F-肌动蛋白通过MKL1和YAP/TAZ介导TiO₂纳米管诱导的间充质干细胞成骨分化

摘要

钛及钛合金广泛用于骨科植入体。纳米表面改性为改善钛基底骨整合提供新策略。肌动蛋白（F-actin）聚合作为力学加载结构，普遍认为参与细胞迁移、内吞、分裂和形状维持。F-actin是否参与及如何在纳米管诱导的间充质干细胞（MSCs）成骨分化中发挥作用尚待阐明。本研究通过阳极氧化在钛基底制备TiO₂纳米管，利用扫描电镜（SEM）、X射线能谱分析（EDS）、原子力显微镜（AFM）表征特征。通过碱性磷酸酶（ALP）染色、Western blot、qRT-PCR、免疫荧光染色探究成骨潜能、F-actin水平及MKL1和YAP/TAZ表达。结果显示：阳极氧化电压从30 V增至70 V时，TiO₂纳米管内径和粗糙度增加，高度恒定为2 μm。管径越大，促进MSCs成骨分化能力越强。细胞松弛素D（Cyto D）抑制F-actin聚合，抑制MSCs成骨分化及粘着斑复合物蛋白vinculin（VCL）和粘着斑激酶（FAK）表达。相反，jasplakinolide（Jasp）促进F-actin聚合，增强RhoA和转录因子YAP/TAZ表达。结论：TiO₂纳米管促进MSCs成骨分化，且在一定范围内（30-70 V）随管径增加能力增强。F-actin通过MKL1和YAP/TAZ介导这一过程。

引言

钛及钛合金因优异的生物相容性、耐腐蚀性和力学性能，广泛用于全关节置换、牙种植体等临床应用。但仍面临无菌松动、感染等挑战。近年针对增强骨整合和抗菌性能的研究众多。例如，MoS₂/PDA-RGD涂层不仅促进钛植入体与宿主骨整合，还高效抑制细菌生长。表面形貌修饰近年受关注，仅改变微纳尺度结构，区别于化学修饰。化学信号刺激细胞不稳定且有细胞毒性；物理信号安全可控，可避免化学分子副作用。因此，植入体表面形貌修饰及通过形貌结构调控骨整合，为解决植入体术后骨整合差提供新途径。

骨组织工程和骨再生领域，细胞-形貌相互作用被视为精准控制种子细胞功能和分化的有前景策略。骨本身在纳米和微米范围内具有精妙层级结构。表面形貌可提供相似微环境，模拟天然骨结构，促进MSCs在宿主骨和植入体表面成骨分化。表面形貌包括纳米管、纳米线、纳米孔等。特别是纳米管阵列因高表面积体积比、生物可塑性、高吸附能力等独特表面特性，近年在多领域引起广泛兴趣。例如，氮化硼纳米管（BNNT）可作为气体传感材料监测变压器运行状态。生物医学领域，表面形貌能指导细胞迁移、粘附、增殖、分化。最新研究显示纳米级形貌可定向MSCs分化为成骨细胞强化早期骨整合。甚至有报道微纳复合表面修饰可致MSCs分化为收缩性平滑肌细胞。但表面形貌如何决定细胞命运的分子机制尚待阐明，这对材料安全评价和设计至关重要。

丝状（F）-肌动蛋白，又称微丝，是真核细胞骨架三大主要成分之一。由球状（G）-肌动蛋白聚合并经多种蛋白修饰组成。F-actin因所有亚基指向同一末端而具有结构极性。有刺端指向相邻单体，尖端暴露ATP结合位点。ATP参与G-actin与F-actin转化过程，处于动态平衡，聚合和解聚同时发生，即跑步机运动，常见于板伪足和丝状伪足。显然肌动蛋白动态在细胞迁移、分裂、形状维持等功能中起重要作用。但F-actin不仅作为支撑力学加载的物理结构，还参与信号转导和基因表达等生物行为。越来越多证据表明F-actin通过与其他蛋白相互作用将物理信号转化为化学信号。例如，生物力学和几何重构阻止肌动蛋白单体聚合促进肿瘤细胞凋亡；超声脉冲抑制F-actin解聚增强人MSCs成骨；我们前期研究也证实机械应变增加F-actin稳定性。因纳米管空心结构提供较少细胞粘附位点，为维持生物力学平衡，细胞骨架重排不可避免。因此有理由相信F-actin很可能介导纳米形貌诱导的细胞分化。

