氧化铜纳米颗粒对大肠杆菌的生物合成、表征和抗菌潜力评估

介绍

本土草药和辛辣植物具有宝贵的抗氧化和抗菌特性，可用于人类和兽医治疗 [1]。含有抗菌特性的药用植物包括大蒜、生姜、印楝、姜黄、图尔西等，其中大蒜和生姜以其药用而闻名[2]。 生姜 俗称生姜，是属于姜科的本土植物根。它含有姜酚、姜黄素、姜黄素和paradol作为重要的植物化学物质[3]。由于姜的酚类成分具有治疗性质，姜的水提取物已证明其对多种微生物具有抗菌活性 [4]。 大蒜 俗称大蒜的大蒜含有酚类化合物，即使对 MDR 细菌也具有广谱抗菌活性 [5]。 大蒜 对多种革兰氏阳性菌和多种革兰氏阴性菌均表现出广谱抗菌活性[6]。

在分子和原子水平上利用纳米技术知识作为应用综合方法开发具有独特功能的新型化合物的基础，以用于广谱应用 [7]。由于纳米粒子无与伦比的固有特性，它们在医药、农业、食品防腐剂和化妆品方面的应用引起了研究人员的更多探索 [8, 9]。氧化铜纳米粒子的各种生物应用已被成功证明，包括潜在的抗菌剂、有效的治疗化合物、药物输送载体、光催化剂、气体传感、光伏稳定性、量子限制效应和生物探针 [10,11,12,13,14]。由于纳米颗粒的半导体性质，活性氧 (ROS) 的产生由纳米颗粒触发，在细胞水平上带来氧化和退化转化，导致细菌细胞壁的破坏和细胞内容物的释放 [15]。许多方法已用于合成纳米粒子，即化学、物理和生物合成 [16]。金属化合物的还原导致使用任何生化或微生物、植物或其提取物生产纳米颗粒 [17]。

大肠杆菌 (大肠杆菌 ) 是肠道的天然居民和肠道菌群的一部分，由于其潜在的毒力特性，在微生物界具有独特的地位 [18]。毒力的存在取决于E 中基因的数量。大肠杆菌 分离株和在某些情况下抗性基因的水平转移也已被揭示 [19, 20] 这可能会对人类、动物 [21] 造成健康问题 [21] 以及对食品安全和保障的挑战 [22]。 E。大肠杆菌 是奶牛和水牛乳腺炎的病原体，被发现是导致产奶量大幅下降和随之而来的经济损失的原因 [23, 24]，从而产生抗性基因，即超广谱 β-内酰胺酶 (ESBLs) 或过度表达的头孢菌素酶 (AmpC) [25]。与 E 相关的治疗失败。大肠杆菌 感染被认为是一种潜在的威胁，导致人药和兽药中的多药耐药[26]。

与抗生素仅能治疗少数感染源疾病的能力相比，具有特征性抗菌特性的纳米颗粒有可能杀死大约 600 个细胞[27]。目前的研究旨在探索、评估和比较绿色和化学合成的 CuO 纳米颗粒和 大蒜 普通草本根提取物的可能抗菌潜力。 (AS) 和 生姜 (ZO)，针对致病性E。大肠杆菌 作为抗生素的替代品，以克服新出现的耐药性挑战。

方法

目前的研究旨在研究植物化学还原的 CuO NPs 对 Allium sativum 草本根的杀菌作用 (AS) 和 生姜 (ZO)，牛乳腺炎的分离株。

材料

化学制造的 CuO 纳米粒子是从 Sigma-Aldrich 采购的，而 ZO 和 AS 根是从巴基斯坦拉合尔当地的水果和蔬菜市场采购的。 ZO 和 AS 的根在阴凉处晒干以获得均匀的重量。 E 的生长培养基。大肠杆菌 和分析级化学品未经修改使用。

