金属和金属氧化物纳米粒子的绿色合成及其对单细胞藻类莱茵衣藻的影响

背景

金属和金属氧化物纳米粒子 (NPs) 因其卓越的电、光、磁和催化性能而受到广泛的研究关注。这些使得它们在各种工业、医疗、农业和环境应用中得到广泛应用，并且还在不断开发进一步的用途 [1,2,3,4]。原始金属和金属氧化物 NP 的传统合成方法包括还原和稳定对人类和不同营养水平的其他物种有毒的化学试剂 [5,6,7,8,9,10,11]。作为回应，研究人员正在寻找替代的“绿色合成”方法，以减少或消除纳米颗粒生产过程中的有害化学物质 [12,13,14,15,16,17,18]。

许多研究报告了金属和金属氧化物 NP 的广泛应用，因为它们具有独特和广泛的物理化学性质 [19]。例如，银 (Ag) NP 广泛用于医疗、纺织、食品包装和水处理应用 [20,21,22,23]。金 (Au) NPs 已用于生物医学研究，而铂 (Pt) NPs 因其催化性能而广泛用于工业应用 [24, 25]。最后，钯 (Pd) NPs 已被用作药物制造过程中的催化剂 [26, 27] 和氧化铜 (CuO) NPs 由于其已证实的抗菌性能而用作油漆和织物中的防污剂 [28]。金属纳米颗粒可作为催化剂降解多种常见的环境污染物，包括多氯联苯 (PCB)、卤代脂肪族化合物、有机氯农药、有毒金属和卤代有机溶剂 [29]。 CuO、Ag 和 Au NPs 也用于检测有毒气体，例如一氧化碳 (CO)、氰化氢 (HCN) 和二氧化硫 (SO2) [30, 31]。最近，一些表现出局域表面等离子体共振的金属纳米粒子（金、银和铜）已被用于生物纳米传感器的开发[24]。

不幸的是，金属和金属氧化物 NPs 有可能对人类健康和一般环境产生负面影响，例如通过产生新类别的毒素，这些毒素会对微生物群落产生不利影响，对整个生态系统产生连锁反应 [32,33,34,35]。因此，NPs对微生物的影响已被广泛研究。例如，Ag NPs 已被证明可以抑制藻类生长和光合作用，从而改变叶绿素 (Chl ) 莱茵衣藻的荧光含量 [36]，改变Thalassiosira pseudonana的细胞生长 和聚球藻 sp. [37] 并影响水生植物浮肿浮萍Lemna gibba的生长和细胞活力 [38]. Książyk 等。 [39] 和 Sørensen 等人。 [40] 报道了 Pt NPs 抑制淡水微藻 Pseudokirchneriella subcapitata 的生长 [39, 40]。不出所料，Ag 和 Pd NPs 已被用作有用的抗菌剂，对抗各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌 [41,42,43]。相比之下，Au NPs 被认为不会对细菌或藻类产生负面影响 [44, 45]，尽管一项研究表明它们可能有毒，这取决于它们的电荷和表面化学 [46]。据报道，CuO NPs 对 C 有负面影响。莱茵哈特 [36, 47]，P。次资本 [48]、西部水草Elodea nuttallii [49]浮萍Lemna sp. , 大型水蚤 [48] 和斑马鱼的早期生命阶段 Danio rerio [50, 51]。

金属纳米颗粒具有可导致细胞损伤的物理和化学特性，例如通过过量产生活性氧 (ROS) 并随后对 DNA、蛋白质和脂质造成损害。在Chlorella vulgaris中检测到Ag NPs形成ROS 和 Dunaliella tertiolecta 文化和L。吉巴 [52]，以及在细菌中 [53]。 CuO和Fe NPs都能产生氢自由基，这是通过芬顿反应产生的ROS家族，可以危害多种水生和陆生生物[54, 55]。

