姜蒜提取物掺杂的环保氧化铜纳米颗粒对大肠杆菌的强效抗菌活性

摘要

抗生素耐药菌的兴起及药物残留在食物链中的持久性构成全球公共卫生危机。传统抗生素疗效日降，亟需开发新型抗菌剂。氧化铜（CuO）纳米颗粒作为具有明确抗菌性能的无机平台备受关注。本研究采用绿色合成路线制备CuO NPs，并掺杂不同浓度的姜（Zingiber officinale, ZO）和蒜（Allium sativum, AS）提取物。所得生物制备NPs针对源自牛乳房炎的致病性大肠杆菌株进行评估。数据证实姜掺杂CuO NPs在6 mL:1提取比下展现最优杀菌活性，凸显其作为传统抗生素的低成本、环保替代品的潜力。

引言

大蒜和姜等药用植物富含酚类化合物，赋予其强抗氧化和抗菌作用。姜含姜辣素、姜烯酚和姜黄素，大蒜含大蒜素等含硫分子，对多重耐药（MDR）菌株具广谱活性（参考文献[1]–[6]）。

纳米技术赋予材料独特理化性质。氧化铜纳米颗粒因其半导体特性及产生活性氧（ROS）破坏细菌膜的能力，被探索用于抗菌剂、药物递送、光催化剂和传感器等领域（参考文献[10]–[15]）。

大肠杆菌是兽医和人类医学的关键病原体。奶牛中产生广谱β-内酰胺酶（ESBLs）或AmpC β-内酰胺酶的MDR大肠杆菌引起乳房炎，造成巨大经济损失（参考文献[18]–[25]）。这些挑战凸显了开发绕过传统耐药机制的新型抗菌剂的紧迫性。

本研究探索掺杂姜蒜提取物的绿色合成CuO NPs，作为控制大肠杆菌感染的抗生素替代方案。

材料与方法

旨在评价植物化学还原CuO NPs对姜蒜根提取物及牛乳房炎分离大肠杆菌的杀菌功效。

材料

使用化学合成CuO NPs（Sigma-Aldrich）及干姜蒜根（拉合尔市场）。标准培养基和分析试剂未经修改直接使用。

ZO和AS根水提取

根部粉碎，按1:10比例加蒸馏水，70°C搅拌30分钟，滤纸（Whatman No.1）过滤，冷却后4°C保存（图1a）。

CuO绿色合成

0.1 M硝酸铜溶液与3、6或12 mL ZO或AS提取物持续搅拌混合。用2 M NaOH调pH至12，90°C加热2小时沉淀，离心（10,000 rpm，20分钟），洗涤，90°C干燥过夜（图1b）。

表征

UV-vis吸收光谱（200–500纳米）用GENESYS-10S分光光度计测定。X射线衍射（XRD）用Bruker D2 Phaser（Cu Kα，λ=1.540 Å）。傅里叶变换红外（FTIR）采用ATR模式。扫描电镜（SEM）和能谱（EDS）用JSM-6610LV。高分辨透射电镜（HRTEM）和选区电子衍射（SAED）用JEOL JEM-2100F。X射线光电子能谱（XPS）确认元素价态。

大肠杆菌分离与鉴定

样品采集

从多家农场临床乳房炎奶牛/水牛采集乳样。

大肠杆菌分离

MacConkey琼脂培养，菌落传代，按NCCLS指南做药敏试验。

大肠杆菌鉴定

革兰氏染色、形态学观察、生化试验（甲基红、过氧化氢酶）确认，EMB琼脂生长佐证。

体外抗菌评价

对10株致病性大肠杆菌进行纸片扩散法测试。平皿接种1.5×10⁸ CFU/mL，6毫米小孔加入100 μL各测试液（提取物、掺杂NPs、化学合成CuO）。37°C培养24小时，游标卡尺测量抑菌圈（毫米）。单因素方差分析（p<0.05）。

结果与讨论

UV-vis显示CuO NPs形成过程中颜色从酒红变为煤黑。提取物在275纳米（ZO）和280纳米（AS）处有吸收峰。掺杂CuO NPs在250纳米处显示λmax，6 mL:1提取比吸收最佳（图2a,b）。

XRD确认单斜相CuO（JCPDS 00-002-1040）。晶粒尺寸：ZO掺杂24.7纳米，AS掺杂47.6纳米，纯CuO 27.4纳米（图3a,b）。FTIR显示特征O-H、C=O和Cu-O振动，证实植物化学物质包覆（图4a,b）。

SEM显示球形纳米颗粒，团聚体<1微米；EDS确认Cu、O高纯度，微量Zn和S源自提取物（图5,6）。

纸片扩散法显示：ZO掺杂CuO NPs在6 mL:1比例下产生最大抑菌圈（达2.30毫米），杀菌功效54.1%（图9a–c）。AS掺杂NPs活性较弱，最高浓度下抑菌圈1.00毫米，功效23.5%（图9b–d）。阳性对照环丙沙星抑菌圈4.25毫米，阴性对照DIW无抑菌。

抗菌机制归因于ROS生成和Cu²⁺释放，导致膜破坏、蛋白变性和DNA损伤（图10）。较小NPs产生更高ROS水平，增强杀菌效率。

结论

掺杂姜蒜提取物的绿色合成CuO NPs对牛乳房炎致病性大肠杆菌表现显著抗菌活性。姜掺杂NPs在6 mL:1比例下功效最高，可能源于黄酮类与CuO的协同作用。结构分析确认单斜相、球形形貌和纳米尺寸（ZO掺杂24.7纳米，AS掺杂47.6纳米）。研究支持植物基CuO NPs作为经济、环保的抗生素替代品，应对抗生素耐药和残留污染问题。