靶向胶质瘤治疗：Gint4.T修饰DNA四面体递送多柔比星抑制PDGFRβ驱动的细胞增殖

摘要

胶质瘤因其浸润性生长是最致命的颅内肿瘤之一。因血脑屏障和血肿瘤屏障存在及药物靶向性不足，胶质瘤治疗效果差。DNA四面体（TDN）显示出药物递送巨大潜力，可能成为胶质瘤新型治疗策略。本研究利用TDN递送多柔比星（DOX）治疗胶质瘤。Gint4.T是一种能识别肿瘤细胞血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）的适配体，用于修饰TDN（Apt-TDN）实现靶向给药。TDN通过一步法自组装，尺寸小（10nm）带负电。胎牛血清测试显示其作为药物载体的稳定性。Apt-TDN可被U87MG细胞有效摄取。与DOX和DOX@TDN（TDN载DOX）相比，DOX@Apt-TDN（Gint4.T修饰TDN载DOX）显示更高早期凋亡率、更高细胞周期阻滞和对U87MG细胞更强细胞毒性。总之，研究发现DOX@Apt-TDN为胶质瘤患者提供具有临床应用前景的新型疗法。

引言

胶质瘤是源自神经上皮的肿瘤，是最常见的颅内恶性肿瘤。近1/3脑肿瘤为胶质瘤，约4/5原发性恶性脑肿瘤为胶质瘤[1-4]。目前胶质瘤最有效治疗是手术切除联合术后同步放化疗，但患者预后仍差。传统化疗因肿瘤靶向性差、血脑屏障（BBB）和血肿瘤屏障（BTB）并发症、药物靶向不足，疗效不佳。BBB是阻碍几乎所有大分子（包括药物和基因）进入脑实质并发挥作用的最重要因素。无法穿越BBB的药物需以足够高剂量给药以达到有效治疗浓度，但过量药物会导致严重全身副作用和非靶组织药物蓄积。现有常规抗胶质瘤药物靶向能力不足[3,4]。纳米颗粒作为最有前景的药物载体工具涌现。因尺寸优势纳米颗粒可穿越BBB发挥抗肿瘤作用。Kafa等人[5]设计靶向血管生成素（ANG）的化学功能化多壁碳纳米管（f-MWNTs），通过体内外实验证实其穿越BBB能力。但这些纳米材料可能分布至全身各器官甚至进入中枢神经系统（CNS），引起神经毒性[6]。

DNA因其组装可通过Watson-Crick碱基配对精确控制，是纳米结构构建理想材料[7]。目前已设计并演示多种二维（2D）和三维（3D）DNA纳米结构[8-10]。四面体DNA纳米结构（TDN）因生物相容性、稳定性、丰富功能化修饰位点和低免疫原性受关注[11-13]。Turberfield等人用一步法高产率合成DNA四面体纳米结构[14]。Walsh等人发现含核酸探针的DNA四面体无需转染试剂即可进入哺乳动物细胞[15]。Lee等人证明自组装四面体纳米颗粒可用于体内靶向siRNA递送[16]。TDN在分子诊断、分子递送和靶向药物治疗显示优异应用前景，也广泛用于乳腺癌等各器官肿瘤研究[17]。同样TDN也用于神经系统疾病研究。Tian等人[18]以DNA四面体为基础修饰血管生成素-2（ANG）成功构建纳米探针ANG-TDN，靶向低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP-1）实现靶向成像。研究显示ANG-TDN可穿越BBB。Ma等人[19]表明四面体DNA纳米结构无需转染剂即可进入神经干细胞（NSCs），促进神经干细胞迁移、增殖和分化[20]，在神经组织修复再生有巨大潜力。因此我们探讨TDN用于胶质瘤治疗及增强其靶向能力的可能性。

血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）是酪氨酸蛋白激酶家族重要成员，参与细胞增殖、迁移和血管生成。多项研究表明PDGFβ因其在血管生成中作用是抗肿瘤治疗有前景靶点[21,22]。适配体是系统进化配体指数级富集（SELEX）法产生的短单链DNA或RNA寡核苷酸。适配体类似抗体，对靶标有高亲和力和特异性[23]。因其独特性质，适配体在化疗药物、siRNA和载药纳米颗粒靶向递送中发挥重要作用。Gint4.T是一种能特异性结合PDGFRβ的RNA适配体，也是PDGFRβ特异性拮抗剂[24]。Monaco等人[25]表明Gint4.T适配体可穿越血脑屏障（BBB）特异性识别PDGFRβ。Gint4.T偶联聚合物纳米颗粒（PNPs）易被胶质母细胞瘤（GBM）细胞摄取。本研究报道一种结合Gint4.T适配体和TDN的新型载药系统。Gint4.T修饰TDN（Apt-TDN）载DOX（DOX@Apt-TDN）表现出对U87MG细胞增强的特异性细胞摄取和细胞毒性。