绿色化学是一套原则或实践，鼓励设计产品和工艺以减少或消除有害物质的使用和产生 [56,57,58]。当前的绿色纳米技术实践通常涉及使用天然来源、无害溶剂、可生物降解和生物相容性材料以及在 NP 制备中的节能工艺 [59]。例如，生物聚合物，如纤维素、壳聚糖、葡聚糖或树胶，通常用作金属 NP 合成的还原剂和稳定剂 [12, 60,61,62]。本研究中使用的刺槐树胶 (GK) 是来自 Sterculia 的天然树胶 由大约 13-26% 的半乳糖和 15-30% 的鼠李糖、30-43% 的半乳糖醛酸、37% 的糖醛酸残基和大约 8% 的乙酰基组成 [63]。毒理学研究证明 GK 无毒，甚至可以作为食品添加剂使用 [62,63,64,65]。

在本研究中，我们旨在使用绿色化学方法，使用天然聚合物 GK 的水溶液制备多种金属（Ag、Au、Pt、Pd）和金属氧化物 (CuO) NP。在C上研究了这些新制备的NPs的生物学效应。莱茵哈特 使用一系列细胞反应，包括藻类生长、氧化应激、膜损伤、Chl 荧光和光合作用。 NP稳定性、大小和zeta电位在藻类生长培养基中测定，溶解性和ROS生成的非生物性测试一起测定。

方法

材料

市售 GK、硝酸银 (AgNO3)、四氯金酸氢 (HAuCl4·3H2O)、氯化铜 (CuCl2·2H2O)、氯铂酸 (H2PtCl6)、四氯钯(II) (K2PdCl4)、氯化氢 (HCl)、氢氧化钠 (NaOH) ) 和氢氧化铵 (NH4OH) 均购自美国 Sigma-Aldrich。去离子 (DI) 水用于所有实验。本研究所用化学试剂均为分析纯。

C.莱茵哈特 藻类培养物（CPCC11株）购自加拿大藻类培养中心（CPCC，生物学系，滑铁卢大学，加拿大）。

GK 处理

将 GK 粉末 (1 g) 加入含有 1 L 去离子水的玻璃烧杯中，并在磁力搅拌器上轻轻搅拌过夜。随后将胶溶液在室温 (20°C) 下放置 18 小时以分离出任何未溶解的物质。然后将胶溶液通过烧结玻璃漏斗（孔径 10-16 微米）过滤，将透明溶液冻干并储存备用。

使用 GK 合成金属和金属氧化物 NP

简而言之，将 100 μL 10 mM AgNO3、HAuCl4、H2PtCl6 和 K2PdCl4 溶液的 100 μL 等分试样添加到单独的 50 mL 锥形烧瓶中的 10 mL GK 水溶液中。通过添加 0.1 N HCl 或 0.1 N NaOH 调节胶体分散体的 pH 值，以实现 NP 形成的最大产率。为了合成 Ag、Au、Pt 和 Pd NP，在 Innova 43 定轨振荡器（美国新不伦瑞克科学公司）中以 250 rpm 在 45 到 95° 的温度范围内搅拌 AgNO3、HAuCl4、H2PtCl6 和 K2PdCl4 和 GK 混合物C 1 小时。溶液分别变为浅黄色、酒红色、深黑色和暗黑色，表明形成了 Ag、Au、Pt 和 Pd NP。在 Pt 的情况下，还原和 NP 形成发生在 pH 值为 8.0 和温度为 90°C 时，而 Pd NPs 在 pH 值 8.5 和 95°C 下形成。在 Padil 等人中查看更多信息。 [66, 67]。

CuO NPs 是使用胶体热合成工艺合成的 [13]。简而言之，将 100 μL 10 mM 二水合氯化铜 (CuCl2·2H2O) 溶液的 100 μL 等分试样与 10 mL GK 溶液（100 mg 分散在 10 mL DI 水中）和 NaOH 在单独的 50 mL 锥形瓶中混合CuCl2·2H2O和NaOH的摩尔比保持在2:5。将含有 CuCl2·2H2O 和 GK 的混合物在定轨振荡器中以 250 rpm 在 75°C 的温度搅拌 1 小时。混合物的颜色逐渐从蓝色变为黑色，表明形成了 CuO NPs。离心得到沉淀，先用乙醇洗涤，再用去离子水洗涤。

