Nec-1通过调节RIP1减轻二氧化钛纳米颗粒诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性

摘要

二氧化钛纳米材料因优异理化特性广泛应用，但对人类健康构成潜在威胁。近期体内研究显示二氧化钛纳米颗粒（TNPs）经多种暴露途径进入动物大脑，吸收的TNPs可在脑内积累并干扰神经元，导致脑功能障碍。体外研究证实TNPs神经毒性，但机制未明，坏死性凋亡是否参与未知。本研究通过体外实验发现TNPs剂量依赖性诱导SH-SY5Y细胞炎症损伤，坏死抑制剂-1（Nec-1）预处理可减轻。因受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIP1）是Nec-1靶点，我们用siRNA沉默RIP1。暴露突变型和野生型细胞于TNPs评估炎症损伤。沉默RIP1表达抑制TNPs暴露诱导的炎症损伤。综上，Nec-1通过RIP1缓解TNPs神经毒性。但需更多研究全面评估TNPs神经毒性与RIP1相关性。

引言

二氧化钛纳米材料因优异理化性质被合成并广泛用于化妆品、工业、医疗等领域。但广泛使用可能对人健康构成巨大威胁。暴露后，多数TNPs经吸入和摄入进入人体。呼吸、消化、心血管系统均可能受吸收TNPs干扰。同样，作为中枢神经系统最重要部分的大脑也可能受扰，因循环中TNPs可穿透血脑屏障，吸入NPs可经嗅觉通路进入大脑。一旦TNPs进入大脑，可能积累并损伤大脑导致功能障碍。脑损伤通常不可逆且严重，任何潜在损伤原因都应调查。

虽无流行病学研究探讨TNPs暴露与脑疾病关联，但大量体内外研究证实TNPs神经毒性。研究重点在于揭示潜在机制。为此，我们先前综述TNPs神经毒性已知分子机制，发现程序性细胞死亡（PCD）过程如凋亡和自噬涉及TNPs神经毒性。

坏死性凋亡（调控性坏死）是另一种PCD。不同于半胱天冬酶依赖的凋亡，坏死性凋亡依赖受体相互作用蛋白激酶1/3（RIP1/RIP3）。激活RIP1招募RIP3形成坏死小体，激活混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）启动坏死性凋亡。坏死性凋亡可调控细胞死亡和神经炎症，二者均涉及TNPs神经毒性。因此假设坏死性凋亡参与TNPs致神经毒性。

为验证假设，开展体外研究探究坏死性凋亡在TNPs神经毒性中作用。测量TNPs暴露后细胞活力、LDH泄漏、炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8）。首先，SH-SY5Y细胞培养不同浓度TNPs。其次，细胞暴露于TNPs伴/不伴Nec-1（坏死性凋亡强效抑制剂）。第三，RIP1基因表达（可被Nec-1抑制）用siRNA沉默，随后突变型和野生型细胞处理TNPs。本研究揭示TNPs神经毒性分子机制。

结果

TNPs抑制细胞活力

为验证TNPs对SH-SY5Y细胞细胞毒性，用CCK8实验评估细胞活力。细胞用5-160 μg/mL TNPs培养24、48、72 h。图1显示，24 h暴露5、10、20、40 μg/mL组细胞活力无变化。48、72 h仅5 μg/mL组无变化（p=0.4507和0.1002）。80 μg/mL TNPs处理48 h（p=0.0007）和72 h（p=0.0008）细胞活力显著降低。结论：TNPs剂量和时间依赖性降低细胞活力，长期暴露毒性更强。

TNPs损伤膜完整性

72 h暴露后用LDH泄漏评估膜完整性毒性效应。图1b显示，>5 μg/mL TNPs处理组LDH水平显著升高。40、80、160 μg/mL组LDH产生增加（p<0.0001）。结果提示TNPs剂量依赖性增加LDH水平，与CCK8实验一致。

TNPs暴露促进炎症

ELISA分析TNPs暴露后炎症反应。72 h不同浓度TNPs处理后测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平。图2显示，所有TNPs处理细胞IL-8分泌上调；>5 μg/mL组TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8均匀升高（p<0.01）。>10 μg/mL组炎症显著更高（p<0.0001）。综上，TNPs剂量依赖性增强炎症。

