可生物降解铁掺杂氧化锌纳米颗粒：生物铁补充的潜在载体

摘要

铁是生物体必需元素，缺铁是全球最普遍的营养障碍。开发高效安全的铁补充策略是治疗营养缺乏的关键挑战。前期体内研究证实自制氧化锌基纳米颗粒具有良好生物安全性、可降解性，口服后快速分布至多数器官组织；Caco-2细胞（胃肠道上皮模型）体外实验显示低毒性。本研究探讨掺杂Fe(III)的可降解ZnO纳米颗粒作为缺铁补充新策略。小鼠胃灌服ZnO:Fe NPs 24小时后取材，原子吸收光谱（AAS）和组织学染色（普鲁士蓝法）显示铁快速分布于铁稳态相关组织（肝、脾、心、骨骼肌、小肠）。肝细胞内及脾脏血管周围可见铁沉积，提示Fe掺杂NPs可从血液转运入组织。初步结果提示可降解ZnO:Fe NPs可作为体内外源铁的良好载体，后续需深入阐明组织铁沉积机制及纳米载体对铁代谢的影响。

引言

铁是构建生命的关键元素，参与血红蛋白/肌红蛋白运氧、线粒体呼吸链能量产生等核心生命过程。缺铁导致机能严重紊乱。WHO数据显示全球近30%人口受贫血困扰，幼童和孕妇高发。孕期缺铁增加早产、低出生体重风险；婴幼儿快速生长消耗铁储备；儿童铁水平与神经心理发育相关。哺乳仔猪因宫内供铁有限、母乳铁含量低且生长迅速，缺铁问题突出。现有补充途径（静脉、肌注、口服）各有利弊：口服虽符合生理吸收通路、受铁调素调控，但吸收差、影响肠道菌群；注射途径有毒副作用风险，且工业养猪中肌注铁右旋糖酐操作繁琐、易引发感染。

游离铁通过芬顿反应产生活性氧（ROS）引起毒副作用，生理上依靠蛋白结合防控ROS。超剂量口服或注射会淹没生理通路致ROS激增。氧化铁纳米颗粒多用作磁性造影剂，近年探索作为生物活性物质载体。纳米载体因尺寸小生物利用度高。研究显示含铁NPs在贫血大鼠中铁生物利用度优于硫酸亚铁；纳米铁安全性优于可溶性铁，不积聚肠黏膜、促进有益菌群；维生素C修饰Fe NPs可绕过胃肠道常规吸收途径，短期改善贫血指标。

材料与方法

纳米颗粒合成

采用微波水热法合成Fe掺杂ZnO NPs（ZnO:Fe NPs），工艺成熟、低成本、生物友好、可工业化放大，能引入多种功能掺杂离子。铁掺杂浓度设为5 mol%。以硝酸锌六水合物（99%）和硝酸铁九水合物（96%）为前驱体，蒸馏水溶解后用25%氨水调节pH至8。红色沉淀经抽滤洗涤，置于特氟龙容器加水至80%体积，Ertec Magnum II反应釜中4 MPa、20分钟微波水热反应。产物60°C干燥过夜。

纳米颗粒表征

SEM（Hitachi SU-70，1 nm分辨率）、光致发光（PL）和阴极发光（CL）谱、能谱（EDX）表征。PL/CL用Horiba Fluorolog-3和GATAN Mono CL3系统。动态光散射（DLS）和Zeta电位用DelsaMax Pro测定。热重分析（TGA）用NETZSCH STA 449 F1 Jupiter（氩气保护）。样品超声分散滴加碳膜铜网，沉淀2小时后测试。

体外模型

Caco-2细胞系（ECACC，Sigma 86010202）作胃肠道上皮模型。DMEM培养基含10% FBS、1% NEAA、1% PSN、0.2% NaHCO₃，37°C、5% CO₂培养。95–100%汇合后换含ZnO:Fe NPs（1.0、0.1、0.01、0.001 mg/mL）新鲜培养基，孵育24小时。

细胞活力分析

XTT法（Roche试剂盒）和台盼蓝染色法双重验证。96孔板XTT孵育4小时后470/650 nm吸光度计算活细胞比例（n=4）。6孔板台盼蓝染色经JuLi Br计数软件分析（n=3）。

动物实验

成年雄性BALB/c小鼠（n=6），标准环境适应7天。实验组（n=4）胃灌服ZnO:Fe NPs悬液（10 mg/mL，0.3 mL/只），对照组（n=2）灌等体积水。24小时后CO₂安乐死取材。一半组织-20°C冻存待AAS，另半部4%缓冲福尔马林固定、脱水包埋、切4–6 μm切片。

普鲁士蓝染色评估铁沉积

脾、肝、脑切片脱蜡水化后，等体积5%铁氰化钾和5%盐酸混合染色30分钟，核固红复染5分钟，Permount封片。Olympus BX60显微镜拍照，MicroImage v4.0分析16幅随机视场。脾脏仅分析红髓区。铁含量计算为蓝色阳性染色面积强度与细胞核面积之比。

AAS测定组织铁浓度

组织称重后65% HNO₃+30% H₂O₂消化>16小时，Ethos 900微波消解仪矿化，Perkin-Elmer AAS测定铁含量。

统计分析

数据以均值±SEM表示。普鲁士蓝数据单因素ANOVA+Tukey-Kramer事后检验；AAS组间比较用非配对t检验；体外实验单因素ANOVA+Dunnett多重比较。GraphPad InStat 3.10分析，P≤0.05显著，≤0.01高度显著，≤0.001极显著。