方法

材料

所有DNA寡核苷酸和2'F-Py RNA寡核苷酸购自上海桑杰生物工程有限公司，所有寡核苷酸序列见表1。GelRed DNA凝胶染色液购自桑杰生物。胎牛血清（FBS）和Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）购自美国Thermo Fisher。多柔比星（DOX）购自重庆梦得生物技术。U87MG细胞购自上海生命科学院细胞库。DAPI购自北京中山金桥生物技术。

DNA纳米结构制备

组装DNA四面体（表1），将各寡核苷酸（S1、S2、S3、S4）各2μL加入42μL TM缓冲液（10mM Tris-HCl，5mM MgCl₂，pH=8）。DNA溶液95°C加热5min，随后用Bio-Rad PCR仪（美国加州）冷却至4°C 2min[26,27]。TDN终浓度2μM。TDN'制备相同但S1替换为S1'。合成Apt-TDN时，将Gint4.T适配体等摩尔比加入TDN，37°C孵育60min。合成前适配体经短变性-复性步骤（85°C 5min，2min快速冷却，随后10min升温至37°C）[25]。

琼脂糖凝胶电泳

3%琼脂糖凝胶在0.5×TEB缓冲液中100V电泳30min。电泳仪放冰浴维持0°C。电泳前加GelRed染色DNA链。电泳结束用Bio-Rad荧光扫描仪（美国加州）成像。

动态光散射

用Malvern Zetasizer ZS90（英国Malvern）测定TDN流体动力学尺寸和zeta电位。1mL TDN（100nM）进行动态光散射（DLS）分析。

原子力显微镜成像

TDN用TM缓冲液稀释至100nM。各TDN样品10μL滴于新劈解云母上孵育10min。随后在原子力显微镜（AFM，Agilent 5500，美国）AC模式下成像。

制备TDN药物负载能力测定

多柔比星溶于去离子水配制500μM储存液。不同浓度多柔比星（1-20μM）与TDN（100nM）或Apt-TDN（100nM）室温（24-26°C）混合6h。混合液12,000×g离心10min得载药TDN。取50μL上清液与PBS 1:1混合。用Varioskan LUX酶标仪（美国加州）测多柔比星荧光强度（λ_ex=480nm，λ_em=590nm）确定上清液多柔比星量[28]。按标准曲线和荧光强度计算TDN负载多柔比星浓度。也按增加摩尔比混合多柔比星与TDN。

TDN体外血清稳定性

TDN与完全培养基混合37°C孵育0、2、4、6、8、10、12、24h。TDN与FBS 1:1混合37°C孵育1、3、5、7h。孵育后跑3%琼脂糖凝胶电泳。

TDN体外细胞毒性

测定TDN细胞毒性，U87MG细胞1×10⁴ cells/well接种96孔板。去除培养基，加入含0-500nM TDN新鲜培养基，过夜孵育后再孵育24h和48h。各孔加10μL CCK-8溶液孵育1h。酶标仪测450nm吸光度。

荧光成像

用荧光显微镜（Olympus，日本东京）研究DOX和TDN细胞摄取。U87MG细胞接种于24孔板盖玻片，含10%热灭活FBS和1%青霉素链霉素培养基，37°C、5%CO₂、湿润环境培养至少1天至≥75%融合。去除培养基，加含100nM Cy3-TDN和Cy3-Apt-TDN完全培养基孵育3h。TDN和Apt-TDN标记Cy3检测纳米颗粒细胞内摄取。评估DOX细胞摄取，加DOX（2μM）、DOX@TDN（2μM）、DOX@Apt-TDN（2μM）孵育3h。3h处理后细胞4%多聚甲醛暗处固定20min，随后DAPI染色5min。PBS洗涤三次荧光显微镜观察。

