树胶绿色合成金属氧化物纳米颗粒及其对衣藻的生态毒性影响

摘要

我们报道了一种可持续路线，利用天然聚合物树胶 (GK) 作为还原剂和稳定剂，在水中制备金 (Au)、铂 (Pt)、钯 (Pd)、银 (Ag) 和氧化铜 (CuO) 纳米颗粒 (NPs)。胶体经 UV–Vis、TEM、Zeta 电位和 DCS 表征，确认平均直径分别为 42 nm (Au)、12 nm (Pt)、1.5 nm (Pd)、5 nm (Ag) 和 180 nm (CuO)，负表面电荷在 4 °C 下持续六个月稳定。将绿藻 C. reinhardtii 暴露于 1–20 mg L⁻¹ NPs 中显示：Au 和 Pt 对生长抑制极小，而 Pd、Ag 和 CuO 几乎完全抑制藻类增殖，并诱导膜损伤、氧化应激、叶绿素猝灭和光系统 II 损伤。研究表明 GK 介导的绿色合成产生稳定、环境友好的纳米材料，可定制用于选择性抗菌或除藻应用。

背景

金属和金属氧化物 NPs 具有独特的电、光、磁和催化性能，推动其在工业、医药、农业和环境修复中的广泛应用 [1–4]。传统合成依赖有毒还原剂和表面活性剂，引发对人类健康和生态完整性的担忧 [5–11]。绿色化学方法——采用可再生、可生物降解的试剂和良性溶剂——提供了更安全的替代方案 [12–18]。

树胶是从 Sterculia 树提取的亲胶体，含半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和尿糖醛酸残基 [63]。毒理学研究证实其无毒性，甚至可作为食品添加剂 [62–65]。本研究利用 GK 的官能团 (–OH, –COO⁻) 还原金属盐并同时稳定生成的 NPs，实现一锅法水相合成。

尽管技术前景广阔，金属 NPs 可能产生活性氧 (ROS)、DNA 损伤和脂质过氧化，潜在破坏微生物群落和高等生物 [32–35]。先前工作显示 Ag、CuO 等 NPs 抑制藻类生长、光合作用和膜完整性 [36–49]。然而，GK 衍生的 Au、Pt、Pd 和 CuO NPs 对模式绿藻 C. reinhardtii 的毒性尚未系统考察。

方法

材料

商业 GK、AgNO₃、HAuCl₄·3H₂O、CuCl₂·2H₂O、H₂PtCl₆、K₂PdCl₄、HCl、NaOH、NH₄OH (Sigma‑Aldrich, USA)。所有试剂均为分析纯，去离子水 (DI) 用于所有制备。

树胶处理

1 g GK 分散于 1 L DI 水，过夜搅拌，20 °C 静置 18 h 去除不溶物。溶液过滤 (10–16 µm) 并冻干。

NPs 合成

Au、Pt、Pd、Ag：100 µL 10 mM 金属盐加入 10 mL GK 溶液 (50 mL 烧瓶)。调节 pH 优化 NP 产率，250 rpm、45–95 °C 振荡 1 h。颜色变化 (黄、酒红、黑) 指示 NP 形成。CuO NPs 采用胶体热法：100 µL 10 mM CuCl₂·2H₂O 与 GK 混合，CuCl₂:NaOH 摩尔比 2:5，75 °C、250 rpm 反应 1 h，离心沉淀，乙醇和 DI 水洗涤。

表征

ICP‑MS (Perkin Elmer OPTIMA 2100 DV) 定量金属含量。UV–Vis (Cintra 202) 监测等离子体峰和长期稳定性。TEM (Tecnai F 12, 15 kV) 显示形貌和尺寸分布。藻类培养基中用差速离心沉降 (DC24000UHR) 测定重量基尺寸分布；Malvern Zetasizer ZS 测 Zeta 电位。藻类培养基中离子释放经超滤 (3 kDa 截留) 后 ICP‑MS 分析。

C. reinhardtii 培养

CPCC11 株在 TAPx4 培养基中，20 °C、100 rpm、114.2 µmol m⁻² s⁻¹ 光照培养，保持指数期约 10⁶ cells mL⁻¹。

藻类暴露实验

NPs (1, 5, 10, 20 mg L⁻¹) 加入 5 mL 藻液 (50 mL 瓶)。监测生长、膜完整性 (碘化丙啶)、氧化应激 (CellROX Green)、叶绿素荧光和光系统 II 量子产率 (AquaPen‑C AP‑C 100)，时间点 1, 3, 5, 24 h。对照包括未处理藻类、热灭活细胞和孜然诱导氧化应激。重复实验，ANOVA 配合 Dunnett 检验分析 (GraphPad PRISM)。

