响应温度和 pH 值变化的双重刺激触发纳米凝胶以控制药物释放

介绍

刺激响应纳米载体通常被开发为用于治疗、成像和诊断的药物递送系统 [1, 2]。最近，包括 pH 值、温度、生物分子、氧化还原、磁场和紫外线在内的各种刺激已被用于通过内部或外部激活来诱导持续或受控的药物释放 [3,4,5,6]。在这些刺激中，pH 值和温度是药物递送和释放系统中最著名的方式。 Poly-N -异丙基丙烯酰胺 (PNIPAM) 是一种具有代表性的温度响应聚合物，已用于药物储库和释放系统。这种热敏聚合物具有改变其相行为的能力，由于在较低临界溶解温度 (LCST) 下水和酰胺官能团之间的氢键而表现出溶胀状态，并且相反地通过高于临界溶解温度的疏水相互作用表现出聚合物网络的收缩。 LCST [7,8,9]。此外，LCST 通常可以通过丙烯酸 (AAc) 或丙烯酰胺与 PNIPAM 的络合比例来控制 [10, 11]。具体来说，当 LCST 转移到更高的温度时，AAc 可以进行两个相变 [12, 13]。由于疏水相互作用，PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶在 LCST 以上开始收缩 [14, 15]。然而，由于电子间排斥和渗透压增加，AAc中羧基的去质子化导致纳米凝胶直径增加[16,17,18]。

PNIPAM 介导的药物递送系统已被开发用于生物医学领域的各种应用。由于可逆相变特性，温度或 pH 敏感的 PNIPAM 纳米凝胶已被用于优化药物吸附和递送过程 [19,20,21,22]。特别是，据报道，不同组织中的 pH 值被考虑用于口服给药，尽管不同组织内有更细微的变化 [23,24,25,26]。迄今为止，可以在多种刺激（例如 pH 值和温度）下产生协同响应的智能生物材料已显示出优于对单一刺激敏感的系统的优势 [27,28,29]。由温度敏感性引起的亲水性变化可以在环境pH值下自发地发生变化，随着共聚物和凝胶的LCST行为，它也可能在pH敏感性中起重要作用。

β-拉帕酮 (β-LP) 是一种天然化合物，在癌症治疗中显示出治疗活性 [30]。在生物医学中，β-LP 的功能化载体的设计旨在最大限度地减少其毒性作用。已经使用金、氧化石墨烯和 PNIPAM 开发了用于 β-LP 递送的各种载体 [31, 32]。迄今为止，加载 β-LP 的 PNIPAM 已应用于肝癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的化疗方案 [33,34,35,36]。虽然已经研究了几种 β-LP 载体，但相对复杂的制备程序是不受控制的或自发的 β-LP 释放部分限制了它们的效率。因此，开发用于生物医学应用的高效β-LP载体仍然是一项重要的任务。

在此，我们利用 PNIPAM 的热敏和 pH 敏感特性开发了一种双向控释系统。该给药系统由 PNIPAM 纳米凝胶与 AAc 内容物共聚组成，形成 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶。我们描述了 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶（方案 1）的自组装策略、载药和释放的示意图。 β-LP，一种模型药物，通过疏水相互作用被加载到 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶中。负载的 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶可以有效控制温度和 pH 值对 β-LP 的释放。 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶在体温下具有碱性 pH 值的成纤维细胞中显示出有效的抗增殖特性。加载在纳米凝胶中的β-LP具有热响应和pH响应结构，具有显着的治疗效果，因此PNIPAM修饰的纳米凝胶可以成为刺激响应药物递送和治疗肿瘤的良好候选者。

PNIPAM-co-AAc水凝胶温度和pH双重控释示意图

方法

材料

NIPAM (97%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 在室温下真空干燥。 N ,N '-亚甲基双丙烯酰胺 (MBA)、AAc、蒸馏水、乙醇 (EtOH)、过硫酸钾 (KPS)（98%，韩国大中）、β-LP（天然产品，韩国）和磷酸盐缓冲盐水 (PBS) ) 均为分析纯，无需进一步纯化即可使用。

PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶的合成

根据之前的报道[37]合成了PNIPAM-co-AAc纳米凝胶。在 500 mL 三颈圆底烧瓶中，将 2.26 g NIPAM 单体、0.154 g MBA 作为交联剂和 0 g、0.036 g、0.077 g、0.145 g AAc 加入 200 mL 蒸馏水中，然后溶解通过在 75°C 下用磁棒搅拌 30 分钟，然后分别合成 PNIPAM、PNIPAM-co-AAc5、PNIPAM-co-AAc10 和 PNIPAM-co-AAc20。通过氮气吹扫从混合物中除去氧气。为了引发反应，将 37.5 mg KPS 作为引发剂加入到溶液中，然后搅拌。回流冷凝器用于防止溶液因高温蒸发。加入 KPS 后 10 分钟内溶液变混浊。为了去除未反应的单体，用透析管 (12-14 kDa) 透析 7 天。用于透析的蒸馏水每天更换。所得材料液氮冷冻，冻干3 天，得到干燥的PNIPAM-co-AAc纳米凝胶。

β-LP 加载到 PNIPAM-co-AAc

将 1 毫克合成的 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶溶解在 1 mL 乙醇中，并将 0.1 mg β-LP 添加到溶解的 PNIPAM-co-AAc 中。将混合物在室温下在黑暗中剧烈搅拌过夜。搅拌后，未封装的 β-LP 用透析管 (6-8 kDa) 进行透析。透析后的纳米凝胶在液氮中冷冻并冻干 3 天。然后，将 1 mL PNIPAM-co-AAc 封装的 β-LP 注入透析管 (6–8 kDa)。为防止溶液损失，将管的末端密封。加入10 mL乙醇后，将制备好的透析管浸入PBS溶液中。

PNIPAM-co-AAc 的表征

通过透射电子显微镜 (TEM) 和场发射扫描电子显微镜 (FE-SEM) 确定形态。简而言之，在使用超声处理充分分散 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶后，将分散体滴在 300 目铜网格（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州，美国）上并蒸发过夜。然后，在 200 kV 的加速电压下获得 TEM 图像（JEM2100F，JEOL Ltd.，日本）。在 15 kV 的电子加速电压（JSM-7100F，JEOL USA）下扫描 SEM 显微照片。从傅立叶变换红外光谱仪（FT-IR，Nicolet 6700，日本）收集光谱。通过紫外-可见光谱仪（UV-1800，Shimadzu，Japan）计算从纳米凝胶中释放的 β-LP 负载和量。为了确认 LCST，使用动态光散射 (DLS)（ELS-2000ZS，Otsuka Electronics，Japan）以 1°C 的间隔精确测量纳米凝胶的尺寸和表面电荷的变化。

PNIPAM-co-AAc 的药物释放特性

为了研究 β-LP 的释放行为，将 10 mL 加载 β-LP 的纳米凝胶转移到透析管 (3.5 kDa) 中，然后在室温和 37°C 的 PBS 中搅拌。在规定的释放时间（0-12 小时），每个混合溶液中的 2 毫升样品通过紫外-可见分光光度计进行分析。在 UV-Vis 光谱仪中，使用 pH 为 2、4、7.4 和 8 的 PBS 将基线设置为 200-800 nm，并将 2 mL 包含在 PBS 溶液中的释放的 β-LP 添加到比色皿中。

