简易制备rGO@Fe₃O₄微球实现磁靶向、近红外响应的化疗-光热联合癌症治疗

摘要

近红外（NIR）光响应型石墨烯在癌症光热消融治疗中展现出令人振奋的效果。本文报道了一种通过简易喷雾干燥和共沉淀法制备Fe₃O₄修饰的空心石墨烯微球（rGO@Fe₃O₄），用于磁靶向和近红外响应的化疗-光热联合治疗。该微球具有极高的比表面积（~120.7 m² g⁻¹）和大孔隙体积（~1.012 cm³ g⁻¹），显示出多柔比星（DOX）高达~18.43%的优异载药能力。rGO@Fe₃O₄微球的近红外触发光热效应呈开关式响应，并诱导出高光热转化效率。此外，微球上的Fe₃O₄表现出优异的肿瘤细胞靶向能力。基于rGO@Fe₃O₄/DOX的化疗-光热联合治疗在体外对Hela细胞显示出优越的细胞毒性。研究表明，rGO@Fe₃O₄/DOX微胶囊在联合化疗-光热癌症治疗中具有巨大潜力。

引言

癌症是世界上最恶性的疾病之一，也是导致人类死亡的主要原因[1, 2]。尽管化疗常用于临床癌症治疗，但疗效低和副作用大等关键问题严重限制了其应用[3]。药物递送系统（DDS）在增强药物溶解度、生物利用度和肿瘤富集方面显示出巨大优势，有望显著提高抗肿瘤疗效[4]。近年来，作为药物递送系统的空心微球因其大表面积和丰富的多孔结构而备受关注[5-8]，并利用创新技术设计了多种空心微球材料[9-13]。

氧化石墨烯（GO）作为一种新型无机非金属材料，因其良好的生物相容性、低成本和简易制备等独特特性，在药物递送领域被广泛研究[14-17]。值得注意的是，氧化石墨烯在近红外照射下能有效将光能转化为热能[18-20]，成为改善癌症光热治疗效果的有前景策略。Chen课题组报道GO可通过非共价相互作用（如π-π堆积、氢键和静电吸附）递送抗癌药物[21]。然而，二维GO纳米片因巨大的比表面积和层间范德华力易团聚[17, 22]，导致水溶性差和载药能力下降。已有策略旨在克服这些缺陷。Tsukruk课题组利用层层组装技术开发了石墨烯空心胶囊[23]，与其他GO材料相比显示出极高的载药量，这归因于由GO稳定的空心胶囊的高比表面积和大孔隙体积。但鲜有报道涉及具有三维连通孔结构的GO用于药物递送的研究。

虽然许多报道的药物递送系统展示了优异的载药能力和可控释药行为，但因对肿瘤组织靶向特异性不足，其临床前研究和应用也受限[24]。在各类靶向递药系统中，Fe₃O₄作为一种磁靶向材料，因其高磁响应、稳定性好和易制备，在癌症治疗中被广泛应用[25-29]。Ni课题组开发了具有超顺磁性的Fe₃O₄@SiO₂核壳结构纳米颗粒用于肿瘤磁靶向[30]。此外，Fe₃O₄锚定的GO纳米颗粒在磁靶向递送和光热治疗的结合方面研究深入[31-34]。

本研究报道了一种开发药物递送平台的先进策略，构建氧化铁修饰的rGO空心微球（rGO@Fe₃O₄），实现磁靶向和近红外触发的光热治疗（PTT）。如方案1所示，rGO@Fe₃O₄空心微球通过三步制备：首先，利用SiO₂为模板通过喷雾干燥法合成rGO-SiO₂，再经HF蚀刻去除SiO₂得到rGO空心微球；随后，通过共沉淀法将Fe₃O₄纳米颗粒锚定在rGO空心微球上构建rGO@Fe₃O₄微球。该系统中，rGO作为近红外触发的PTT剂，Fe₃O₄赋予向Hela细胞的磁靶向性。基于孔吸附和π-π堆积封装多柔比星（DOX）的微球（rGO@Fe₃O₄/DOX）预期具有超高载药量和pH响应释药行为，光热-化疗联合可显著增强抗癌效果。