绿色合成 NP 的表征

使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，OPTIMA 2100 DV，Perkin Elmer）测量新合成的纳米颗粒中的金属浓度。

使用 Cintra 202 紫外-可见分光光度计（GBC，澳大利亚）评估金属纳米颗粒的形成和稳定性，6 个月后确定纳米颗粒的稳定性。

Ag、Au、Pt、Pd 和 CuO NP 的透射电子显微镜 (TEM) 图像是使用 Tecnai F 12 显微镜（FEI，Thermo Fisher Scientific，Oregon，USA）在 15 kV 的加速电压下运行获得的。通过将 10-20 μL GK-无机纳米颗粒分散体滴到铜网上并在室温下干燥，去除多余溶液后，制备用于 TEM 分析的样品。

藻类培养条件

莱茵衣藻 在 TAPx4 培养基（附加文件 1：表 S1，支持信息）中，在配备以 100 rpm 连续旋转的振荡器和 114.2 μmol phot m ^{- 的光照方式的培养箱（Infors，瑞士）中在 20°C 下培养2} s ⁻¹ .藻细胞以指数速率生长以获得大约 10 ⁶ 细胞/mL。

藻类暴露介质中纳米颗粒的表征

C中的NP尺寸分布。莱茵哈特 TAPx4 培养基是在 DC24000UHR 盘式离心机（CPS Instruments Inc.，USA）上使用差速离心沉降技术（DCS）测量的。在 24,000 rpm 的圆盘转速下进行测量，并使用 8-24% (w /w ) 蔗糖密度梯度。在每个样品测量之前，使用 PVC 纳米球标准 (470 nm) 校准仪器。 NPs 的特征还在于电泳迁移率，Smoluchowski 近似用于在 Zetasizer ZS（英国马尔文仪器有限公司）上确定 zeta 电位 (ZP)。每次测量都进行了 10 次运行，自相关函数为 10 秒，每个结果都是从同一样本的三次测量中获得的。

超滤方法用于测定藻类介质中金属离子的量（Cheloni 等人 [47]；Ma 等人 [68]）。将在不同时间间隔（2 和 24 小时）抽取的等分试样以 7500 rpm 离心 30 分钟以分离颗粒和聚集体。然后将上清液通过截留分子量为 3-kDa 的 Amicon Ultracel 3K 超滤过滤器（Millipore，美国）过滤，以将离子与颗粒分离。直径大于 1.3 nm 的纳米颗粒和聚集体保留在过滤器上，用 ICP-MS 分析滤液中的溶解离子 [68]。

使用荧光二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA，Sigma-Aldrich，Switzerland）测定藻类培养基中随着纳米颗粒浓度增加而产生的非生物 ROS，如早期研究 [47, 69] 所述。

