双整合素 αvβ 3 和 NRP-1 靶向顺磁性脂质体，用于磁共振成像中的肿瘤早期检测

介绍

磁共振成像 (MRI) 在早期检测实体瘤中起着至关重要的作用，因为它提供了比计算机断层扫描 (CT) 和正电子发射断层扫描 (PET) 更好的空间分辨率 [1]。此外，顺磁造影剂如钆-二亚乙基三胺五乙酸 (Gd-DTPA) 的应用进一步提高了信噪比 (S/N) [2, 3]。然而，MRI在肿瘤早期诊断中的特异性低仍是一个问题。

脂质体可以在水环境中携带亲水性“货物”，其脂质双层中集成了两亲性或亲水性试剂。脂质体保护其内容物免于与血浆中的成分相互作用，从而延长亲水“货物”的生物半衰期；因此，脂质体在 MRI 中被更频繁地用作造影剂的载体 [4,5,6]。此外，通过将肽、抗体、适体或小分子与脂质双层结合 [7,8,9]，可以改变脂质体表面的特性，以增强它们在“货物”递送或靶向特定细胞和组织中的活性 [10] , 11]。对于靶向肿瘤，肽通常用于附着在诸如 ανβ3-整合素、血管内皮生长因子受体 (VEGF-R) 和半乳糖凝集素-1 等蛋白质上，这些蛋白质在内皮细胞和无数肿瘤细胞中均过表达 [12,13] ,14]。通过靶向和干扰这些蛋白质，有望阻断实体瘤中的血管生成过程，进而抑制肿瘤细胞的生长和转移 [15,16,17,18]。这些过表达的蛋白质也是分子成像的有吸引力的候选物，可以在早期识别肿瘤定位[19,20,21]。

然而，肿瘤血管生成的各种受体的异质表达可能会干扰单靶向探针的靶向能力[22]。为了解决这个问题，双受体的同时靶向可以扩大识别细胞的数量，并通过将两种不同的配体与同一细胞表面上的受体结合来提供增强的结合亲和力。理论上，双靶向载体可以有效地将更多的造影剂输送到肿瘤部位进行分子成像[23,24,25,26]。

在我们之前的研究中，带有共轭 Arg-Gly-Asp (RGD)-脂肽的顺磁性脂质体可以有效地将足量的造影剂输送到肿瘤中 [27]。因此，我们假设通过在肿瘤血管生成中同时靶向两种分子，例如 αvβ3-integrin 和neuropilin-1，可以增强基于顺磁性脂质体的肿瘤 MR 成像的信号。用于 ανβ3-整合素的 RGD 的两个高亲和力配体和用于神经纤毛蛋白-1（NRP1，VEGF-R 共同受体）的 Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg（ATWLPPR，A7R）被功能化为脂质体通过与 6-氨基己酸 (C6)-棕榈酸 (Pal) 结合。通过体外和体内试验，将这些双靶向 Gd-DTPA 包裹的脂质体与纯 Gd-DTPA、非靶向和单靶向脂质体进行比较。

材料和方法

化学品

卵磷脂酰胆碱（C40H82NO9P，卵 PC，MW 775 Da）和 N-（羰基-甲氧基聚乙二醇-2000）-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（mPEG2000-DSPE，MW 2788 Avanti Da）极性脂质 (Alabaster, AL, USA) 和胆固醇 (C27H46O, MW 386 Da) 购自 Bio Basic (Ontario, Canada)。钆喷酸二甲胺盐注射液（Gd-DPTA，Magnevist）购自拜耳先灵制药（德国柏林）。多肽和偶联物由易生源（中国上海）合成。

肽和结合物

三种肽包括双靶向肽 P1 (GARYCRGD 差价合约ATWLPPR , MW 2435 Da)，单靶向肽 P2 (GARYCRGD CFDG，MW 1670 Da）和单靶向肽 P3（ATWLPPR，MW 1191 Da）。肽与6-氨基己酸（C6）-棕榈酸（Pal）结合，Pal-C6-P1、Pal-C6-P2和Pal-C6-P3的靶向肽均使用芴基甲氧基羰基（FMOC）合成固相合成化学。 HPLC证实肽纯度> 90%。