材料与方法

材料

氯化铁六水合物（FeCl₃·H₂O）、氢氧化钠（NaOH）、硫酸亚铁七水合物（FeSO₄·7H₂O）购自国药集团化学试剂有限公司。Hela细胞来源于天津肿瘤医院。磷酸盐缓冲液（PBS）、盐酸多柔比星（DOX·HCl）、Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM）、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自索莱宝科技有限公司。SiO₂（~300 nm）购自上海远江化工公司。氧化石墨烯去离子水溶液（2 mg/ml）为南京先锋公司商业产品。

rGO@Fe₃O₄微球制备

利用SiO₂（300 nm）为模板通过喷雾干燥法制备空心石墨烯微球。简述：将100 mL SiO₂悬浮液（50 mg mL⁻¹）在剧烈搅拌下缓慢滴加至300 mL GO水溶液（2 mg mL⁻¹）中，混合液在喷雾干燥器中于200°C喷雾干燥。随后产物在Ar保护下300°C保温2 h得到rGO-SiO₂。为去除SiO₂，将rGO-SiO₂置于10% HF溶液中于60°C浸泡48 h。固体产物经多次洗涤，在真空干燥箱中60°C干燥12 h，最终获得rGO，收率75%。

通过共沉淀法制备rGO@Fe₃O₄纳米颗粒。典型工艺：0.27 g FeCl₃·H₂O、0.28 g FeSO₄·7H₂O和0.1 g rGO空心微球溶于10 mL去离子水中，于50°C搅拌30 min。随后缓慢加入60 mL NaOH（0.15 mol L⁻¹），于50°C持续搅拌12 h。产物经磁分离，用去离子水和乙醇反复洗涤数次，60°C真空干燥12 h。

结构表征

利用场发射扫描电镜（FE-SEM, Hitachi, S-4800）和透射电镜（TEM, JEM2100F, JEOL）分析样品尺寸和形貌。X射线衍射（XRD, D8 Focus, Cu Ka射靶, Bruker, 德国）以12°/min扫描速率在10-80°范围分析产物组成。X射线光电子能谱（XPS）在XPS能谱仪（Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, 美国）上测定。傅里叶变换红外光谱（FT-IR, AVATAR360, Nicolet）在500-4000 cm⁻¹范围、4 cm⁻¹分辨率下记录。磁性测量使用超导量子干涉装置（SQUID, Quantum Design MPMS）磁强计在室温（300 K）下进行。拉曼光谱使用拉曼光谱仪（Renishaw, inVia Reflex, 英国）以532 nm激光采集。热重分析仪（TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600）评估rGO含量。比表面积采用Brunauer-Emmett-Teller（BET）法测定。UV-Vis光谱用Beckman DU 800核酸/蛋白分析仪（Beckman Instruments, Inc., Rosemead, CA）记录。

DOX载药与释放

将模型化疗药物多柔比星（DOX）封装入rGO@Fe₃O₄核中评估体外载药释药行为。rGO@Fe₃O₄/DOX制备参考文献方法：将10 mL（0.2 mg mL⁻¹）DOX水溶液加入10 mg rGO@Fe₃O₄溶液，超声均质确保无显著沉淀。混合液在往复振荡器（SK-O180-Pro）上以150 rpm平衡24 h。6000 rpm离心10 min后除去未载入DOX，上清液经UV-Vis分光光度计测定载药量。DOX在490 nm处OD值用于计算载药效率（LE）和载药量（LC）：

LE = (DOX总量 - 游离DOX) / DOX总量

LC = (DOX总量 - 游离DOX) / rGO@Fe₃O₄/DOX量

体外释放研究：将rGO@Fe₃O₄/DOX（10 mg）置于透析袋（MWCO = 1000）中，含pH 5.4、6.5或7.4的磷酸盐缓冲液（PBS, 30 mL），置于37°C水浴中以80 rpm振荡。定时取3 mL释放介质，于480 nm测定UV-Vis计算释放DOX量。