纳米颗粒对藻类生长、膜完整性和氧化应激产生的影响

使用流式细胞术（FCM；BD Accuri C6 Flow Cytometer，BD Biosciences，USA）测试金属和金属氧化物纳米颗粒对藻类生长、膜完整性和氧化应激产生的影响。实验在透明小瓶（PS，50 毫升，Semadeni，瑞士）中进行，其中含有 5 毫升藻类悬浮液和浓度为 1、5、10 和 20 毫克/升的纳米颗粒。没有 NP 的对照样品平行运行。将藻细胞在沸水 (100°C) 中加热 15 分钟，以便为受损的细胞膜提供阳性对照。藻类细胞也用孜然（Sigma-Aldrich，美国），一种氧化剂，在黑暗中处理 30 分钟，作为氧化应激 (ROS) 的阳性对照。所有未处理的样品和用 NPs 处理的样品在与维持培养物所采用的条件相似的条件下孵育。在 1、3、5 和 24 小时后采集子样本，以使用 FCM 评估 NP 对细胞膜完整性和氧化应激的影响。将每个样品的 250 μL 等分试样转移到 Microtiter® 96 孔平底板上。为了评估细胞膜完整性，将碘化丙啶 (PI) 荧光探针（P4170，Sigma-Aldrich，美国）以 7 μM 的终浓度添加到样品中。对于氧化应激检测，按照产品说明将 CellROX® Green Reagent (ROS) (C10444, Life Technologies, USA) 添加到样品中。简而言之，PI 与 DNA 结合并在细胞内穿透受损细胞膜后附着于 RNA，但它被排除在健康细胞之外。 CellROX® Green Reagent 是一种用于测量活细胞氧化应激的探针。细胞渗透染料在还原状态时发出微弱的荧光，但在被 ROS 氧化并随后与 DNA 结合时显示出亮绿色的光稳定荧光。因此，其信号主要位于细胞核和线粒体上。在 FCM 测量之前，将板在黑暗中孵育 20 分钟 (PI) 和 30 分钟 (ROS)。然后用蓝色 488 nm 激发激光使藻类悬浮液通过 FCM。 CellROX Green 在 FL1 通道 533/30 nm、PI 红色荧光在 FL2 通道 585/40 nm 和叶绿素 a (Chla ) 在 FL3 通道中> 670 nm。实验一式两份，重复进行。

使用 CFlow Plus 软件（BD Biosciences，USA）分析 FCM 数据。根据 Chla 的前向散射特性和红色自发荧光对样品进行门控 , 以消除来自 NP、碎片和其他污染物的信号。基于Chla的自发荧光检索细胞数、受损细胞膜或氧化应激细胞的百分比和自发荧光数据 (670 nm)、PI 标记细胞 (585 nm) 和 ROS Green (533 nm)（附加文件 1：图 S1）。

藻类光系统 II 的效率

将金属和金属氧化物 NPs 悬浮液添加到相同的藻类培养物中（约 10 ⁶ 细胞/毫升）在 15 毫升玻璃烧瓶中，以达到 1、5、10 和 20 毫克/升的最终浓度。制备不含 NPs 的藻类培养物作为阴性对照。然后在与原始藻类培养物相同的条件下将所有样品转移到培养箱中。为了使用 AquaPen-C AP-C 100 荧光计（PSI Ltd.，Czech共和国）。所有测量均一式三份进行。 QY 代表可变荧光的比率（F v =F m − F 0) 到最大荧光 (F m)，QY =F v:F m 用作光化学猝灭效率的代表[70]。 F m 是通过在光照之前和结束时在 680 nm 处施加几秒钟的光照而获得的，荧光最小 (F 0) 为无光合光下最低荧光水平的初始测量值。

统计分析

金属和金属氧化物纳米颗粒对 C 的影响。莱茵哈特 使用方差分析和 Dunnett 检验（GraphPad PRISM，美国）进行测试。显着性水平设置为 *P <0.05, **P <0.01 和 ***P <0.001.

结果

纳米颗粒的形成和主要表征

使用 GK 合成的 Ag、Au、Pt、Pd 和 CuO NP 的 TEM 图像显示分离良好的球形 NP，其直径范围为 2 至 100 nm（图 1a-e）。在 UV-Vis 光谱（图 1f）下检测的水性胶体 NPs 溶液在 412 和 525 nm 处显示出明显的表面等离子体共振，这与 GK 网络中 Au 和 Ag NPs 的形成一致。对于 Pt、Pd 或 CuO NP，没有观察到明显的表面等离子体共振。 6 个月后的 UV-Vis 测量证实了所有 NPs 的稳定性，光谱显示一个与新合成的 NPs 平均大小相似的单峰（附加文件 1：图 S2）。

a 的透射电子显微镜图像 金，b 铂，c 银，d Pd 和 e 使用刺梧桐树胶及其相应的金属盐合成的 CuO 纳米颗粒。 一 , b , c , d 和 e 图表插入物显示了通过微分离心沉降确定的藻类介质中纳米颗粒重量的峰值粒度分布。 (F) Au、Ag、Pt、Pd 和 CuO 纳米颗粒的紫外-可见光谱