流式细胞术

1×10⁶ U87MG细胞接种6孔板。过夜孵育后去除培养基，加含100nM Cy3-TDN、100nM Cy3-Apt-TDN或100nM Cy3-Apt-TDN+1μM游离Apt培养基孵育3h。细胞4%多聚甲醛固定20min，流式细胞术分析Cy3阳性细胞百分比。

细胞周期与凋亡

DOX、DOX@TDN或DOX@Apt-TDN处理24h后，收集5×10⁵细胞75%冰冷乙醇固定过夜。细胞与RNase和碘化丙啶37°C暗处孵育30min。流式细胞术分析细胞周期。此外不同样品处理后细胞Annexin V-FITC/DAPI染色，分析早期凋亡。

CCK-8实验

测定细胞活力，U87MG细胞（5×10³）接种96孔板含100μL培养基，37°C、5%CO₂过夜培养。去除培养基，加含DOX、DOX-TDN或DOX-Apt-TDN新鲜培养基。24h孵育后加10μL CCK-8溶液再培养1h。酶标仪测450nm吸光度。

统计分析

所有实验重复三次，数据均以均值±标准差（mean±SD）呈现。用SPSS 24.0（IBM，美国）统计分析。Student's t检验确定显著差异，P<0.05为组间显著差异。

结果

TDN和Apt-TDN合成与表征

TDN通过四条寡核苷酸（表1）单步自组装，如前报道[18,29]。肿瘤靶向适配体Gint4.T通过Watson-Crick碱基配对修饰TDN。DNA四面体含四个面，每面由一条寡核苷酸形成。四条寡核苷酸相互杂交形成DNA四面体（图1a）。凝胶电泳显示泳道4和5单一显著条带，表明TDN和Apt-TDN成功构建。Apt-TDN迁移率比TDN降低，提示Gint4.T适配体成功修饰TDN。

DLS和AFM测定TDN和Apt-TDN尺寸。TDN和Apt-TDN粒径分别为10.1nm和13.5nm，反映Gint4.T配体添加（图1c A、B）。因流体动力学直径含水分子，粒子大于理论尺寸。AFM图像测定TDN和Apt-TDN高度均约2nm（图1b），表明适配体修饰未改变3D结构。TDN和Apt-TDN平均zeta电位分别为-5.69mV（C）和-7.3mV（D）（图1c C、D）。基于这些参数结论TDN和Apt-TDN成功组装。

TDN体外稳定性与细胞毒性

凝胶电泳显示TDN在完全培养基37°C孵育24h保持完整（图2a A）。FBS浓度增至50%时TDN至少7h稳定（图2a B），符合前人报道[18,26]。CCK-8实验评估U87MG细胞经不同浓度TDN处理后活力。图2b显示U87MG细胞与0-500nM TDN共培养24h和48h无显著细胞毒性。因此DNA纳米颗粒可作为稳定生物安全药物载体。

TDN和Apt-TDN药物负载能力

多柔比星是广谱化疗药可插入DNA双链。建立标准多柔比星曲线（图3a）后考察其插入TDN。TDN和Apt-TDN插入多柔比星量随多柔比星浓度增加渐增。多柔比星浓度14μM时TDN和Apt-TDN插入量峰值分别为5.5μM和6.0μM，随后趋平（图3b），表明DNA链完全饱和。同时按增加摩尔比混合多柔比星与TDN。扫描多柔比星荧光光谱分析。图3c显示摩尔比0.05时多柔比星荧光淬灭。据此推断单个TDN约含55个多柔比星分子，单个Apt-TDN约含60个多柔比星分子。

Apt-TDN靶向细胞摄取

DNA带负电大分子难以进入负电细胞膜。通常单个DNA分子需转染试剂辅助入细胞。此处用Cy3标记TDN和Apt-TDN监测纳米颗粒细胞内摄取。与U87MG细胞孵育3h后细胞质出现红色Cy3荧光信号，表明TDN无需转染试剂即可结合细胞膜并被摄取（图4a）。Apt-TDN红色荧光更强，提示Gint4.T适配体显著增加DNA四面体被U87MG细胞摄取。但加入游离适配体后Cy3荧光降至仅TDN水平。因游离适配体竞争性抑制，推断TDN上适配体无法促进TDN摄取。基于竞争性抑制证明Apt-TDN可靶向U87MG细胞。流式细胞术进一步证明Apt-TDN组Cy3阳性U87MG细胞百分比高于TDN组。游离Apt降低Apt-TDN组Cy3阳性U87MG细胞百分比（图4b）。