本研究制备TiO₂纳米管，通过阳极氧化修饰形貌，探究其促进MSCs成骨分化能力。进一步研究F-actin在机械转导中是否起关键作用。细胞松弛素D（Cyto D）竞争性结合F-actin有刺端阻止G-actin掺入纤维，用于抑制F-actin聚合；jasplakinolide（Jasp）用于增强肌动蛋白组装稳定性。此外，我们也想阐明F-actin如何将物理线索转化为生化信号。基于前期研究结果，假设MAPK通路可能参与。转录因子如Yes相关蛋白（YAP）/含PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）和MKL1，被认为是机械感受器和机械转导器，也作为筛选F-actin如何影响干细胞命运的对象，因其他领域研究暗示它们与F-actin相关。总体旨在阐明F-actin在纳米管诱导干细胞分化过程中的作用，指导纳米管修饰植入体的材料设计和生物安全评价。

材料与方法

TiO₂纳米管制备

纯钛片（99.9%纯度，2 mm厚；盛世达，河北，中国）作基底，用400和1500目碳化硅砂纸抛光。依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗，室温干燥3 h。制备纳米形貌时，预处理样品作阳极，铂片作阴极，在0.15 M NH₄F和90%乙二醇水溶液中恒压阳极氧化1 h。阳极氧化电压为30、40、50、60、70 V恒压。阳极氧化后，去离子水冲洗30 min，无水乙醇超声清洗15 min。最后120 °C高压灭菌1 h，培养基润湿后使用。

纳米管形成反应机制尚不明确，主流理论为场增强溶解理论。纳米管阵列形成是场氧化、场溶解、化学溶解动态平衡结果（图1b）。阳极氧化过程：第一步，电解质-金属界面形成氧化物势垒层：Ti⁴⁺ + 2H₂O → TiO₂ + 4H⁺。随后氧化层表面因场增强溶解出现裂纹和窄缝。F⁻离子扩散入裂纹缝隙增强溶解速率。裂纹扩大并与相邻裂纹连接。最终氧化层形成速率与溶解速率达动态平衡，纳米管不再生长：TiO₂ + 6F⁻ + 4H⁺ → [TiF₆]²⁻ + 2H₂O。

表面表征

不同电压（30、40、50、60、70 V）制备样品经乙醇和去离子水冲洗15 min，室温干燥。扫描电镜（SEM450，FEI Nova Nano SEM）表征表面结构，测量纳米管内径和高度（喷金后）。同步进行X射线能谱分析（EDS）分析元素组成。原子力显微镜（AFM，NanoManVS，Bruker）研究表面形貌和粗糙度。每个样品选取三个不同区域，重复测量三次。

细胞培养

4周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠购自上海第九人民医院实验动物中心。无菌分离股骨和胫骨获取大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）。α-最小必需培养基（α-MEM；Hyclone）含10%胎牛血清（FBS；Gibco）、100 mg/mL链霉素、100 U/mL青霉素，37 °C、5% CO₂、95%空气湿润环境培养。每2天换液，80%融合时消化传代。本研究使用3-5代细胞。成骨诱导培养基为生长培养基补充100 nM地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠、50 mM抗坏血酸（Sigma-Aldrich）。