藻类暴露介质中纳米颗粒的表征

基于重量分布的 NP 尺寸范围为 180 到 5 纳米，如下所示：CuO> Au> Pt> Ag> Pd。所有 NP 在 pH 7 时都带负电（表 1 和附加文件 1：图 S3）。 Pt、Ag 和 CuO NPs 的离子金属浓度最高 (33–36 µg/L)，Au 和 Pt NPs 最低 (6–7 µg/L)（表 1）。在藻类培养基中检测到金属的离子形式（表 1）。

对藻类生长的影响

不受影响 C.莱茵哈特 培养的增长率为1 × 10 ⁶ 细胞/小时。在 1 mg/L Ag、Pd 和 CuO NPs 的存在下，生长速率急剧下降至 2.2 × 10 ⁴ , 1.7 × 10 ⁴ 和 0.2 × 10 ⁴ 细胞/小时，分别（P <0.001)。随着 NP 浓度的进一步增加，藻类生长被完全抑制（图 2）。当藻类暴露于 Au 和 Pt NPs 时，与对照相比，其生长速度也显着降低（P <0.001)，但增加浓度并没有增加效果。

莱茵衣藻的生长率 暴露于 Au、Pt、Pd、Ag 和 CuO 金属和金属氧化物纳米颗粒（1、5、10 和 20 毫克/升）。未暴露对照（藻类培养物）的生长率为 1 × 10 ⁶ 24 小时后细胞/小时。误差线代表重复样本重复实验的标准偏差

细胞氧化应激的产生

氧化应激因 NP 类型而异（图 3）。最高影响（几乎 100% 的细胞受到影响）是由 5–20 mg/L 的 Ag 和 CuO NP 引起的（图 3d、e 和附加文件 1：表 S2）。当藻类细胞暴露于 Au NPs 时，氧化应激要低得多，大多数<10% 的细胞受到影响。 Au NPs 的最高浓度 (20 mg/L) 仅影响 15% 的细胞 (P <0.001)。随着时间的推移，应激细胞的百分比逐渐下降，所有测试的 Au 浓度在 24 小时后均未检测到氧化应激（图 3a）。在暴露的前 5 小时内，Pt NPs 在不到 8% 的藻类细胞中引起氧化应激（图 3b）。仅在 10 和 20 毫克/升的浓度下，24 小时后分别有 10% 和 19% 的细胞产生应激（P <0.001；附加文件 1：表 S2），在较低浓度下未检测到应力 (P> 0.1) 暴露 24 小时后（图 3b）。暴露于 1 mg/L 的 Ag NPs 未能在 24 小时内诱导藻类细胞的氧化应激（P> 0.9）。然而，暴露于 5 毫克/升会在 5 小时后导致氧化应激，而暴露于 10 和 20 毫克/升会在 3 小时后导致氧化应激。暴露于 Ag NPs 24 小时后，100% 的细胞受到压力（P <0.001；图 3c 和附加文件 1：表 S2)。 CuO NPs 诱导显着 (P <0.001) 藻类细胞中的氧化应激比以 10 和 20 mg/L 测试的其他金属 NP 更快（3 小时）（附加文件 1：表 S2），Ag NP 除外。 5 小时后氧化应激在 5 毫克/升时已经很显着。所有浓度 (> 5 mg/L) 对细胞氧化应激都有显着影响（图 3d、e）。作为补充参数，我们还确定了 NPs 产生的非生物 ROS。与C相反。莱茵哈特 C的增长率和百分比。莱茵哈特 细胞表现出氧化应激，Au NPs 仅产生轻微增加的非生物 ROS (P> 0.05；附加文件 1：图 S4）。