ZO 和 AS 根的水提取

ZO 和 AS 的干燥根被超细研磨成细粉，然后储存在密封罐中。在 70°C 下强力搅拌 30 分钟，以 1:10 的比例将细粉状根与蒸馏水-DIW 混合。在冷却溶液后使用 Whatman 1 号滤纸对制备的溶液进行过滤，滤液在 4°C 下进行储存，用于下一个实验 [28]，如图 1a 所示。

a 概述 姜的水提法 和大蒜 根，b CuO纳米颗粒的绿色合成

CuO的绿色合成

在连续搅拌下，将四水合硝酸铜 (0.1 M) 与不同浓度，即 3 mL、6 mL 和 12 mL 的 ZO 和 AS 提取物混合。 NaOH (2 M) 用于在 90 °C 下将搅拌溶液的 pH 值维持在 12 2 小时以形成沉淀。以 10,000 rpm 的速度离心沉淀物 20 分钟，然后用去离子水洗涤并在 90°C 的热风烘箱中过夜干燥 [29]，如图 1b 所示。

特征化

紫外-可见 GENESYS-10S 分光光度计用于检查波长范围为 200 至 500 nm 之间的 CuO 纳米颗粒以及 ZO 和 AS 的水提取物的吸收光谱 [30]。使用具有 2θ 的 X 射线衍射 (XRD) BRUKER D2 Phaser 进行 CuO NPs 结构和相分析 =(10°–80°) 配备λ的Cu Kα辐射 =1.540 埃 [31]。傅里叶变换红外光谱 (ATR-FTIR) 用于分析 CuO NPs 以及 ZO 和 AS 的水提取物中的官能团 [31]。扫描电子显微镜 (JSM-6610LV SEM) 与 EDS 检测器结合用于观察 CuO NPs 的元素和形态组成。使用 JEOL JEM-2100F 显微镜拍摄高分辨率 TEM 图像和 SAED 图案 [32]。

E.大肠杆菌 隔离与识别

样本集

为采集奶样，从各家畜场追踪鉴定患有临床乳腺炎的奶牛和水牛。

E.大肠杆菌 隔离

MacConkey 琼脂用于对牛奶进行划线和培养，一式三份，以分离纯化的大肠杆菌菌落。大肠杆菌 [33]。 E. 独特菌落的圆盘扩散。大肠杆菌 根据国家临床实验室标准委员会 (NCCLS) 的指南，评估了对特定抗生素的敏感性，以分离大肠杆菌。大肠杆菌 .

E 的标识。大肠杆菌

E的识别和确认。大肠杆菌 基于革兰氏染色进行菌落；区分形态特征和生化测试，即甲基红和过氧化氢酶测试，从伯吉系统细菌学手册的角度来看。在伊红亚甲蓝 (EMB) 琼脂上培养分离株，用于 E。大肠杆菌 与相关革兰氏阴性乳腺增生菌的区别和认可。

评估 CuO NPs 对 E 的体外抗菌潜力。大肠杆菌

进行了许多实验以评估体外 提取物掺杂的 CuO NPs 对致病性大肠杆菌的抗菌潜力。大肠杆菌 . 体外 使用 10 个具有代表性的致病性大肠杆菌进行了试验。大肠杆菌 用于评估 CuO NPs 抗菌潜力的分离株。盘扩散法评估用于评估体外 抗菌潜力。培养皿用 E 的活化生长擦拭。大肠杆菌 1.5 × 108 CFU/mL (0.5 麦克法兰 标准）在 MacConkey 琼脂上 [34]。使用无菌软木钻孔器在培养皿中制备直径为 6 毫米的孔。 ZO 和 AS, 的水提物 与不同浓度的绿色掺杂提取物和化学合成的氧化铜纳米粒子一起被应用到井中。通过使用游标卡尺测量抑菌圈 (mm)，将培养皿在 37°C 下有氧孵育过夜，评估 ZO 和 AS 的水提取物以及绿色掺杂提取物和化学合成氧化铜纳米颗粒的抗菌潜力。使用单向方差分析和可视化 (p <0.05).