DOX@TDN和DOX@Apt-TDN细胞摄取

利用多柔比星特征荧光光谱评估药物摄取效率。3h处理后荧光显微镜成像细胞内多柔比星（图5a）。游离多柔比星可进入U87MG细胞定位于细胞核。加DOX@TDN后荧光高于游离多柔比星，提示DNA纳米颗粒增强多柔比星细胞摄取。加DOX@Apt-TDN后细胞核红色信号甚至高于DOX@TDN组。细胞内DOX摄取半定量分析进一步证实Apt-TDN促进细胞内DOX摄取较单药增加两倍以上。推断因Gint4.T特异性结合受体，更多纳米颗粒进入细胞。溶酶体消化后多柔比星释放至细胞质进一步在核内发挥作用。

DOX、DOX@TDN和DOX@Apt-TDN细胞毒性

细胞毒性研究中，三组U87MG细胞分别用不同浓度多柔比星处理（图6a）。DOX处理IC₅₀为13.39μM，DOX@TDN为7.826μM，DOX@Apt-TDN为4.205μM。三者中DOX@Apt-TDN 24h细胞毒性最高，表明Apt-TDN对U87MG细胞特异性。24h后收集DOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDN组细胞分析早期凋亡。数据显示DOX@Apt-TDN组早期凋亡率高于其他两组（图6b）。此外DOX-Apt-TDN组G0/G1期细胞比例较DOX和DOX-TDN组增加（p<0.01），S期细胞比例降低（p<0.01）（图6c）。G2期细胞比例无变化（数据未示）。

讨论

无论体外或体内实验，药物及其载体稳定性必须确定。TDN组装后首测体外稳定性。研究显示DNA纳米颗粒3D结构通过抑制酶结合提高血清稳定性。纳米结构生物安全性是应用首要要求。U87MG细胞与不同浓度TDN共培养24h或48h无显著细胞毒性。本研究用DNA序列不编码遗传信息，细胞毒性测试无副作用报道。因此TDN可作为安全稳定药物载体。

适配体修饰纳米结构靶向效率对癌细胞选择性药物递送至关重要。不同于抗体，适配体化学稳定、廉价、可大规模生产。且不同于其他材料，适配体易利用碱基互补原理结合DNA四面体。因此适配体与DNA四面体结合为靶向药物递送和下一代治疗奠基。结果显示TDN无需转染试剂即可入细胞，与Walsh等人和Ma等人结果类似[15,19]。与TDN相比Apt-TDN被U87MG细胞摄取显著增加。加入游离适配体后此增加消失。这提示Gint4.T是PDGFRβ特异性拮抗剂[25]。研究证实Gint4.T适配体因胶质瘤细胞表面高表达PDGFRβ可靶向U87MG细胞。Camorani等人[24]也显示Gint4.T适配体通过特异性与PDGFRβ胞外域相互作用靶向肿瘤细胞。Gint4.T适配体靶向优势在体外研究得到一定程度证实，但需进一步体内实验确认。研究也证实DOX@Apt-TDN细胞毒性强于DOX和DOX@TDN，可能源于两因素。首先Gint4.T适配体可特异性结合PDGFR胞外域，阻断肿瘤细胞增殖抑制肿瘤生长[24]。这与实验结果一致。与对照组相比，DOX、DOX@TDN、DOX@Apt-TDN处理后U87MG细胞周期G0/G1期肿瘤细胞显著增加，S期细胞减少，阻滞肿瘤细胞于G0/G1期，表明可抑制U87MG细胞周期和增殖。与DOX和DOX@TDN组相比DOX@Apt-TDN组抑制U87MG细胞增殖能力显著更强。此外Gint4.T特异性结合肿瘤细胞增强DOX@Apt-TDN复合物细胞靶向。因此可提高药物靶向效率、降低抗肿瘤药物全身给药剂量以防全身副作用。

结论

Gint4.T修饰提高TDN在胶质瘤治疗中特异性和效率，通过靶向胶质瘤细胞大量表达的PDGFRβ。此外载药Apt-TDN能显著促进DOX抗胶质瘤效果。因此DOX@Apt-TDN可作为胶质瘤患者有前景治疗策略。本研究不足仅在体外验证，后续将在动物模型进一步探索。