细胞增殖实验

TiO₂纳米管修饰钛片切成圆形置入24孔板。3-5代BMSCs以3×10⁴ cells/片密度接种于TiO₂纳米管，培养基为生长培养基或成骨培养基。培养2天后，每天添加细胞松弛素D（Cyto D，Sigma-Aldrich）和jasplakinolide（Jasp，Sigma-Aldrich）调节F-actin聚合，连续3天。Cyto D和Jasp终浓度和作用时间分别为5 μM、1 h和2 μM、3 h。孵育后更换培养基。Cyto D或Jasp处理12 h后用CCK-8试剂盒（Dojindo）检测细胞活力和增殖。细胞与10% CCK-8溶液孵育2 h，取100 μL反应液转入96孔板，多功能酶标仪（Safire2，TECAN）450 nm测吸光度(OD)。另用自动细胞计数仪（AMQAX1000，Life Technologies）计数近似细胞数。计数前酶法消化脱离细胞，台盼蓝染色。

碱性磷酸酶染色与ALP活性分析

BMSCs以3×10⁴/孔密度接种于五种不同电压（30、40、50、60、70 V）TiO₂纳米管修饰钛片，成骨培养基培养。按上述加药方案处理。7天后，PBS洗涤三次，4%多聚甲醛固定，按ALP试剂盒说明书（虹桥，上海）孵育ALP工作液。洗涤后立体显微镜观察。

ALP活性分析：细胞用不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解，离心上清液用ALP测定试剂盒（江苏贝时生物）按方案测定，活性按相应裂解液蛋白浓度归一化。

免疫细胞化学

Cyto D和Jasp处理3天后，BMSCs用4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤三次。0.3% Triton-X 100通透30 min，洗涤三次，避光室温下罗丹明标记鬼笔环肽染色1 h。PBS洗涤，DAPI（贝时生物）复染10 min。再洗涤三次，载玻片封片，共聚焦显微镜观察。

Western Blot

评估蛋白表达：TiO₂纳米管上培养的BMSCs用胰蛋白酶（Gibco）收集。PBS洗涤三次，含蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液冰上裂解30 min。12,000×g、4 °C离心15 min收集上清。BCA蛋白测定试剂盒（贝时）测总蛋白浓度。加样品缓冲液，95 °C煮沸15 min。10 μL蛋白样品加载12.5% SDS-PAGE凝胶（EpiZyme），120 V电泳1 h，250 mA转印PVDF膜（Millipore）2 h。5-10%脱脂奶粉TBST封闭1 h，4 °C过夜孵育一抗（贝时稀释缓冲液稀释）。TBST洗三次每次5 min，荧光标记二抗（稀释缓冲液稀释）室温避光孵育1 h。双色红外荧光成像系统（Odyssey，LiCor）检测蛋白条带。若内参蛋白条带一致，剥离膜重探另一抗，流程相同。内参用GAPDH抗体。其他一抗：抗vinculin（1:1000，Abcam）、抗FAK（1:1000，CST）、抗Runx2（1:1000，CST）、抗RhoA（1:1000，CST）、抗F-actin（1:500，Abcam）、抗Osx（1:500，Abcam）、抗pYAP（1:1000，CST）。二抗：羊抗鼠IgG H&L（IRDye® 680RD，1:5000，Abcam）和羊抗兔IgG H&L（IRDye® 680RD，1:5000，Abcam）。

定量实时PCR

第7天行qRT-PCR评估成骨培养基中TiO₂纳米管上生长细胞的Runx2、Osx、Alp、骨钙素（OCN）、RhoA、YAP、TAZ、vinculin（VCL）、FAK、巨核白血病1（MKL1）基因表达。Total RNA Kit（R6812-01HP，Omega Bio-Tek）提取总RNA。OD260测定RNA浓度纯度，仅A260/280和A260/230均>1.8的样本分析。qScript cDNA合成试剂盒（Takara）逆转录cDNA。SYBR® Premix Ex Taq™（Takara）在QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统（Life Technologies）上扩增。GAPDH作内参。2⁻ΔΔCt法分析数据，结果以倍数变化相对对照组表示。引物序列见表1。

统计分析

所有数据至少三次独立实验、三复孔代表，除非特别说明。数据以mean ± SD表示。组间差异单因素方差分析后Student-Newman-Keuls事后检验或Student t检验。P<0.05为统计学显著差异。