结果

纳米颗粒表征

SEM（图1）显示微波水热合成的ZnO:Fe纳米晶呈细长六方柱状，沿[001]方向生长，六方棱柱交界清晰，横截面50–100 nm。颗粒易团聚成更大结构（百纳米至微米级），未见除ZnO外的独立铁氧化物相，说明铁以掺杂形式存在而非单独结晶。

TGA/DSC（图2）：室温至200°C失重4.78%（表面吸附水蒸发），200–400°C失重7.36%（羟基分解），800°C前无其他失重。DSC显示118.3°C吸热峰（水蒸发）、283.1°C放热峰（羟基分解）。微小分解效应表明微波水热过程已近乎完全结晶。

室温PL谱（图3）：近带边（NBE）发射~380 nm弱，深能级发射（DLE）~600 nm极强，DLE主导提示晶体缺陷丰富。激发谱揭示带隙深能级发射机制。

CL谱（图4）：DLE/NBE强度比≈25。NBE峰~380 nm，DLE含四组分：~570 nm（氧空位）、~625/653 nm（锌空位）、~770 nm极弱。

AAS和EDX双重验证铁含量：AAS测得3.98 at.% Fe，EDX测得4.5 at.% Fe（相对锌）。

DLS/TEM粒径分布（图5）呈双峰：主峰20–100 nm (TEM) / 50–200 nm (DLS)；次峰100–500 nm (TEM) / 150–500 nm (DLS) 对应团聚颗粒。Zeta电位约-40 mV，水悬液稳定、不易团聚。

体外毒性评价

XTT和台盼蓝双法结果一致（图6、7）：仅最高两浓度（1.0、0.1 mg/mL）显著降低Caco-2活力（P≤0.01）；生理相关浓度（0.01、0.001 mg/mL）无显性毒性。IC50约1 mg/mL，提示高剂量活力下降可能因颗粒物理沉积过度应激而非化学细胞毒性。文献亦报道ZnO/Fe₃O₄ NPs对癌细胞IC50降低但对正常细胞低细胞毒性且非剂量依赖。仍需开展慢性毒性、抗氧化/ROS谱、多细胞系深入研究。

动物体内铁分布

口服ZnO:Fe NPs 24小时后，AAS（图8）显示心、骨骼肌、脾、小肠铁含量升高（无统计学差异）；骨微升；肝、脑铁含量极显著升高（P≤0.01）；肾、脂肪、肺铁含量下降。

普鲁士蓝定量（图9–11）：肝脏（P≤0.001）、脾脏红髓（P≤0.001）铁阳性面积比极显著升高；脑组织无显著增加。个体差异见图9a、10a、11a。

定性观察（图12、13）：实验组肝细胞内铁沉积（蓝色）明显增多；脾脏红髓铁积聚加重，且血管周围铁浓度升高，提示ZnO:Fe NPs可能从血流转运入组织。

讨论

缺铁是人类及哺乳动物普遍营养障碍，新型高效安全补充策略迫切需要。前期证实自制Zn基NPs口服吸收高效、快速分布主要器官、生物安全可降解且清除快。口服给药利用渗透作用高效递送，且生理上Zn/Fe吸收通路的“安全机制”降低毒性风险，避免静脉/肌注淹没生理通路导致ROS激增。NPs内化途径、动力学及细胞系统正在别项研究中，本文聚焦整体铁效应。

纳米毒性受尺寸、形状、团聚性等影响。小尺寸吸收好但高比表面积可能增加反应性细胞毒性。前人研究高剂量ZnO/Fe₃O₄ NPs未见毒性。本研究Caco-2模型显示低毒性，生理剂量安全，高剂量IC50仍高达~1 mg/mL，活力下降更可能源于物理沉积过度应激。类似现象见于ZnO/Fe₃O₄、ZnO/Pt NPs。仍需慢性毒性、ROS、抗氧化谱等深入评价。

体内结果显示ZnO:Fe NPs快速分布于铁稳态核心组织（肝、脾、心、骨骼肌、小肠）。类似研究多在贫血/缺铁模型中进行，本研究用健康小鼠，直接对比需谨慎。肝脏铁显著增加（AAS、普鲁士蓝一致），肝细胞内沉积明显，符合肝为主要铁储存库。脾脏铁升高且血管周围聚集，提示NPs经血流转运入组织，也可能源于单核吞噬系统清除。脑组织AAS显著升高但普鲁士蓝阴性，可能因纳米铁分散度高、未形成染色可检测的生理沉积团簇。前期研究已证实自制NPs可跨血脑屏障。文献中腹腔注射磁性氧化铁NPs未见脑积累，但也有研究显示脑心铁升高，机制一致。心、骨骼肌铁升高可能因血液循环丰富；小肠铁升高源于口服残留NPs。

结论

初步研究证实口服可降解ZnO:Fe NPs可将外源铁高效递送至铁储存核心组织（肝、脾等），显示作为生物体内铁载体的潜力。但铁沉积、清除机制及NPs对铁代谢影响仍需系统深入研究。

缩略语

NPs:

纳米颗粒

ZnO:Fe NPs:

铁掺杂氧化锌纳米颗粒

IG:

胃灌服

ROS:

活性氧

SEM:

扫描电镜

PL:

光致发光谱

CL:

阴极发光谱

DLS:

动态光散射

Caco-2 cells:

Caco-2细胞（白人结肠腺癌细胞）

DMEM:

Dulbecco改良Eagle培养基

FBS:

胎牛血清

NEAA:

非必需氨基酸

PSN:

青霉素-链霉素-新霉素

EDTA:

乙二胺四乙酸

AAS:

原子吸收光谱

SEM (统计):

均值标准误