近红外触发rGO@Fe₃O₄微球光热效应

为考察rGO@Fe₃O₄剂量对近红外触发光热效应的影响，分别用不同浓度（0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg mL⁻¹）的rGO@Fe₃O₄溶液在2 W cm⁻²近红外激光照射5 min。进一步评估近红外能量对光热效应的影响：用不同功率（1, 1.5, 2 W cm⁻²）照射0.25 mg mL⁻¹ rGO@Fe₃O₄ 5 min。实时温度用FLIR I5红外热像仪测量。

体外细胞摄取

Hela细胞接种于35 mm²共聚焦培养皿，密度1×10⁵ cells/well。于培养箱（5% CO₂, 37°C）培养24 h后更换含rGO@Fe₃O₄/DOX微球和rGO@Fe₃O₄/DOX+磁铁的新鲜培养基，继续培养5 h。rGO@Fe₃O₄/DOX浓度0.1 mg mL⁻¹。用冷PBS（pH 7.4）洗涤三次，4%多聚甲醛固定20 min（CLSM, TCSSP5II, Leica, 德国）。

细胞活力检测

近红外处理后用CCK-8法评价细胞毒性。Hela细胞接种于96孔板（5×10³ cells/well），100 μL培养基中于5% CO₂, 37°C培养24 h。生物相容性评估：rGO@Fe₃O₄浓度梯度0.01-0.2 mg mL⁻¹；单光热治疗组：同浓度梯度rGO@Fe₃O₄并照射近红外10 min（2 W cm⁻², 808 nm）；联合光热-化疗组：rGO@Fe₃O₄/DOX浓度梯度0.01-0.2 mg mL⁻¹并照射近红外10 min（2 W cm⁻², 808 nm）。继续孵育24 h或48 h。用PBS洗涤后加入含10 μL CCK-8的100 μL DMEM培养基再孵育40 min。酶标仪在450 nm检测活率。所有实验三重复。

结果与讨论

合成与形貌表征

rGO@Fe₃O₄微球制备分三步：首先喷雾干燥法以SiO₂为模板合成rGO-SiO₂微球。SEM和TEM表征形貌：Fig. 1a显示rGO-SiO₂微球直径~3 μm，呈均一球形，由众多拥挤的SiO₂纳米颗粒（~300 nm）组成。TEM数据和动态光散射测得的流体动力学直径亦证实此结果（Fig. 1d, g）。随后以300°C加热和HF蚀刻去除SiO₂得空心rGO微球。因SiO₂溶解可观察到~300 nm的明显孔隙（Fig. 1b, e）。最后通过共沉淀法利用Fe₃O₄的磁靶向能力将其修饰在多孔rGO上。SEM和TEM观察到Fe₃O₄负载后孔径显著减小（Fig. 1c, f），为药物递送和可控释放提供可行性。值得注意的是，rGO-SiO₂、rGO、rGO@Fe₃O₄的粒径和流体动力学粒径分布在处理过程中无显著变化（Fig. 1g, h, i）。

结构与成分表征

为进一步确证rGO@Fe₃O₄成功制备，采用SEM-EDS研究微球结构组成。rGO@Fe₃O₄的EDS图谱通过可视化元素O、Fe、C的非弹性散射电子在能量损失窗口中的分布，不同颜色区域分别代表O、Fe、C富集位置。Fig. 2a, b显示Fe和O在rGO@Fe₃O₄微球中广泛分布且负载密度高。Fig. 2d证实Fe₃O₄纳米颗粒（~18 nm）均匀分散于rGO中，导致rGO@Fe₃O₄微球孔径急剧减小。选区电子衍射（SAED）进一步验证Fe₃O₄存在于rGO中（Fig. 2e），2.98, 2.53, 2.09, 1.62, 1.49 nm的特征面间距分别对应Fe₃O₄面心立方相的220, 311, 400, 511, 440晶面。XRD谱图亦检测到220, 311, 400, 511, 440对应Fe₃O₄的衍射峰，与SAED结果一致（Fig. 2c）。但文献报道Fe₃O₄和γ-Fe₂O₃因特征峰位置相同无法仅靠XRD区分[35]。XPS显示rGO@Fe₃O₄中725.9/724.5 eV和714.1/711.0 eV的主峰分别对应Fe 2p₁/₂和Fe 2p₃/₂（Fig. 2g, h），表明Fe₃O₄中Fe³⁺和Fe²⁺共存[36]。热重分析（TGA）在空气气氛中将样品加热至800°C再冷却至100°C监测rGO在rGO@Fe₃O₄中的热降解行为（Fig. 2f）。失重曲线显示两个明显失重区：脱水区（40-300°C）和rGO在rGO@Fe₃O₄中的脱挥发分区（300-800°C），样品碳含量计算为25.6 wt.%。