结果

表面表征

不同恒定电压（30、40、50、60、70 V）阳极氧化1 h制备TiO₂纳米管（图1）。SEM观察到均匀分布的自组装纳米管阵列。侧视图和俯视图见图2a、b。所有样品纳米管高度约2 μm，内径随电压增加：约74 nm（30 V）、92 nm（40 V）、112 nm（50 V）、128 nm（60 V）、148 nm（70 V）（图2c）。表明纳米管高度与阳极氧化时间相关，内径与电压相关。EDS分析元素组成（图2d、e），纳米管仅含O和Ti。AFM检测纳米管结构并测量轮廓算术平均偏差作为表面粗糙度(Ra)（图2f）。数据显示表面粗糙度随直径（即阳极氧化电压）增加而增加（图2g）。

TiO₂纳米管诱导MSCs成骨分化

7天成骨诱导后，ALP染色评估MSCs成骨分化（图3a）。TiO₂纳米管组MSCs ALP活性高于光滑钛基底（对照组）。染色面积统计分析显示纳米管诱导成骨分化能力显著强于对照组。观察到趋势：实验直径范围内，TiO₂纳米管直径越大，诱导成骨分化能力越强（图3b）。因此后续实验用70 V组更好展示结果。第3天和第7天分析成骨基因表达。第3天和第7天TiO₂纳米管组MSCs成骨基因（RUNX2、ALP、OCN、OSX）表达均显著高于对照组（图3d-g）。Western blot证实第7天RUNX2和OSX蛋白表达上调（图3c）。有趣的是，TiO₂纳米管组F-actin上调。显然TiO₂纳米管定向MSCs向成骨细胞分化，与管径相关。结果也提示F-actin参与该过程。

F-actin介导TiO₂纳米管上MSCs成骨分化

为探究F-actin是否参与纳米形貌诱导细胞分化，用jasplakinolide（Jasp）和细胞松弛素D（Cyto D）分别正向和负向调节F-actin聚合。罗丹明-鬼笔环肽染色共聚焦显微照片显示（图5a）：Cyto D处理组F-actin几乎完全解聚，纤维结构罕见；Jasp稳定聚合F-actin，束状结构比对照组更清晰明亮。Western blot也证实F-actin蛋白表达受影响，证明药物作用如预期（图5b）。细胞增殖实验显示Cyto D显著抑制增殖，Jasp促进生长（图4a）。细胞计数结果一致（图4b）。

检测ALP作为成骨早期标志物评估MSCs成骨分化能力。与对照组比，Cyto D降低ALP表达和活性，Jasp上调（图4c、d）。一致地，Jasp处理增加RUNX2和OSX蛋白水平，Cyto D相反（图4c）。mRNA水平上，成骨特异性基因RUNX2、ALP、OCN、OSX表达随药物处理呈相同趋势（图4e-h）。综上，F-actin在TiO₂纳米管诱导MSCs成骨分化中起重要作用。促进F-actin解聚抑制纳米形貌诱导的成骨分化，而稳定聚合F-actin增强成骨分化。

F-actin通过MKL1和YAP/TAZ调控TiO₂纳米管上MSCs成骨分化

为剖析F-actin调控MSCs命运的潜在机制，研究直接与F-actin相互作用或影响其聚合的蛋白/分子。首先探究纳米形貌如何影响F-actin与G-actin平衡。TiO₂纳米管作为物理信号不同于膜透性化学信号，必须利用细胞膜成分传递刺激入细胞。证据表明粘着斑复合物（含integrin、talin、FAK、VCL、tensin等）作为信号载体，告知细胞细胞外基质（ECM）状况从而影响生物行为。更重要的是，F-actin通过粘着斑复合物与integrin结合，形成细胞内肌动蛋白束与ECM的力学连接。因此分析粘着斑复合物成分表达。结果显示VCL和FAK蛋白和mRNA表达与F-actin变化一致，表明粘着斑复合物参与TiO₂纳米管诱导MSCs成骨分化（图5b、6a、b）。此外，RhoA（Rho家族小GTP酶）在Jasp处理组上调，Cyto D抑制（图5b、6a、b）。RhoA是MAPK通路重要上游信号转导分子，可被FAK调节。RhoA主要功能促进应力纤维（F-actin）聚合稳定和粘着斑复合物组装。综合提示TiO₂纳米管可通过粘着斑复合物和RhoA影响F-actin聚合。

