定负载能力，在有机试剂中用超声波装置破坏了负载 Pp IX 的 HLDM 胶束。胶束中游离 Pp IX 的浓度通过 630 nm 的紫外-可见吸收光谱测量。根据公式计算包封率（EE）和载药量（DL）。

EE (%) =（Pp IX负载HLDM胶束中Pp IX的重量/整个Pp IX的重量）×100%

DL (%) =(Pp IX负载HLDM胶束中Pp IX的重量/胶束重量)×100%

细胞培养

人乳腺癌细胞系 (MCF-7)、结肠癌细胞系 (CT-26)（图 5）和肺癌细胞系（A549）（图 5）用于测定 Pp IX 负载的 HLDM 胶束通过倒置荧光显微镜（AxioVert.A1）。已初步证明这些材料具有抗肿瘤作用。但实验表明，MCF-7 可能比其他两种癌细胞系有更多的吸收。因此，选择在含10%胎牛血清的DMEM（Hyclone）中培养的MCF-7，在37℃、含5%CO2的湿润气氛中监测疗效。

细胞摄取

分别在 24 小时后加入含有游离 Pp IX、加载 Pp IX 的海带多糖-血红素 (LH) 胶束或加载 Pp IX 的 HLDM 胶束的新鲜培养基以替换原始培养基。然后将 MCF-7 细胞培养 1 小时、2 小时和 4 小时（Pp IX 浓度：20 μg/mL）或使用以下不同浓度的 Pp IX：10 μg/mL、20 μg/mL、和 50 μg/mL 以上大气。通过倒置荧光显微镜（Eclipse E400；Nikon Corporation，Tokyo，Japan）观察细胞摄取的后果进行定性分析[52]。

细胞定位研究

在这项研究中，Pp IX 不仅是一种引发癌细胞死亡的抗癌药物，而且还是一种用于定位摄取的红色荧光探针。 MCF-7 细胞在含有游离 Pp IX、加载 Pp IX 的 LH 胶束或加载 Pp IX 的 HLDM 胶束的新鲜培养基中以 20 μg/mL 浓度高于大气培养 4 小时。用4%多聚甲醛固定后，用Hoechst 33342（10 μg/mL）代替固定液对细胞核染色15分钟。定位结果用倒置荧光显微镜观察。

活性氧种类生成的测量

使用荧光显微镜在细胞内测量活性氧 (ROS) 的产生能力，荧光显微镜使用 ROS 探针 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA)。 MCF-7 接种到六孔板中并孵育。 24 小时后，去除培养基并用含有游离 Pp IX 或 Pp IX 负载的 HLDM 胶束（20 μg/mL）的新鲜培养基替换 2 小时。细胞用 DMEM 培养基洗涤，然后照射半小时 (630 nm)。洗涤两次后，MCF-7细胞与DCFH-DA（10 μmol/L）在上述大气压下孵育30分钟，然后再次洗涤后用荧光显微镜（激发波长：488 nm，发射波长：525 nm）成像用DMEM培养基。

光毒性和活力测定

MCF-7 接种于 96 孔植物中，以检测不同剂型的细胞毒性，用于活力测定。然后在每个孔中加入新鲜的 DMEM，包括不同浓度的游离 Pp IX、加载 Pp IX 的 LH 胶束或加载 Pp IX 的 HLDM 胶束（1、2、5 和 10 μg/mL）。对于光毒性组，细胞孵育4 h吸收，进一步照射30 min，然后在上述气氛中孵育24 h。另一方面，设置孔以分析在黑暗条件下作为对照组的细胞毒性和活力。再于大气压以上接种24 h。

然后将 20 微升 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 溶液 (5 mg/mL) 和 180 μL PBS (pH 7.4) 添加到 96 孔中板并进一步孵育另外 3 小时。随后，使用 150 μL DMSO 溶解甲臜产物，并使用酶标仪 (SpectraMax M 5) 在 490 nm 处测量吸光度 (OD)。 MCF-7活力用下式表示：

活力=（（OD样品-OD黑色）/（OD对照-OD黑色））×100%。

OD样品值由药物处理细胞提供，OD对照值由无药物细胞提供，OD黑色值由无药物细胞和细胞提供。

核形态观察

MCF-7 细胞系孵育 24 小时，然后用 Pp IX 负载的 HLDM 胶束刺激 4 小时。冲洗和固定后，细胞在 37°C 下用核荧光探针染色 20 分钟，然后使用 PBS 从环境中去除染料。使用荧光显微镜观察相应的荧光图像。