通过温度和 pH 刺激的药物释放活性

通过 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 测定评估对细胞活力的双重影响。 NIH3T3成纤维细胞接种于96孔板（2 × 10 ⁴ 细胞/孔）并在 37°C 下培养过夜。然后用含有不同浓度的 β-LP 的游离 β-LP、PNIPAM-co-AAc5 和 PNIPAM-co-AAc20 的新鲜培养基替换培养基。孵育 3 小时后，将 MTT 溶液加入每个孔中并孵育 4 小时。然后，除去培养基，接着用增溶溶液处理。用酶标仪（EL800，Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA）测量 595 nm 处的吸光度值。通过荧光显微镜（IX37，Olympus，Japan）捕获活/死荧光图像。 NIH3T3 细胞 (1.5 × 10 ⁵ 细胞/孔）接种在μ-Slide 8孔（ibidi，Munich，Germany）中并培养过夜。更换培养基后，将 20 μg/mL 游离 β-拉帕酮、PNIPAM-co-AAc5 和 PNIPAM-co-AAc20（包括分散在培养基中的 β-LP）加入孔中。孵育 3 小时或 6 小时后，洗涤细胞，并通过 LIVE/DEAD® 活力/细胞毒性测定（Molecular Probes，Eugene，OR）评估细胞活力。

结果与讨论

PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶的制备

通过自由基聚合方法制备了具有三种不同 AAc 含量（5%、10% 和 20%）的 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶。 TEM 和 SEM 用于确认纳米凝胶的粒径、形态和单分散性。如图 1a 和 b 所示，PNIPAM-co-AAc5 纳米凝胶表现出相对均匀的尺寸分布，平均粒径约为 250 nm。此外，随着温度的升高，观察到基于 PNIPAM 的纳米凝胶的溶胶-凝胶转变。尽管 PNIPAM-co-AAc5 的水溶液在室温下仍为溶胶相，但纳米凝胶在加热时转变为凝胶相，导致溶液在 LCST 上方变得混浊（图 1c）。由于表面量的增加，PNIPAM、PNIPAM-co-AAc5、PNIPAM-co-AAc10 和 PNIPAM-co-AAc20 的 zeta 电位降低至 - 13.56 mV、- 16.61 mV、- 21.87 mV 和 - 23.62 mV AAc 含量提供的羧基（图 1d）。它还表明 PNIPAM-co-AAc 的流体动力学直径范围为 217-442 nm，因为 AAc 的含量增加到 30°C，因为与水的氢键和电子间排斥力增加。然而，由于疏水相互作用，纳米凝胶直径在 50°C 时会减小（图 1e）。这些结果表明 PNIPAM-co-AAc 的大小可以根据与 PNIPAM 相关的 AAc 的量和温度而变化。纳米凝胶的组成进一步通过 FT-IR 光谱表征，如图 2 所示。1100 cm ^-1 ~1200 厘米 ⁻¹ 峰值表示 C-N 弯曲。光谱还显示 -CH2 伸缩振动峰位于 1300 cm ^-1 ~1400 厘米 ⁻¹ . 1600 cm ⁻¹ 处的附加峰 ~1700 厘米 ⁻¹ 归因于 C=O，属于 NIPAM。具体而言，羧酸 (-COOH) 拉伸出现在 1700 cm ^-1 ~1800 厘米 ⁻¹ 除了 PNIPAM 纳米凝胶。 3200 cm ⁻¹ 处的宽峰 ~3300 cm ⁻¹ 显示了 N-H 拉伸的吸收。因此，由PNIPAM和AAc不同配比组成的PNIPAM纳米凝胶衍生物因AAc含量不同而具有不同的特性。

一 TEM 和 b PNIPAM-co-AAc5 纳米凝胶的 SEM 图像。 c PNIPAM-co-AAc5 纳米凝胶的物理外观。比例尺为 500 纳米。 d Zeta 电位和 e 在 30°C 和 50°C 下通过 DLS 测量的 PNIPAM 的平均直径，在 pH 7.4 条件下具有 0%、5%、10% 和 20% 的 AAc 含量