但F-actin如何调控细胞命运？多数研究证实F-actin参与细胞迁移、分裂、内吞、特别是肿瘤细胞侵袭。鲜有研究提示F-actin可调控细胞分化，更不知其具体分子机制。我们检索F-actin变化相关文献发现：YAP/TAZ，Hippo信号通路中两个紧密相关的转录共激活因子，在细胞质和核间穿梭，可能作为机械转导器调控MSCs分化。此外，MKL1作为平滑肌细胞分化关键调节因子，与转录因子血清反应因子（SRF）相互作用，能结合G-actin并在细胞质和核间循环。最终结果确认YAP/TAZ和MKL1参与F-actin介导的纳米管诱导成骨分化（图5b、6d-f）。有趣的是，磷酸化YAP蛋白表达呈相反趋势，表明不仅YAP表达变化，其磷酸化也受Cyto D和Jasp影响（图5b）。这与YAP/TAZ磷酸化可被隔离在细胞质的报道一致。

综上，结果初步证实F-actin通过MKL1和YAP/TAZ调控TiO₂纳米管上MSCs成骨分化（图7）。

讨论

钛及钛合金因良好性能是骨科植入体最广泛使用的金属材料。但无菌松动仍是亟待解决的问题，关键可能在于改善植入体与宿主骨整合。前人研究表明表面涂层修饰或固定生物功能分子有益于骨整合。近年植入体表面形貌因细胞对物理线索响应研究而受关注。本研究证实纳米管促进MSCs成骨分化，且能力随内径增加（30-70 V）增强，将指导植入体表面纳米管直径设计。

作为形貌结构，纳米管首先改变材料物理性质如吸附容量、电热导率，这些决定工业应用。如高压变压器需填充绝缘材料（通常变压器油或绝缘气体），绝缘失效会导致严重放电事故。因此寻找准确检测变压器溶解气体或绝缘气体分解组分浓度和类型的有效方法，对监测运行状态必要。传统方法寻找过渡元素（富d电子）如Pd(111)等气体吸附材料。如今纳米管因良好气体吸附性能被广泛研究。He等发现CuO-BNNT适合吸附C₂H₂；TiO₂本身可作气体敏感材料，Gui等发现Co掺杂TiO₂增强气体吸附能力对C₂H₄展现优越吸附能力和电导率变化；Mn掺杂石墨烯对C₂H₂和CO检测能力增强。上述研究表明本实验制备的TiO₂纳米管在变压器运行状态监测领域有潜在应用，但其对气体吸附容量和电导率需进一步研究，特别是掺杂过渡元素（如Mn）后是否增强。

纳米级形貌除改变表面物理性质，还影响贴附细胞生物行为。细胞先粘附材料表面再迁移、增殖、分化。相比平坦表面，纳米管空心结构提供较少粘附位点。为稳定粘附并维持细胞内生物力学平衡，粘着斑复合物开始组装成熟，F-actin变得强韧稳定。

F-actin由G-actin单体聚合的线性聚合物微丝，是细胞骨架三大主要成分之一。作为力学加载结构，普遍认为参与细胞分裂、迁移、内吞、肿瘤侵袭，但近期研究显示也可影响细胞分化。例如，辛伐他汀诱导F-actin解聚促进软骨细胞分化；肌动蛋白解聚增强人间充质干细胞成脂分化。本结果显示，纳米管组MSCs F-actin水平更高、纤维结构更明显。Jasp促进F-actin聚合增强成骨分化，Cyto D解聚抑制成骨分化，提示F-actin介导TiO₂纳米管诱导MSCs成骨分化。