体内功效和安全性评价

随后使用雌性裸鼠来研究体内装载 Pp IX 的 HLDM 胶束的抗癌可行性。 MCF-7 细胞 (1.5 × 10 ⁶ 细胞/0.1 mL)注射于雌性裸鼠的oxter作为动物模型，然后灌胃给予雌激素以促进肿瘤生长。当肿瘤体积达到约70-100 mm ³ 时，将小鼠随机分为五组 ，表示为生理盐水、游离 Pp IX (5 mg/kg)、负载 Pp IX 的 HLDM 胶束（5 mg/kg 游离 Pp IX 等价物）、游离 Pp IX（5 mg/kg）加光照射，以及加载 Pp IX 的 HLDM 胶束（5 mg/kg 的游离 Pp IX 等价物）加上光照射。光处理组在注射后 24 小时接受 630 nm 激光照射 30 分钟。通过每隔一天监测五个治疗组的肿瘤体积并在 20 天后分析组织病理学幻灯片来评估治疗效果。 5个治疗组每2天测量体重评价药物安全性[53]。

统计分析

本研究中的所有数据均记录为平均值±标准差（n =3)。此外，使用单向变异分析（ANOVA）分析了不同组之间的显着差异。在 *P < 的概率水平上，差异被认为具有统计学意义 0.05（显着），**P < 0.01（高度显着）。

结果与讨论

HLDM 材料的特征

¹ HLDM 材料的 H-NMR 光谱显示在之前的报告中 [51]。在大约 δ:0.8 处观察到 MGK 的甲基峰（图 2h）。 ¹ H-NMR 光谱显示吸收峰位于约 δ:2.8（图 2g），它是 3,3-二硫代二丙酸中的 CH2。 δ：6.5 处信号峰的出现（图 2j）证实了血红素的存在。两亲性高分子材料中海带多糖的特征峰出现在3~4 ppm区域，表明HLDM新产品合成成功。

¹ HLDM的H-NMR谱图

HLDM 的红外光谱

HLDM 材料的红外光谱显示在之前的报告中 [51]。图中的双峰证明了MCK的连接。此外，在红外光谱中观察到酯羰基的特征峰。

HLDM 的紫外可见吸收光谱

在图 3a 中，血红素具有紫外吸收波长（约 580 nm），在图 3b 中，海带多糖-二硫代二丙酸-MGK 在相同位置没有吸收。在此基础上完成了紫外-可见吸收光谱以验证血红素的联系。结果表明，在 HLDM 材料中观察到 580 nm 的特征吸收波长（图 3c）。 Hematin已成功连接到HLDM材料。

血红素的紫外-可见吸收光谱 (a ), 海带多糖-S-S-MGK (b ) 和 HLDM (c )

载有 Pp IX 的胶束的表征

加载 Pp IX 的 HLDM 胶束的大小和 zeta 电位如图 4a、b 所示。结果表明，胶束被癌细胞更好地吸收，以提高效率并减少副作用（增强的渗透性和保留效应，EPR）。胶束在图 4c 中的 Millipore 膜过滤器后肉眼可见。在此基础上，通过透射电子显微镜（TEM）扫描载有 Pp IX 的 HLDM 胶束的图片，如图 4d 所示。形态是不均匀的颗粒，这是因为超声时间不足。另一方面，图片中观察到颗粒团聚，可能是因为浓度较高（图5）。

一 , b Pp IX 负载的 HLDM 胶束的大小和 zeta 电位。 c Pp IX 负载的 HLDM 胶束在水中。 d 负载Pp IX的HLDM胶束的TEM图像