含0%、5%、10%和20% AAc含量的PNIPAM的FT-IR光谱

温度响应特性

为了研究温度行为，通过 DLS 评估了 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶的尺寸分布。在 30 到 50°C 的温度范围内测量流体动力学直径的变化以确定 LCST。具有 5%、10% 和 20% AAc 含量的 PNIPAM 具有两个不同的过渡步骤（图 3）。 PNIPAM-co-AAc 衍生物在 30°C 时开始第一个过渡步骤，然后在 40°C 左右进入第二个过渡步骤。此外，随着 PNIPAM 中 AAc 含量的增加，第二转变温度趋于增加。因此，PNIPAM-co-AAc20 的 LCST 处于 45°C 的相对较高的温度，而 PNIPAM 的 LCST 处于 32°C。 LCST 值的这种差异可能是由 PNIPAM-co-AAc 衍生物的负电荷增加引起的。然而，PNIPAM-co-AAc5 和 PNIPAM-co-AAc10 的 LCST 温度分别在 37°C 和 39°C 时几乎相同。因此，PNIPAM-co-AAc10 没有进一步用于评估药物释放性能。在 PNIPAM-co-AAc 衍生物中获得的 LCST 值与之前的研究相似 [37]。这些结果表明，PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶具有两个相变，并且由于界面 PNIPAM 链的疏水相互作用和通过 AAc 羧基的电子间排斥，含有 AAc 的 PNIPAM 的 LCST 转移到更高的温度。

a 流体动力学直径的温度依赖性 PNIPAM，b PNIPAM-co-AAc5，c PNIPAM-co-AAc10 和 d pH 7.4的PNIPAM-co-AAc20纳米凝胶

双控释药性能

为了比较 PNIPAM、PNIPAM-co-AAc5 和 PNIPAM-co-AAc20 的药物释放曲线，在室温 (24°C) 下 6 小时内测量了从 PNIPAM-co-AAc 衍生物中释放的 β-LP和体温 (37 °C)。最初，我们测量了 PNIPAM-co-AAc20 和 PNIPAM-co-AAc20（包括 β-LP）的 UV-Vis 吸收光谱，并观察到与 β-LP 对应的 257 nm 处的强吸收（附加文件 1：图 S1）。使用 β-LP 的标准浓度-吸光度校准曲线（附加文件 2：图 S2）[38、39]，发现 PNIPAM-co-AAc20 负载的 β-LP 的载药量约为 60%。如图 4 所示，从 PNIPAM-co-AAc 衍生物释放的药物累积百分比表明，与 PNIPAM 和 PNIPAM 相比，PNIPAM-co-AAc20 释放的 β-LP 量相对较低，其释放效率显着降低-co-AAc5 在两个温度下。然而，在处理后 2 小时内观察到大多数 PNIPAM-co-AAc 衍生物的饱和药物释放点。特别是，PNIPAM 纳米凝胶的药物释放效率受反应温度的影响很大。与室温相比，PNIPAM-co-AAc 衍生物在体温下表现出更高的药物释放效率。当反应温度超过 40°C 时，所有 PNIPAM 衍生物的累积药物释放显着更高也支持这一结果（附加文件 3：图 S3）。

在a温度下PNIPAM、PNIPAM-co-AAc5和PNIPAM-co-AAc20纳米凝胶中β-LP的累积释放 室温 (24 °C) 和 b 体温 (37 °C) 和 pH 值 7.4

如图 4 和表 1 所示，PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶在高温下可以很容易地释放药物，因为它们具有显着的收缩性。此外，在 PNIPAM 中观察到最高的体温下药物释放效率，其次是 PNIPAM-co-AAc5。两者都具有相对较低的 AAc 含量，导致 LCST 温度降低。特别是，我们观察到 PNIPAM-co-AAc20 中的 β-LP 在体温下以相对较低的效率 (61%) 释放，而在其他纳米凝胶中，大约 80% 的 β-LP 在相同温度下释放。这些结果表明，与 PNIPAM 和其他 PNIPAM-co-AAc5 相比，PNIPAM-co-AAc20 在体温下显示出最小的药物释放，同时尽可能多地包封。此外，这些结果也与确定 LCST 值的 PNIPAM 衍生物尺寸测量的温度依赖性变化一致。