结果与讨论

完成掺杂的 CuO NPs 和 ZO 和 AS 的水提取物的 UV-Vis 光谱以研究光学行为，如图 2a、b 所示。对于随后的 CuO NPs 的形成，注意到颜色逐渐从酒色转变为煤黑，同时通过拱形声学提取物对合成的 NPs 进行优化。观察到水提取物在 275 和 280 nm 处的 ZO 和 AS 吸收峰。结果描述λ ZO 和 AS 掺杂的 CuO 在 250 nm 处的最大值描绘了 6 mL:1 的比例，分别具有特征红移和蓝移 [35]。宽峰指定粒子簇和电子从价相到导带的跃迁，在 CuO 中提取浓缩物，如强吸收带所揭示的那样 [36]。在绿色合成的 CuO NPs 中，除了优化值 (6 mL:1) 外，还可以通过增加或减少提取体积来减少吸收。

掺杂a的CuO纳米颗粒的吸收光谱 ZO b 具有 c 的 CuO NPs 的 AS 提取物和 PL 光谱 ZO 和 d AS分别提取

此外，值得注意的是，半导体结构证实了它们对现有纳米量子尺寸效应的物理特性。激发紫外波长为 300 nm 的 ZO 和 AS 掺杂的 CuO NP 的 PL 光谱如图 2c、d 所示。 418、561 和 664 nm 处的三个发射峰分别显示在 CuO（UV 区域）的每个纯和掺杂 PL 图上 [37]。在 418 nm 处发现的紫蓝色光带是近带边缘的标准 CuO 发射峰 [38, 39]。在 430 nm 处，肩部边缘可能是由于 CuO 空位造成的，这是一种 p 型半导体。黄绿色边缘是 561 nm 低温下深度缺陷的原因。 664 nm 处的红色发射峰是造成不同铜条件或存在单个电离氧空位的原因 [40, 41]。紫蓝色、黄绿色和红色光谱中可见光发射的多样性表明所研究的 CuO 颗粒具有高体积表面比和多种表面与体积条件和缺陷（空位或间隙），从而产生捕集到排放范围 [40, 42]。

进行 XRD 以评估 CuO NPs 的晶体结构、组成和规模，如图 3a 所示，d 分别掺杂了 ZO 和 AS。在 2θ 处检测到的峰证明了结晶度的增加 =38.7°、48.6°、53.5°、58.3°、61.7°和66.2°，分别与相应的晶面（111）、（-202）、（020）、（202）、（-113）和（022）。检测到的峰确保了与 JCPDS 卡号同步的 CuO 单斜相的存在：00-002-1040 [43]。使用 D 测量的特征微晶尺寸 =0.9λ /β cosθ 发现 ZO 和 AS 掺杂的 CuO 分别为 24.7 和 47.6 nm，原始样品微晶尺寸为 27.4 nm。几种天然产物已被鉴定为可降低 AS 和 ZO 提取物中平均晶粒尺寸的封端剂和还原剂 [44]。

未掺杂和掺杂a的CuO NPs的XRD图谱 AS b ZO

相应地，如图 4a、b 所示，用 FTIR 检查了 AS 和 ZO 提取物掺杂的 CuO NP 的官能团。 3314 cm ⁻¹ 处的宽峰 认可羟基的存在，峰宽代表直接 C=O 与（N-H）胺 [45]。 1638 cm ⁻¹ 处的强峰 对应于 ZO 的 6-snogal 和 6-gingerol 中存在的 CH2-OCH3 基团，因为发现 CuO 显着减少。在 478.8 cm ^-1 处看到的典型 Cu-O 单键 扭曲的方式是由于强烈的振动模式 [46]。所有峰均表明醇、胺和酮基团导致类黄酮、植物化学物质和蛋白质的螯合和封端[47]。

a的FTIR光谱 AS b ZO掺杂的CuO纳米颗粒

FE-SEM 用于研究掺杂 ZO 和 AS 提取物的 CuO NPs 的表面特征和尺度，如图 5a-d'所示。 FE-SEM 图像显示 CuO NPs 在球形形态中非常团聚。磁干扰和粒子之间聚合物的一致性可能会显示粒子之间的团聚[48]。 ZO 和 AS 掺杂 CuO 是显而易见的，图像显示簇形成和粒径似乎 <1 μm，如图 5b-d' 所示。