莱茵衣藻的百分比 细胞在暴露于浓度增加（1、5、10 和 20 毫克/升）的 a 后表现出氧化应激 金，b 铂，c 钯，d Ag 和 e 1、3、5 和 24 小时后的 CuO 纳米颗粒。误差棒代表使用重复样品重复实验的标准偏差。注意不同的y Au和Pt的-轴刻度

对藻膜完整性的影响

Au 和 Pt NPs 导致显着 (P <0.001) 1 至 5 小时所有浓度下的细胞膜损伤（附加文件 1：表 S3）；然而，没有显着影响（P> 0.05) 在 24 小时后观察到（图 4a、b）。在 Ag NPs 的情况下，100% 的细胞被损坏 (P <0.001) 暴露于 1-20 mg/L 1 小时后（图 4c，附加文件 1：表 S3，Ag）。暴露于 1 和 5 毫克/升 Pd NPs（附加文件 1：表 S3，Pd）后细胞膜受损的百分比与 24 小时内的对照相当（P> 0.4)。另一方面，显着损坏 (P <0.001) 在暴露于 20 mg/L Pd NP 24 小时后观察到（图 4d）。 CuO 的影响随着浓度和时间的增加而增加，在 24 小时后达到最高影响（图 4e 和附加文件 1：表 S3）。

莱茵衣藻的百分比 暴露于浓度增加（1、5、10 和 20 毫克/升）的 a 后细胞膜受损 金，b 铂，c 钯，d Ag 和 e 1、3、5 和 24 小时后的 CuO 纳米颗粒。误差棒代表使用重复样品重复实验的标准偏差。注意不同的y Au和Pt的-轴刻度

对叶绿素 (Chl ) 荧光

儿童 荧光没有受到显着影响（P> 0.1) 24 小时内任何浓度的 Au NP 和 5 小时内的 Pt（图 5a、b 和附加文件 1：表 S4）。另一方面，Ag、Pd 和 CuO NPs 强烈抑制 (P <0.001) Chl 荧光随着浓度和曝光时间的增加而增加，例如儿童 荧光从 98% (1 h) 减少到 22% (24 h) (P <0.001) 当藻细胞在 5 mg/L Ag 存在下生长时（附加文件 1：表 S4）。 10 和 20 毫克/升银也观察到类似的荧光降低，水平下降到 20% 和 9% (P <0.001)，分别（图 5c）。 CuO 和 Pd NP（均为 20 毫克/升）导致 Chl 急剧下降 24 小时后的荧光 (P <0.001)。没有可观察到的影响 (P> 0.1)，然而，对于 1 或 5mg/L 的 Pd 以及 1mg/L 的 Ag 和 CuO NPs（图 5c-e）。

莱茵衣藻的百分比 含有叶绿素 (Chl ) 暴露于增加浓度（1、5、10 和 20 毫克/升）的 a 后的荧光 金，b 铂，c 钯，d Ag 和 e 1、3、5 和 24 小时后的 CuO 纳米颗粒。误差线代表重复样本重复实验的标准偏差

NPs 对藻类光系统 II 的影响

Au、Pt 和 CuO NPs 有轻微的显着影响 (P <0.05) 在 24 小时内的某些时间点，浓度范围为 1 至 20 mg/L（图 6 和附加文件 1：表 S5）。另一方面，QY 显着降低 (P <0.001) 在与所有浓度的 Ag NP 接触后仅 1 小时（图 6c 和附加文件 1：表 S5）。 Pd 和 CuO NPs 在 20 mg/L 的最高浓度下导致 QY 显着降低（图 6d、e 和附加文件 1：表 S5）。

a 的作用 金，b 铂，c 钯，d Ag 和 e 1、3、5 和 24 小时后，CuO 纳米粒子（1、5、10 和 20 毫克/升）对光系统 II 效率（QY %）的影响。 y 上的 100% -轴代表没有纳米颗粒的对照藻类培养物的QY。误差棒代表重复样品重复实验的标准偏差