CT-26（左）和A549（右）中游离Pp IX、Pp IX负载的LH和Pp IX负载的HLDM胶束的摄取

包封率（EE）和载药量（DL）按公式计算（表1）。经过多次实验发现EE和DL的波动是不稳定的，因为我们推测负载Pp IX的HLDM胶束可能在水溶液中聚集。

细胞摄取

在这项研究中，检测 Pp IX 的荧光以研究时间和浓度依赖性。从图中可以看出，负载 Pp IX 的 HLDM 胶束被 MCF-7 细胞吸收，其荧光强度随时间和浓度而增加。通过比较图 6a 中的三个胶束，给予 Pp IX 负载的 HLDM 胶束的癌细胞具有更多的荧光。这是因为 pH/氧化还原部分与材料相关联以响应肿瘤微环境。给予游离Pp IX的癌细胞由于在DMEM中聚集而具有较弱的荧光。

一 游离 Pp IX、Pp IX 负载的 LH 和 Pp IX 负载的 HLDM 胶束的摄取。 b Pp IX负载HLDM胶束的细胞定位

综上所述，我们可以安全地得出结论，HLDM 材料，包括 pH 和还原敏感性部分，可以改善 Pp IX 的团聚并增强其在肿瘤细胞中的吸收和释放。

小区定位研究

如图6b所示，细胞核被荧光染料染色，然后我们可以看到红色荧光出现在蓝色荧光之外的现象。我们推测细胞摄取可能与细胞质有关，因此之前的研究证实了这一假设，即Pp IX已经积累并定位于肿瘤细胞的线粒体和细胞质中[54]。

活性氧种类生成的测量

如图7所示，以DCFH-DA为指示剂监测MCF-7细胞中的活性氧（ROS），在荧光显微镜下观察到其具有绿色荧光。负载Pp IX 的HLDM 胶束在光照下具有更强的绿色荧光强度，而游离的Pp IX 几乎没有荧光。我们推测游离的 Pp IX 可能会在 DMEM 中聚集而导致自淬灭效应。三组的绿色荧光在无光下可忽略不计（如对照组）。这些结果证实了Pp IX在光照条件下可以刺激氧产生作为光敏剂的ROS。

光照条件下活性氧（ROS）的生成

光毒性和活力测定

使用 MTT 测定法在两种不同的外部环境下对人乳腺 MCF-7 癌细胞进行细胞毒性和活力测定。如图 8a 所示，在黑暗下所有样品的显着细胞损伤差异可以忽略不计。当 Pp IX 浓度增加到 50 μg/mL 时，我们检测到的 MCF-7 细胞活力保持在高水平。这一现象表明，随着Pp IX浓度的增加，对细胞或器官的细胞毒性没有显着增加。

一 MCF-7 细胞在光照条件下的游离 Pp IX、Pp IX 负载的 LH 胶束或 Pp IX 负载的 HLDM 胶束的活力。 b 游离 Pp IX、加载 Pp IX 的 LH 胶束或加载 Pp IX 的 HLDM 胶束在辐照时的相对光毒性。 n =3; * 表示 P < 0.05

如图 8b 所示，5 μg/mL 的 Pp IX 在游离药物组和胶束组中具有显着差异。随着光下Pp IX的浓度增加，胶束组对细胞或器官的细胞毒性显着增强，而游离Pp IX组在浓度达到10 μg/mL时几乎没有变化。这些数据表明，负载 Pp IX 的胶束的光毒性效率明显高于游离 Pp IX。实验再次证明，游离的光敏剂可以积累产生自淬灭效应。因此，我们可以得出结论，负载Pp IX的HLDM胶束在光照射下具有杀死癌细胞的巨大潜力。

核形态观察

在细胞定位研究中，我们无意中发现染色后的细胞核出现白点，Pp IX 浓度越高，这种现象越明显。也许这是因为细胞核中的 DNA 损伤。如图 8 所示，与 MCF-7 中的相应对照相比，20 μg/mL Pp IX 负载的 HLDM 胶束可能导致 DNA 损伤。当浓度达到 50 μg/mL 时，对癌细胞的损伤会很严重。核形态观察研究表明DNA损伤是Pp IX诱导的MCF-7细胞死亡的早期标志物[26]（图9）。