结果表明TNPs剂量依赖性诱导炎症损伤。后续实验采用80 μg/mL TNPs、72 h暴露探究坏死性凋亡在TNPs神经毒性中作用。

Nec-1联合处理抑制TNPs神经毒性

为分析坏死性凋亡在炎症损伤中作用，Nec-1（坏死性凋亡抑制剂）与TNPs联合处理细胞。图3a显示，SH-SY5Y细胞暴露TNPs或TNPs+Nec-1（1、5、10、15、20 μM），Nec-1显著改善TNPs诱导细胞活力降低（10、15、20 μM）（p<0.0001）。因15、20 μM组细胞活力不高于10 μM组（p=0.6643、0.6292），后续用10 μM Nec-1分析膜完整性影响。

TNPs或TNPs+Nec-1培养后，TNPs+Nec-1组LDH水平远低于单独TNPs组（p=0.0005）。单独Nec-1处理不增加LDH泄漏（p=0.9878）。结论：10 μM Nec-1有效抑制TNPs细胞毒性且自身无细胞毒性。

为分析Nec-1抗炎能力，细胞培养TNPs或TNPs+Nec-1。图4显示，TNPs+Nec-1组TNF-α（p=0.003）、IL-1β（p=0.0013）、IL-6（p<0.0001）、IL-8（p=0.0004）产生显著低于TNPs组。结果暗示Nec-1可减轻TNPs暴露诱导的炎症反应。

沉默RIP1减轻TNPs诱导的炎症损伤

为确定Nec-1是否通过RIP1消除TNPs诱导炎症损伤，用siRNA有效沉默细胞RIP1表达（图5，p<0.0001）。随后测量突变型和野生型细胞TNPs暴露后炎症损伤。图6a显示，TNPs+si-RIP1组细胞活力显著高于TNPs+si-NC组（p=0.0002）。LDH产生（图6b，p<0.0001）和TNF-α（p<0.0001）、IL-1β（p=0.0001）、IL-6（p<0.0001）、IL-8（p=0.0001）水平（图7）在TNPs+si-RIP1组显著低于TNPs+si-NC组。结果表明TNPs通过RIP1促进炎症损伤。

讨论

本研究发现TNPs暴露剂量依赖性诱导SH-SY5Y细胞细胞毒性，坏死性凋亡参与TNPs神经毒性。为探究坏死性凋亡作用，细胞暴露TNPs伴/不伴Nec-1（强效坏死性凋亡抑制剂），测细胞活力、LDH泄漏、炎症因子水平。数据提示Nec-1联合处理可减轻TNPs诱导炎症损伤。因研究显示Nec-1通过抑制RIP1活性发挥作用，我们转染si-RIP1确定RIP1是否参与Nec-1保护效应。突变型和野生型细胞处理TNPs评估炎症损伤。结果显示si-RIP1组细胞活力高于si-NC组，TNPs暴露后si-RIP1组LDH泄漏和炎症因子水平低于si-NC组。首次揭示坏死性凋亡参与TNPs诱导细胞炎症损伤。

体外研究再次确证TNPs神经毒性。SH-SY5Y细胞暴露不同浓度TNPs不同时间后，CCK8实验评估细胞活力。图1a显示TNPs暴露剂量依赖性降低细胞活力；48、72 h暴露80、160 μg/mL组细胞活力较对照组显著降低（p<0.001）。为进一步确证细胞毒性，测LDH泄漏。图1b数据显示72 h暴露后LDH产生剂量依赖性增加，40、80、160组LDH水平显著高于对照组（p<0.0001）。因前研究显示TNPs暴露可促进神经炎症，测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平。图2显示四种炎症因子水平较对照组显著上调，20-160 μg/mL组显著更高（p<0.0001）。综上，TNPs可剂量依赖性诱导神经毒性，与前研究一致。TNPs可被神经元细胞吸收抑制增殖。TNPs暴露可剂量依赖性降低细胞活力、促进LDH泄漏。

联合Nec-1处理阐明坏死性凋亡是否参与TNPs致神经毒性。指定浓度TNPs伴/不伴Nec-1处理后评估细胞活力、LDH泄漏、炎症。图3a显示10 μM Nec-1显著抑制TNPs暴露后细胞活力降低。图3b显示10 μM Nec-1处理不增加LDH水平，TNPs+Nec-1组LDH水平显著低于单独TNPs组。测Nec-1联合处理对TNPs诱导炎症影响。图4显示TNPs+Nec-1组TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平显著更低。结果再次验证Nec-1可保护细胞免受死亡和炎症过程。