接下来，我们评估了 PNIPAM-co-AAc20 是否可以通过 PNIPAM 响应的另一个因素 pH 控制药物释放，并在体温下最大程度地截留药物。 PNIPAM-co-AAc20 显示出大约 70% 的累积最大释放效率，与酸性或中性 pH 值相比，在 pH 值为 8 时增加了约 10%。同时，在 pH 7.4 和酸性 pH 之间没有观察到显着差异（图 5 和表 2）。总之，这些发现表明 PNIPAM-co-AAc20 的药物释放曲线可以通过控制 AAc 的含量来影响，这种双重控释纳米凝胶可以有效地调节在已知碱性 pH 值下的药物释放速率。存在于部分小肠[40]。

PNIPAM-co-AAc20纳米凝胶在不同pH值下β-LP的累积释放

药物释放特性评价

评估体外抗增殖以执行用于控制药物递送和释放的纳米材料的关键标准。如图 6 所示，对于相同浓度的 β-LP，游离 β-LP 显示出比负载 β-LP 的 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶更低的细胞活力。此外，PNIPAM-co-AAc20 纳米凝胶在 20 μg/mL 的浓度下表现出相对较高的细胞活力，因为与 PNIPAM-co-AAc5 纳米凝胶相比，PNIPAM-co-AAc5 纳米凝胶的β-LP 释放相对较低。 37°C。此外，该结果也与累积药物释放曲线一致。然后，我们使用荧光染色的活细胞和死细胞评估细胞活力（图 7）。活/死细胞染色试验表明，β-LP 和 PNIPAM-co-AAc5 纳米凝胶（包括 β-LP）在细胞活力方面相似，而 PNIPAM-co-AAc20 在 20 μg/mL 的剂量下显示出细胞活力的显着增加处理 3 小时后。然而，在 pH 8.0 下孵育 3 小时后开始观察到 PNIPAM-co-AAc20 的药物释放增强，并且在治疗后 6 小时期间在相同的 pH 下观察到显着的协同抗肿瘤活性。这些发现表明温度和pH双重响应的PNIPAM-co-AAc20纳米凝胶在控制末端小肠药物加载和释放方面具有潜在的应用价值。

载有不同浓度 β-LP 的 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶在 NIH3T3 成纤维细胞中在 37°C 下保持 3 小时的抗增殖活性

a NIH3T3 细胞毒性的荧光图像 未经处理，b 只有β-LP，c β-LP/PNIPAM-co-AAc5 和 d β-LP/PNIPAM-co-AAc20 在 pH 7.4 下处理 3 小时，以及 β-LP/PNIPAM-co-AAc20 处理 3 小时 (e ) 和 6 小时 (f ) 在 pH 值 8.0。活细胞和死细胞用钙黄绿素 AM（绿色）和乙锭同二聚体（红色）染色。比例尺为 100 μm

结论

我们开发了负载 β-LP 的 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶，其药物释放可以由温度和 pH 值触发。这些纳米凝胶衍生物是通过自由基共聚设计和制备的。 LCST 随 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶中 AAc 含量的增加而升高，这是因为 AAc 内容物上的羧基之间存在电子间排斥，导致 PNIPAM-纳米凝胶收缩并导致药物释放。负载有 β-LP 的具有高 AAc 含量的 PNIPAM-co-AAc 纳米凝胶在体温下表现出显着降低的体外释放曲线。此外，在碱性pH下可实现显着协同作用的药物释放。最后，我们证明了 PNIPAM-co-AAc20 具有最佳特性，在体温下降低了药物释放效率，但在 pH 8.0 下增加了药物释放，这得到了使用成纤维细胞的细胞活力测定的支持。因此，这种温度和pH响应性纳米凝胶可以促进在小肠生理pH下双控释药的有希望的应用，以及一种有吸引力的口服给药肠道靶向给药方式。

缩写

AAc：

丙烯酸

DLS：

动态光散射

FE-SEM：

场发射扫描电镜

FT-IR：

傅里叶变换红外光谱仪

KPS：

过硫酸钾

LCST：

降低临界溶解温度

MBA：

N ,N '-亚甲基双丙烯酰胺

PNIPAM：

Poly-N -异丙基丙烯酰胺

TEM：

透射电子显微镜

β-LP：

β-拉帕酮