使用 FESEM a 拍摄的 CuO NPs 图像 氧化铜，b –d ZO掺杂的CuO和b' –d′ AS掺杂的CuO纳米颗粒

能量色散 X 射线光谱 (EDS) 通过对原始样品和掺杂的 CuO NPs 与 ZO 和 AS 根提取物的元素研究通过顽固的 CuO 相说明了化学成分，如图 6a-d' 所示。与 1 到 10 keV 之间的前体氧相比，测试样品的 EDS 证实了对应于高纯度 Cu 的三个峰。 CuO NPs 表面等离子体共振（SPR）导致吸收峰[49]。对于对照样品，通过 Cu、O 和 Ca 的光谱分别观察到 83.7%、15.2% 和 0.6% 的原子量，而 ZO 掺杂和优化样品 (6 mL:1) 的原子量分别为 82.8%、14.8% 和 2.4%分别通过 Cu、O 和 Zn 的光谱观察到。类似地，发现掺杂 AS 的 Cu、O 和 S 分别为 65.3、29.6 和 4.6。 EDS 中出现的补充原子化合物对分析过程中使用的 SEM 样品架有反应 [50]。

CuO NPsa的EDS光谱 纯铜b –d ZO掺杂的CuO和b' –d′ AS掺杂的CuO纳米颗粒

如图 7a-l 所示，使用 50 nm 的 HR-TEM 进一步评估了 CuO NPs 的独特和特征结构。 HR-TEM 图片显示装饰的纳米粒子类似于 FE-SEM 图像，以及更高的团聚，而尺寸小于 50 nm。 HR-TEM 图像也证实了 ZO 和 AS 掺杂的 CuO NP 中存在植物化学物质 [51]。在 ZO 和 AS 掺杂的 CuO NPs [52] 的整体晶格结构中没有观察到任何缺陷或任何变形。过滤后的显微照片由 HR-TEM 结果以及图 7b、d、f、h、j、l 中黄色方块描绘的指定区域的快速傅立叶变换 [FFT] 呈现，呈现高分辨率结构和原子特征。 HR-TEM平均颗粒尺寸与XRD和SEM分析中观察到的微晶尺寸精确匹配[53]。

一 , b HR-TEM，a –f 3 mL、6 mL 和 12 mL ZO 掺杂的 CuO g 的晶格条纹 –l 分别为 3 mL、6 mL 和 12 mL AS 掺杂 CuO NPs 的晶格条纹

掺杂的 CuO 与 Gi 和 Ga CAE 的 XPS 分析描绘了 C 1s 和 Cu 2p 光谱如图 8a、b 所示。 C1s 范围表示存在四个不同的峰，图 8a 具有不同的官能团，如 C(H,C) (284.39 eV)、C(N) (285.6 eV)、C(O,=N) (287.0 eV) 和 C-O -C (288.75 eV) [54,55,56]。主要是，图 8b 描绘了 Cu 2p 在 933.3 和 953.3 eV 结合能峰对应于 Cu 2p 的掺杂 CuO 的图案 3/2 和 Cu 2p 1/2 自旋轨道表示制备样品的二价氧化态。 942.2 和 962 eV 处的相关峰与 Cu 2p 的卫星峰有关 3/2 和 Cu 2p 1/2 这似乎主要是由于部分填充的 3d ⁹ 轨道处于二价氧化态[57]。

一 , b 掺杂CuO纳米颗粒a的XPS分析 C1s b 铜2p

通过测量培养皿培养 24 小时后的抑制面积，将孔扩散法用于评估 ZO 和 AS 水提取物和合成的 CuO NPs 的杀菌潜力，如图 9a-d 所示，附加文件 1：图 S1 和列于表 1 中。研究结果表明 NPs 浓度和抑制区域协同响应。在样品 1 (3 mL:1)、样品 2 (6 mL:1) 和样品 3 (12 mL:1) 中发现的显着抑菌圈分别为 (1.05–1.85 mm) 和 (1.85–2.30 mm) 使用降低的 (↓)对于 ZO 掺杂的 CuO 纳米粒子 (p <0.05)，图 9a。类似地，AS 掺杂的 NPs 仅在最大浓度下表现出（0.65-1.00 mm）抑菌圈，图 9b。 AS 掺杂的 NPs 对致病性大肠杆菌的功效为零。大肠杆菌 在最低浓度。与显示 1.55 mm 区域的增加 (↑) 浓度相比，ZO 提取物描绘了在降低 (↓) 浓度下的效果，类似地，在降低 (↓) 和增加 (↑) 浓度下均未发现 AS 提取物的抗菌作用。用环丙沙星处理的阳性对照表现出 4.25 mm 的区域，而用 DIW 处理的阴性对照表现出 0 mm。对于最小和最大浓度的 ZO 掺杂 NP，杀菌效力百分比分别从 24.7% 提高到 43.5% 和 43.5-54.1%（图 9c）。类似地，仅对于掺杂 AS 的 NP，在最大浓度下产生 15.3-23.5% 的功效（图 9d）。总之，掺杂 ZO 提取物并以 6 mL:1 优化的 CuO 表现出更高的对致病性E 的杀菌潜力。大肠杆菌 牛乳腺炎起源 (p <0.05) 如图 9a、b 所示。