Pp IX处理后MCF-7细胞的DNA损伤

体内功效和安全性评价

如图10a、b所示，测量了五组的肿瘤生长以评估体内功效。用生理盐水处理的组表现出以相对较高的速度持续增长。用游离 Pp IX 和负载 Pp IX 的 HLDM 胶束处理的组与盐水组之间没有显着差异。这些数据表明肿瘤体积受 Pp IX 的影响较小，没有照射。同时，用游离Pp IX加光处理的组产生了肿瘤体积的轻微变化。造成这种现象的原因是游离药物在体内不稳定，容易在血液中聚集。因此，它可能在到达肿瘤组织之前就被消除了。相比之下，在图 10a 中，用 Pp IX 负载的 HLDM 胶束处理的肿瘤生长被显着抑制。这一现象证明胶束在给予一定波长的光刺激后表现出显着的抗肿瘤作用。综上所述，本实验表明，在光照条件下，负载Pp IX的HLDM胶束的抗肿瘤作用有明显提高。

体内抗肿瘤活性和安全性评价。 一 肿瘤体积随治疗时间变化。 b 五组肿瘤体积：(a ) 生理盐水, (b ) 游离 Pp IX (5 mg/kg), (c ) 加载 Pp IX 的 HLDM 胶束（5 mg/kg 的游离 Pp IX 等价物），(d ) 游离 Pp IX (5 mg/kg) 加上光照射，和 (e ) 加载 Pp IX 的 HLDM 胶束（5 mg/kg 的游离 Pp IX 等价物）加上光照射。 c 荷瘤裸鼠的身体变化

另一方面，测量相对体重以评估负载 Pp IX 的 HLDM 胶束的安全性（图 10c）。各组均无明显的体重减轻和变化可忽略不计，表明这些治疗对小鼠具有良好的生物安全性。

此外，图11中生理盐水组的组织病理学切片显示出明显的核多态性。苏木精和伊红（H＆E）染色的肿瘤组织的病理变化在五组中具有显着差异。结果显示在 Pp IX 负载的 HLDM 胶束和游离 Pp IX 组中出现轻微的核凝聚。来自 Pp IX 负载的 HLDM 胶束（加光）组的肿瘤组织表现出明显的核损伤。因此，我们得出结论，这些结果与上述体内疗效和安全性评价结果一致。

不同配方的 H&E 肿瘤染色。所有数据均以平均值 ± SD 报告。 n =3; * 表示 P < 0.05

迄今为止，已经研究了多种用于药物递送的材料[55]。在之前的研究中，我们成功合成了双 pH/氧化还原敏感 [56] 海洋多糖海带多糖缀合物，在本研究中，该缀合物用作 Pp IX 的递送系统，以实现抗肿瘤作用。体内实验表明，载有 Pp IX 的 HLDM 胶束可以有效地将 Pp IX 递送到癌细胞中，并对癌细胞产生 ROS 介导的直接致死作用。细胞毒性实验表明，胶束在无光照射下具有轻微的细胞毒性，而低浓度胶束溶液在一定光照下对细胞活力有显着影响。在动物水平上，载有 Pp IX 的 HLDM 胶束发挥光毒性作用，产生相关的抗肿瘤作用。因此，负载Pp IX的HLDM胶束的活性在体外和体内得到了令人信服的证明。

Conclusions

A novel laminarin-based nanomedicine platform to address undesirable characteristics of Pp IX such as instability and astatic distribution was successfully studied in this research. The photosensitivity and phototoxicity of Pp IX-loaded HLDM micelles were detected and evaluated in vitro and in vivo. Nuclear morphological observation of Pp IX showed that the Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively deliver and accumulate Pp IX to cancer cells and cause nuclear damage. The research on phototoxicity and ROS production manifested that Pp IX-loaded HLDM micelles exhibited a relevant PDT effect, exerting anti-tumor activity with a certain wavelength light. Likewise, the in vivo research testified that the Pp IX-loaded HLDM micelles could induce PDT effect under the light condition, which could remarkably enhance the anti-tumor effect of Pp IX. To sum up, the results for in vitro and in vivo studies indicated that Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively produce PDT effect and can be applied in the future in tumor treatment in the next research. This promising laminarin-based nanomedicine platform will have great potential for becoming new drug delivery system [57] to deliver hydrophobic photosensitizer for cancer photodynamic therapy (PDT).

数据和材料的可用性

The datasets supporting the conclusions of this article are included within the article.

缩写

HLDM:

Hematin-Laminarin-Dithiodipropionic acid-MGK

LH:

Laminarin-Hematin

Pp IX:

Protoporphyrin IX

PDT:

Photodynamic therapy

ROS：

活性氧