结果

NP 形成与初级表征

TEM 图像 (图 1a–e) 显示单分散球形 NPs。UV–Vis 谱 (图 1f) 显示表面等离子体峰：Au 412 nm，Ag 525 nm；Pt、Pd、CuO 无明显峰。6 个月后光谱不变，确认稳定性。

藻类培养基中表征

重量基尺寸范围 180–5 nm (CuO > Au > Pt > Ag > Pd)。所有 NPs 在 pH 7 下带负 Zeta 电位 (表 1)。离子金属浓度：Pt、Ag、CuO 最高 (33–36 µg L⁻¹)，Au 和 Pt 最低 (6–7 µg L⁻¹)。

对藻类生长的影响

对照生长率：1×10⁶ cells h⁻¹。1 mg L⁻¹ Ag、Pd、CuO 分别降至 2.2×10⁴、1.7×10⁴、0.2×10⁴ cells h⁻¹ (P < 0.001)。高浓度下生长完全停止 (图 2)。Au 和 Pt 也减缓生长，但效应随剂量趋于平稳。

氧化应激诱导

Ag 和 CuO NPs 在 5–20 mg L⁻¹ 诱导近 100% ROS 生成 (图 3d, e)。Au 致 <10% ROS，20 mg L⁻¹ 降至 15% (P < 0.001)。Pt 5 h 内 <8% ROS；20 mg L⁻¹ 24 h 后 19% 应激细胞。Ag NPs 10–20 mg L⁻¹ 24 h 后 100% 应激。CuO 10–20 mg L⁻¹ 3 h 显著应激；5 mg L⁻¹ 5 h 后应激。Au 非生物因素 ROS 可忽略 (P > 0.05)。

膜完整性

Au 和 Pt 在 5 h 内所有时间点显著损伤膜 (P < 0.001)，但 24 h 后不显著。Ag NPs 1 h 内所有浓度损伤 100% 细胞。Pd NPs 1–5 mg L⁻¹ 损伤极小；20 mg L⁻¹ 24 h 后显著损伤。CuO 损伤随剂量和时间增加，24 h 峰值 (图 4)。

叶绿素荧光

Au 和 Pt 对 24 h 叶绿素荧光无显著影响。Ag、Pd、CuO 随剂量和时间显著降低荧光；5 mg L⁻¹ Ag 24 h 降至 22% (P < 0.001)。CuO 和 Pd 20 mg L⁻¹ 24 h 后下降最陡 (图 5)。

光系统 II 效率

Au、Pt、CuO 在部分时间点致轻微、零星量子产率 (QY) 下降。Ag NPs 1 h 后所有浓度 QY 骤降 >90%。Pd 和 CuO 仅在 20 mg L⁻¹ 显著降低 QY (图 6)。

讨论

基于 GK 的合成产生稳定、单分散 Au、Pt、Pd、Ag、CuO NPs，4 °C 下六个月保持完整。颗粒尺寸和表面化学强烈影响生物活性。Au 和 Pt 直径较大 (42、12 nm) 且离子释放低，显示极低毒性，适合生物相容性要求高的生物医学或催化应用。相反，Pd (1.5 nm)、Ag (5 nm) 和 CuO (180 nm) 对 C. reinhardtii 高毒性，与其产生 ROS、释放离子和破坏膜的已知倾向一致。Pd 的强效应值得注意；其超小尺寸可能促进细胞摄取和离子释放，解释观察到的氧化应激和叶绿素消耗。

Ag NP 毒性与文献一致：溶解的 Ag⁺ 而非纳米颗粒本身驱动除藻活性 [80–89]。我们的 GK 包覆 Ag NPs 表现出强杀菌作用，提示可作为游泳池或水处理系统的除藻剂。CuO NPs 可能通过颗粒诱导的膜破坏和 Cu²⁺ 离子释放施毒，佐证了 C. reinhardtii 和其他藻类的先前研究 [36, 47, 48]。

Au NPs 仅诱导轻微、瞬时氧化应激和可忽略的生理破坏，支持其在该藻类系统中无毒分类。Pt NPs 致轻微生长抑制和叶绿素减少，可能因离子 Pt 和颗粒遮光效应综合，但总体毒性仍低。

结论

我们成功利用树胶绿色合成 Au、Pt、Pd、Ag、CuO NPs，尺寸分别为 42、12、1.5、5、180 nm，均带负表面电荷且六个月稳定。C. reinhardtii 暴露实验显示：Au 和 Pt 基本无害，而 Pd、Ag、CuO 对生长、膜完整性、ROS 产生、叶绿素荧光和光系统 II 效率有强毒性。结果凸显 NP 理化性质决定生态风险的重要性，并展示 GK 衍生 Ag 和 CuO NPs 作为靶向除藻剂，Pd、Ag、CuO NPs 用于抗菌表面的前景，而 Au 和 Pt NPs 可视为对绿藻暴露安全的材料。