一 –d CuO NPsa的体外抗菌活性 以↓和↑剂量掺杂ZO，b 分别以↓和↑剂量掺杂AS，c 掺杂 ZO 和 d 的功效百分比 掺杂AS的功效百分比

纳米颗粒的杀菌潜力取决于纳米颗粒的大小、形态结构和表面质量比。活性氧 (ROS) 被认为是导致 CuO 纳米颗粒形成抑制区的原因 [58, 59]。细胞蛋白质的变性是由于有害活性氧 (ROS) 的产生而导致的 [60]。一些反应性物质在光催化中表现出重要作用，例如羟基和超氧自由基和空穴 [61]。活性氧 (ROS) 的合成和金属离子的释放是酶和蛋白质结构变化的主要特征，从而导致 DNA 不可修复的损伤和随后的细菌死亡 [62]。同样，活性氧 (ROS) 产生的氧化应激被认为是光催化的主要贡献者 [63]。 ROS 的产生与纳米粒子的大小成反比，即 NP 的大小越小，ROS 的产生越高，从而破坏细菌膜，导致细胞质内容物的挤出和 DNA 降解，导致细菌爆发，如图 10 所示。同时，带正电荷的铜与带负电荷的细菌膜发生静电相互作用，导致细胞分解，最终破坏细菌 [58, 64, 65]。已提出两种响应作为纳米结构杀菌机制的潜力。一种涉及阳离子 Cu ²⁺ 之间更好的连接 和细菌细胞，导致阴性切片的形成并最终崩溃。另一个涉及通过激发对 CuO 价带表面进行电子激发。此外，电 O2 反应产生 O ²⁻ 自由基，导致 H2O2 的形成。生成的 O ²⁻ 种是分解细菌外细胞膜上的脂质或蛋白质分子所必需的[58, 66]。

CuO NPs杀菌作用示意图

结论

掺杂生姜的CuO NPs的杀菌潜力 和大蒜 提取物对抗致病性E。大肠杆菌 在这项研究中进行了评估，生产的目的是替代、经济和有效的抗菌剂。 ZO 和 AS 提取物的植物化学成分在 CuO NPs 的生物合成中发挥重要作用，而黄酮类化合物与 CuO 的协同作用被发现是浓度依赖性的，利用对致病性大肠杆菌的杀菌潜力。大肠杆菌 .进行 FTIR 以确认 ZO 和 AS 提取物掺杂，XRD 峰确认平均尺寸为 24.7 nm（ZO 掺杂）和 47.6 nm（AS 掺杂）的单斜晶相和球形结构。 FESEM 图像证实了球形形态以及 CuO NPs 的过度聚集。经修饰的纳米粒子在 TEM 图像中显示出更高的团聚，尺寸小于 50 nm。对于含有根提取物的掺杂样品，发现测量为 0.23 nm 的 CuO 纳米颗粒的层间距与 XRD 图案兼容。这项研究的结果表明，绿色合成的 CuO NPs 的抗菌潜力有望作为替代杀菌剂来解决与抗生素耐药性和残留相关的问题。可以得出结论，掺杂中草药的CuO NPs是一种经济、有效、天然的抗菌剂。

数据和材料的可用性

所有数据完全可用，不受限制。

缩写

EDS：

能量色散X射线光谱

fcc：

面心立方

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

G + ve：

革兰氏阳性

G -ve：

革兰氏阴性

JCPDS：

粉末衍射标准联合委员会

CuO：

氧化铜

纳米：

纳米