F-actin可被Rho GTPases（Ras超家族成员）调节，Rho通过至少两个效应因子ROCK和Dia诱导肌动蛋白重组。ROCK结合Rho-GTP激活，其底物肌球蛋白轻链（MLC）在F-actin组装中起重要作用。ROCK抑制MLC磷酸酶活性，增加MLC磷酸化，刺激肌球蛋白II ATPase活性促进F-actin组装。ROCK也靶向LIM激酶（LIMK），磷酸化LIMK使cofilin失活（活性cofilin可解聚F-actin）。另一效应因子Dia属formin-homology（FH）蛋白家族，含两个FH结构域，富含脯氨酸基序结合G-actin结合蛋白profilin，促进肌动蛋白聚合和F-actin组织。我们检测Rho GTPases之一RhoA，发现其表达与F-actin水平一致。但无法清晰描述纳米管如何调控RhoA表达，因存在许多其他调节因子，包括integrin信号、其他粘附受体、G蛋白偶联受体（GPCRs）、可溶性因子如LPA、受体酪氨酸激酶信号等。

已知F-actin可被RhoA调节，我们进一步询问粘着斑在该过程中的作用。粘着斑复合物含integrin、talin、vinculin、paxillin、FAK，细胞贴附纳米管表面时形成成熟。Integrin跨膜异二聚体耦合ECM与其他粘着斑蛋白促进细胞粘附。它们不只是简单钩子，还传递环境关键信号，与EGFR等其他信号共同促使细胞决定生物行为。这些信号进一步传递给直接连接粘着斑复合物的F-actin。一方面纳米级形貌致粘着斑组装成熟；另一方面FAK、Src激酶家族招募CRK等分子自调节粘着斑组装成熟。本结果显示F-actin解聚损害粘着斑形成成熟，提示粘着斑向肌动蛋白组装有反馈，符合文献报道。

但不应忽视粘着斑复合物蛋白具有信号转导功能。即纳米管可能直接通过信号级联调控基因表达，F-actin可能仅参与或受此过程影响。例如，FAK和Src双激酶复合物可调节Rho GTPases如RhoA，表明纳米管可通过integrin和FAK/Src复合物调节RhoA。此外Src作为非受体酪氨酸激酶，可磷酸化FAK酪氨酸925位点激活Ras（小GTP酶）。Ras激活多条生化通路，包括深入研究的MAPK通路和PI3K/AKT/mTOR通路。MAPK通路中Ras激活c-Raf，继而激活MAP2K，再激活MAPK1/2即细胞外信号调节激酶（ERK）。ERK进而激活血清反应因子（SRF）、c-Myc等转录因子参与调控生长分化。Runx2作为成骨分化关键转录因子也可被ERK调节，前期研究证实机械应变通过FAK-Erk1/2-Runx2通路促进BMSCs成骨分化。因此不能排除ERK在纳米管诱导成骨分化中发挥作用，仍需进一步研究。

F-actin在纳米管诱导分化中究竟扮演何种角色？一种可能是F-actin组装变化反向调节FAK水平，通过FAK-Erk1/2-Runx2通路诱导成骨分化，因为结果显示粘着斑复合物和肌动蛋白聚合变化趋势一致，表明它们作为整体响应细胞外环境。但其他可能性也存在，许多文章显示MKL1和YAP/TAZ位于肌动蛋白动态平衡下游。两者均在细胞质和核间穿梭，可能帮助将信号从细胞骨架转导至核。

MKL1又称心肌素相关转录因子A，对G-actin水平变化敏感。细胞质G-actin水平升高时，单体G-actin结合MKL1阻止其与SRF结合激活转录。SRF靶基因包括平滑肌肌动蛋白（SMA）等肌动蛋白及其他肌动蛋白结合蛋白，含c-fos、egr1等即刻早期基因。近期研究证实改变SRF活性可通过激活脂肪生成转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）调控成脂，也可通过IGF-1和Runx2信号调控成骨。