讨论

在目前的工作中，我们旨在探索在金属和金属氧化物纳米材料的合成过程中消除有毒废物的产生，以实施绿色化学方法 [16, 57, 58]，主要重点是使用对环境无害的分散剂和可再生和可生物降解的材料。我们成功地将 GK（一种天然、可再生和可生物降解的材料）用于合成和稳定一系列 NP。使用去离子水作为溶剂，GK 中存在的官能团（即 -OH 和 -COO-）充当还原剂，GK 聚合物本身充当形成的 NPs 的封端剂，从而实现 NPs 的绿色合成 [59, 68]。我们研究中合成的纳米颗粒（Au、Pt、Pd、Ag 和 CuO）在尺寸、稳定性和成本效益方面与之前研究中的其他绿色合成纳米颗粒相当 [13, 69]。

然后，我们使用与预期或记录的环境浓度相关的一系列纳米级浓度 (1–20 mg/L) [39, 71,72,73] 来评估 NPs 对 C 的生物效应。莱茵哈特 使用藻类生长、膜完整性、Chl 等终点 荧光光系统 II 效率和氧化应激。我们的结果揭示了两个不同的分组：Au 和 Pt NPs 对藻类几乎没有影响，而 Ag、Pd 和 CuO NPs 对几乎所有端点都有很强的影响（附加文件 1：表 S6）。金属或金属氧化物 NPs 的毒性研究已经确定了 NPs 的几个关键物理化学特性，这些特性可能与其毒性相关，包括组成、涂层、尺寸、形状和同质或异质聚集 [69, 74,75,76,77, 78]。此外，溶解金属（离子形式）毒性先前已使用一系列标准在藻类中得到证实，包括细胞内 ROS 生成、Chl 耗竭和光合作用抑制 [79,80,81]。我们清楚地检测到 ROS 的产生和对生长的影响，Chl 暴露于Ag、Pd和CuO纳米颗粒后的产生和光系统II。

虽然 Pd NPs 通常被认为是一种有毒基团，但它们并没有被广泛研究，并且直到最近才被认为是重要的抗菌 NPs [41]。人们普遍认为，Pd NPs 的小尺寸 (1.5-3 nm) 有助于它们的抗菌特性，可能促进通过细菌或藻类细胞壁孔运输到细胞，这些孔的直径范围为 5 到 20 nm [82, 83] .在我们的研究中，平均尺寸为 1.5 nm 的 Pd NPs 可以直接进入藻类细胞壁，并在细胞膜和叶绿体中释放离子 (Chl 荧光、PS II、ROS）。有明确的证据表明可溶性 Pd 盐能够进入 P。次资本 细胞，其中 Pd 沉淀主要在叶绿体中形成 [78]，这会增加 ROS 的产生，从而增加氧化应激。据报道，Pd NPs (127 nm z -average hydrodynamic size) were less toxic toward P. subcapitata than soluble Pd salt [69] maybe due to larger size of NPs that could not directly enter the cells, while Pd salt could. On the other hand, Pd NPs could form hetero-aggregates with algal cells leading to physical entrapment. Surprisingly, the entrapment is not inevitably lethal because the cells could recover their growth after transfer to clean medium [69].

Numerous studies have shown that Ag NPs toxicity to algae was mainly driven by Ag ions dissolved in the exposure medium rather than Ag NPs and also depended on Ag NPs coatings and sizes [80, 84,85,86,87,88,89]. Our study revealed high toxicity of Ag NPs thus suitable for algicidal applications. The ionic Ag and/or Ag NPs (5 nm) could directly enter algal cells [90], causing damage to the cell membranes and other cellular compartments by ROS formation. Moreover, Ag NPs could damage algal cells by direct interaction between NPs and algal cells [72] or the type of NPs coating could play a significant role. For example, dexpanthenol, polyethylene glycol and polyvinyl polypyrrolidone coatings caused a similar effect as AgNO3 on C. reinhardtii , while carbonate, chitosan, and citrate decreased the Ag effect on photosynthesis [87]. Our Ag NPs showed strong effect toward C. reinhardtii regardless GK coating.