利用超导量子干涉装置研究rGO@Fe₃O₄微球磁性。磁场扫描范围-20,000至20,000 Oe，室温下。Fig. 2i显示Fe₃O₄饱和磁化强度（Ms）66.6 emu g⁻¹，矫顽力（Hc）9.3 Oe。负载Fe₃O₄后rGO@Fe₃O₄微球的Ms和Hc分别降至33.9 emu g⁻¹和7.44 Oe。磁饱和显著下降归因于rGO在rGO@Fe₃O₄中的抗磁性。此外，磁分离实验直观展示rGO@Fe₃O₄微球的选择性聚集能力：Fe₃O₄和rGO@Fe₃O₄悬浮液置于外磁场侧2 min可浓缩至磁铁侧且水溶液变透明；移去磁铁后缓慢振荡可使rGO@Fe₃O₄微球重新均匀分散，表明其具备良好的水分散性。优异的水分散性和磁响应性为rGO@Fe₃O₄作为药物载体在癌症治疗中的磁靶向应用铺平道路。

光热效应分析

考虑到近红外光对组织穿透深、周围组织损伤小，常用于肿瘤光热治疗。故记录不同浓度和功率密度下rGO@Fe₃O₄水溶液在808 nm近红外激光照射5 min的光热转化行为。Fig. 3a, b显示rGO@Fe₃O₄温升高度依赖浓度和激光功率密度。微球浓度达1 mg mL⁻¹时，2 W cm⁻²照射5 min温度从27.9升至70.3°C，PBS组仅从31.7升至36.2°C。rGO@Fe₃O₄的高光热转化效率据前人报道（蛋白变性和DNA损伤在50°C暴露4-6 min发生[21, 37]）在肿瘤光热治疗中潜力巨大。为直观展示光热转化行为，进行红外热成像（Fig. 3c）。1 mg mL⁻¹ rGO@Fe₃O₄溶液经5 min近红外照射迅速升至70.3°C，水组无明显变化，与测温结果一致。进一步研究光热稳定性：在2 W cm⁻², 808 nm激光下进行六次开关循环（Fig. 3d）。获得相同温升，表明rGO@Fe₃O₄复合材料具有完美的近红外光热稳定性。结果证明rGO@Fe₃O₄微球作为光热剂在癌症光热治疗中极具前景。