YAP和TAZ是Hippo信号通路中两个转录共激活因子，被确认为限制细胞增殖、控制器官大小和形态发生的重要调节通路。大肿瘤抑制基因1和2（LATS1/2）磷酸化它们，创建14-3-3蛋白结合位点，结合阻止其核输入。结果磷酸化YAP/TAZ滞留细胞质，阻止Ctgf、Areg等基因表达。此外研究显示YAP/TAZ可与T-box 5（TBX5）、RUNX2、p73相互作用调控基因表达。细胞粘附细胞基质蛋白可通过integrin/FAK/Src轴触发YAP核定位。本研究结果提示该通路可能参与纳米管诱导分化。应进一步研究integrin/FAK/Src轴下游介质以阐明具体机制。

另一方面，越来越多研究表明F-actin与Hippo信号相互作用，某种方式抑制YAP磷酸化，与本实验结果一致：促进F-actin聚合减少磷酸化YAP表达。我们假设参与G-actin与F-actin转化的ATP可能在YAP磷酸化中也起重要作用，有待研究。

理解上述可能分子机制后，可尝试解释本研究发现的实验现象。结果显示纳米管直径越大，促进成骨分化能力越强，与前人研究一致。原因在于直径越大提供细胞粘附位点越少，粘着斑复合物组装成熟程度越高，随之F-actin应力纤维强度和稳定性越大，这些结构增强促进成骨分化的信号。预测当纳米管直径过大导致细胞难以粘附时，该效应会显著减弱。同样，纳米管高度不一致会导致粘附位点变化和细胞骨架重排，进一步影响细胞分化。有趣的是，即使无纳米管修饰的平坦材料也能诱导细胞分化变化。多项研究证实粘着斑形成和应力纤维组织受基底刚度调节，YAP/TAZ在其中也起重要作用。显然integrin-粘着斑-F-actin轴在物理信号转化为细胞内化学信号中起作用。

综上，本结果证实F-actin通过MKL1和YAP/TAZ调控TiO₂纳米管上MSCs成骨分化，其靶基因部分解释MSCs增殖分化。信号网络无单一变化，任何变化受众多分子蛋白调节。一种生物行为必是系列信号通路调节结果。纳米管通过触发复杂信号网络诱导细胞分化，包括integrin、粘着斑蛋白、FAK、Src、Rho GTPase、MAPK通路、Hippo通路等已报告通路。至少同样重要的是，信号网络中存在许多反馈回路，下游信号可反馈调节上游信号。本研究发现vinculin和FAK可被F-actin组装反向调节，增加分子功能不确定性。更多分子机制细节有待进一步研究。

结论

结果显示：TiO₂纳米管促进MSCs成骨分化，且在一定范围内（30-70 V）随管径增加能力增强。F-actin通过MKL1和YAP/TAZ介导纳米管诱导的细胞分化，为细胞分化研究提供新见解。

数据与材料可用性

本研究使用和分析的数据集可向通讯作者合理请求获取。

缩略语

MSCs:

间充质干细胞

SEM:

扫描电镜

EDS:

X射线能谱分析

AFM:

原子力显微镜

ALP:

碱性磷酸酶

Cyto D:

细胞松弛素D

Jasp:

jasplakinolide

VCL:

vinculin

FAK:

粘着斑激酶

BCA:

双肉碱酸

PVDF:

聚偏二氟乙烯

Runx2:

Runt相关转录因子2

Osx:

Osterix

OCN:

骨钙素

YAP:

Yes相关蛋白

MKL1:

巨核白血病1

FBS:

胎牛血清

ECM:

细胞外基质

MLC:

肌球蛋白轻链

LIMK:

LIM激酶

FH:

formin-homology

GPCR:

G蛋白偶联受体

MAP2K:

丝裂原活化蛋白激酶激酶

ERK:

细胞外信号调节激酶

SRF:

血清反应因子

SMA:

平滑肌肌动蛋白

PPARγ:

过氧化物酶体增殖物激活受体γ

LATS1/2:

大肿瘤抑制基因1和2

TBX5:

T-box 5