The ecotoxicity of CuO NPs has been extensively studied [36, 47,48,49, 69, 91]. We observed CuO NPs harming cell membranes right after 1 h, while the ROS elevated after 3 h at concentrations higher than 5 mg/L and also Chl fluorescence substantially decreased over 24 h. It is possible that the CuO NPs (or ionic Cu)-damaged membranes could increase further uptake of Cu and oxidative stress in the C. reinhardtii cells [91] where observed hetero-aggregation of NPs and the cells (data not shown) could even enhance this interaction. von Moos et al. [36] stated that free Cu ²⁺ or the NPs themselves were the main mediators of toxicity toward C. reinhardtii , while Cheloni et al. [47] believed ion Cu at lower CuO NPs concentrations was the driving force, being unable to clarify the contribution of dissolved Cu in CuO NPs . This was probably elucidated by other study revealed much stronger effect of soluble ionic Cu and soluble fraction of CuO NPs on P. subcapitata than bare CuO NPs [69].

Au NPs slightly increased membrane impairment and oxidative stress after 3 and 5 h, but these effects disappeared after 24 h. Interestingly, abiotic ROS were constantly generated during whole 24 h study contrary to all other NPs. We assume that stable conditions allowed the cells to cope with such small level of stress. Previous study has reported a range of EC50 values for dissolved Au on C. reinhardtii of between 5.9 and 1.7 mg/L, depending on exposure time [92]. In our opinion, almost any Au NP toxicity would not have been exacerbated or affected by the degree of ion Au and would have had nearly no bearing on any of the criteria adopted for our experiments. Moreover, Au NPs seemed to be well dispersed in exposure media and we did not observe any aggregates or direct interactions with the C. reinhardtii cells (data not shown).

We found that Pt NPs caused slight Chl and a growth rate decrease after 24 h for all concentrations. These not so pronounced effects could be caused by both ionic Pt and Pt NPs. Up to now, there has been only limited knowledge about the toxicity of Pt NPs on algae. For example, Pt NPs decreased growth rate, and Chl fluorescence and oxidative stress on P. subcapitata and C. reinhardtii [39, 40]. The latter authors also suggested that the toxicity of Pt NPs might be only partly attributed to dissolved form of Pt in the case of P. subcapitata and that also the shading effect might influence toxicity [40]. In our study, we did not find such evidence.

Conclusions

Green-synthesised metal and metal oxide NPs were produced at nanoscale sizes of 42 nm (Au), 12 nm (Pt), 1.5 nm (Pd), 5 nm (Ag) and 180 nm (CuO):all with a negative charge. GK, a natural hydrocolloid, was successfully applied as a safe, cost-effective stabiliser and showed no aggregation (all NPs) after 6 months at + 4 °C. The biological effect (algal growth, membrane integrity, oxidative stress, Chl fluorescence and photosystem II efficiency) of these NPs was investigated on green alga C. reinhardtii . All NPs had a significant effect on algal growth rate; however, Au and Pt NPs inhibited algal growth far less than the other NPs (Pd, Ag and CuO). In terms of other biological effects, Pd, Ag and CuO NPs caused significant cell membrane damage, highly affected Chl fluorescence and caused oxidative stress. Ag and Pd NPs mostly inhibited photosystem II, while it was not much affected by CuO (only the highest concentration of 20 mg/L significantly decreased QY) and Au or Pt. Generally, metal and metal oxide NPs were successfully synthesised following green chemistry rules, without harmful side-products and showing high stability. Some could find reasonable application in algicides (Ag and CuO) or antimicrobial surfaces (Pd, Ag and CuO), while Au and Pt proved to be almost non-toxic to green alga C. reinhardtii .