药物载入与释放

通过BET和BJH分析评估rGO@Fe₃O₄比表面积和孔径（Fig. 4a, b）。N₂吸附-解吸等温线为IV型，比表面积120.7 m² g⁻¹，孔径2-8 nm，孔隙体积1.012 cm³ g⁻¹。结果表明rGO@Fe₃O₄具有介孔通道和平均孔径分布，展现抗肿瘤药物载药巨大潜力。随后利用多孔结构的rGO@Fe₃O₄微球通过简单混合和轻微超声载入模型化疗药多柔比星。ATR-FTIR分析进一步验证DOX在rGO@Fe₃O₄中稳定掺入：DOX的-COOH和苯环特征峰分别在1726 cm⁻¹和1618 cm⁻¹处出现共振（Fig. 4c）。SEM观察显示DOX载入后归属于DOX的N元素新信号在微球中均匀分布（Fig. 4d, e）。rGO@Fe₃O₄/DOX的载药效率（LE）92.15%，载药量（LC）18.43%。远高于许多药物载体的LC归因于极高比表面积和孔径[19]。高LE可能源于两方面：一是rGO@Fe₃O₄与DOX通过sp²杂化π键与DOX喹啉部分的强π-π堆积相互作用[21]；二是rGO@Fe₃O₄的羧基（-COOH）、羟基（-OH）与DOX的氨基（-NH₂）、羟基（-OH）形成氢键。随后在pH 7.4, 6.5, 5.4的PBS中监测DOX释放行为，模拟肿瘤和正常组织的细胞外环境。Fig. 4f显示pH从7.4降至5.4时DOX释放速率加快，pH 5.4下98 h累计释放达73%。故rGO@Fe₃O₄释放DOX呈pH依赖性。酸性条件下加速释放可能因DOX羟基和氨基部分质子化，导致药物溶解度增加和DOX与石墨烯间氢键减弱[38]。此外研究近红外响应释药行为（Fig. 4g）：近红外辐射加速DOX释放，释放率达85%。这种pH和近红外双刺激响应行为在向肿瘤部位有效递药中起重要作用。

体外细胞摄取

为验证rGO@Fe₃O₄微球中Fe₃O₄的磁靶向能力，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）定性研究有无磁场处理下的细胞摄取。Hela细胞与rGO@Fe₃O₄/DOX共孵育4 h，细胞核用DAPI染色。Fig. 5结果显示：施加磁场组中观察到对应rGO@Fe₃O₄微球的黑斑和明显的DOX红色荧光信号；无磁场组黑斑较少、DOX荧光较弱。解释为磁铁促进了归属于rGO@Fe₃O₄的黑斑内化入细胞。结果表明rGO@Fe₃O₄/DOX中的Fe₃O₄能高效特异性靶向Hela细胞并显著增强微球细胞内化，展示了药物递送系统在癌症治疗中良好的磁靶向能力。

体外细胞毒性分析

用CCK-8法评价rGO@Fe₃O₄对Hela细胞的生物相容性。Fig. 6a显示：宽浓度范围孵育rGO@Fe₃O₄后细胞活率仍高于90%，即使高浓度达200 μg mL⁻¹，表明rGO@Fe₃O₄生物相容性高，可作为高效药物递送平台。进一步研究近红外照射（808 nm, 10 min）下孵育24 h和48 h的光热治疗疗效。Fig. 6b显示：近红外刺激下光毒性明显呈剂量依赖性，24 h细胞活率从90.37%降至35.52%，48 h从93.77%降至31.75%，暗示rGO@Fe₃O₄具有优异光毒性，在光热治疗中极具前景。为评估光热-化疗联合疗效，研究有无近红外照射下rGO@Fe₃O₄/DOX对Hela细胞的细胞毒性。Fig. 6c, d显示：细胞活率呈浓度依赖和时间控制方式。无近红外照射下，rGO@Fe₃O₄/DOX和游离DOX在24 h分别杀灭约65%和80% Hela细胞，rGO@Fe₃O₄/DOX肿瘤杀伤力低于游离DOX可能因微球延迟释药行为。近红外照射（808 nm, 10 min）后，等效DOX剂量（30 μg mL⁻¹）下rGO@Fe₃O₄/DOX+激光组杀灭细胞超86%。48 h同处理下，DOX、rGO@Fe₃O₄/DOX、rGO@Fe₃O₄/DOX+近红外组细胞活率降幅分别为80%、76%、90%，表明联合光热-化疗具有协同效应。

结论

总之，我们探索了一种简易策略构建基于rGO的药物递送平台rGO@Fe₃O₄/DOX用于协同光热-化疗。rGO@Fe₃O₄/DOX微球展现优异的近红外触发PTT效应和完美的近红外光热稳定性。微球上的Fe₃O₄确保优异的肿瘤细胞靶向能力。DOX可封装入rGO@Fe₃O₄实现超高载药量，同时达到pH响应释药行为。此外，化疗与光热治疗联合实现增强抗肿瘤效果。因此，该多功能药物递送平台有望成为未来肿瘤靶向和联合癌症治疗的有前景候选者。