最后，因RIP1是Nec-1靶点，评估RIP1能否调控TNPs神经毒性。用siRNA沉默RIP1构建突变细胞（图5）。图6、7数据显示TNPs暴露后，si-RIP1组细胞活力更高，LDH、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平低于si-NC组，提示TNPs通过RIP1促进细胞毒性。同样，多研究揭示RIP1可同时调控细胞死亡和炎症过程。

虽首次报道Nec-1通过抑制坏死性凋亡信号通路减轻TNPs神经毒性，但研究有局限。首先，纳米材料细胞毒性与块体不同，受表面性质显著影响，可能解释Sebastián等发现细胞活力增加的相反结果。故需从细胞增殖、膜完整性、氧化应激、炎症、线粒体功能、细胞周期、细胞骨架、表观遗传等多方面全面评估纳米毒性。其次，RIP1招募RIP3形成功能性坏死小体，激活MLKL启动坏死性凋亡。假设RIP3/MLKL可能参与TNPs神经毒性，未来工作应探究。此外，RIP3/MLKL与TNPs神经毒性关联也应评估。第三，活性氧（ROS）作为TNPs神经毒性主要机制，被报道为RIP1上游信号。TNPs神经毒性中ROS是否为RIP1上游应进一步讨论。第四，细胞应暴露于无毒浓度（TNPs<5 μg/mL）长期（>72 h）评估慢性细胞毒性。第五，应在更多神经元细胞系和原代人/动物神经元细胞中评估坏死性凋亡在TNPs神经毒性中作用。

结论

本研究揭示坏死性凋亡作为另一程序性细胞死亡机制参与TNPs致神经毒性。发现TNPs可剂量依赖性诱导SH-SY5Y细胞炎症损伤，Nec-1（强效坏死性凋亡抑制剂）联合处理可改善有害效应。RIP1作为Nec-1靶点，经siRNA沉默有效减轻TNPs暴露诱导炎症损伤。结论：Nec-1通过靶向RIP1通路抑制TNPs暴露诱导的SH-SY5Y细胞炎症损伤。TNPs神经毒性中RIP1上下游信号通路应进一步评估。

材料与方法

TNPs制备与细胞培养

按前文发表程序表征制备TNPs。简述：TNPs溶于RPMI 1640配制5、10、20、40、80、160 μg/mL不同浓度。TNP溶液灭菌、室温超声（300 W，10 min）防颗粒团聚。未暴露TNPs培养基中细胞为对照组。SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，RPMI 1640培养基（HyClone）含10% FBS（Gibco）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，37°C、5% CO₂湿润培养箱培养。

细胞活力与LDH泄漏实验

细胞活力用细胞计数试剂盒-8（CCK8，Dojindo，猫号CK04）测定。简述：1×10⁴ SH-SY5Y细胞接种96孔板，37°C（5% CO₂）孵育24 h后暴露TNPs。随后用不同浓度（0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL）TNPs孵育24 h。处理后再孵育CCK-8 2 h。微孔板读数仪（BioTek）450 nm测光密度（OD）。各组细胞活力百分比计算为(OD处理-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%。

膜完整性用商业试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。SH-SY5Y细胞暴露不同浓度TNPs 72 h后，按说明书分析LDH分泌。

炎症反应

ELISA测定SH-SY5Y细胞产生的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平。简述：SH-SY5Y细胞暴露TNPs 72 h，收集上清按说明书分析（Elabscience生物技术有限公司）。

siRNA转染

按制造商方案，用Lipofectamine 2000转染100 nM si-RIP1或阴性对照siRNA（si-NC）。用实时PCR估算siRNA基因沉默效率。

实时PCR

暴露不同浓度TNPs细胞RNA用RNAqueous试剂盒（Ambion）按说明分离。实时PCR测RIP1相对表达。RIP1相对mRNA水平以β-actin表达归一化。

统计分析

SPSS 11.0软件（SPSS Inc.，芝加哥）分析数据。单因素方差分析比较组间均值。p<0.05视为统计学显著。