脂质体制备

采用薄膜水合法制备脂质体。脂质体的组成为鸡蛋PC/胆固醇/mPEG2000-DSPE，摩尔比为1.85/1/0.15。将三种组分混合溶解在氯仿中，37°C 下蒸发溶剂，在圆瓶底部形成薄膜。薄膜在室温下干燥过夜。为了制备靶向脂质体，将肽溶解在二甲基亚砜 (DMSO) 中，然后在氯仿中稀释（最终 DMSO 浓度为 1%）。 P1-Gd-LP、P2-Gd-LP、P3-Gd-LP 和 P2/P3-Gd-LP 的脂质体将 Pal-C6-P1 添加到 4.5 μg/μmol 肽/总脂质比 Pal-C6 -P2 至 3 μg/μmol 肽/总脂质比，Pal-C6-P3 至 2.5 μg/μmol 肽/总脂质比，Pal-C6-P2 和 Pal-C6-P3 至 3 和 2.5 μg/μmol肽/总脂质比率，分别。在制备顺磁性脂质体时，将薄膜与 Gd-DTPA 水溶液水合，然后将悬浮液通过微型挤出机（Avanti Polar Lipids，美国）依次挤出 0.4 μm、0.2 μm、0.1 μm 聚碳酸酯膜 10 次。通过以 10,000×g 离心去除未包封的 Gd-DTPA 在 - 4°C（Avanti J-E，Beckman Coulter，CA，USA）通过 100,000 MWCO、Amicon Ultra-15（Millipore，MA，USA）的超滤离心管。最终悬浮液包括非靶向脂质体 (Gd-LP)、双靶向脂质体 (P1-Gd-LP)、单靶向脂质体（P2-Gd-LP 或 P3-Gd-LP）和混合单靶向脂质体脂质体 (P2/P3-Gd-LP) 在 4°C 下在氮气下储存。

脂质体表征

通过使用亚微米粒度分析仪（Zetaplus，Brookhaven Instruments，USA）确定制备的脂质体的尺寸分布。通过透射电子显微镜（TEM，JEM-1230，JEOL，Tokyo，Japan）在乙酸双氧铀染色中观察脂质体的形态。钆的浓度采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES，Optima 7000DV，PerkinElmer，USA）测定。

T1 松弛度的测量

脂质体悬液的 T1 加权图像是使用 3.0 特斯拉核磁共振分析仪（Philips，GE，USA）获得的。将纯 Gd-DTPA、Gd-LP、P1-Gd-LP、P2-Gd-LP 和 P3-Gd-LP 溶液分别用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 稀释至钆浓度为 1 × 10 ^{- 3} mM 至 1 × 10 mM Gd/L。为了测量纵向弛豫 T1 (s)，使用反转恢复自旋回波 (STIR) 序列，10 个不同的反转时间 (TI) 范围从 200~9000 ms，其他扫描参数如下：重复时间 (TR) 10000 ms，回波时间 (TE) 7.6 ms，视野 (FOV) 2 × 2 cm ² ，矩阵尺寸 320 × 320，切片厚度为 5.0 mm。 T1relaxivity (s ⁻¹ mM ⁻¹ ) 可以通过以下公式得到：r1 =(R1obs-R1m)/C。 R1obs 和 R1m 是弛豫率 R1 (s ⁻¹ )的制剂和相应的基质，C是钆的浓度(mM)。

细胞系和培养

A549 细胞（人腺癌细胞）和 HUVEC（人脐静脉内皮细胞）均表达 ανβ3-整合素受体家族和神经纤毛蛋白-1 受体，由同济大学医学院（中国上​​海）癌症研究所提供。细胞在 Dulbecco's Modified Eagle 培养基（DMEM，Invitrogen，美国）中培养，补充有 10% 新生牛血清和 100 U mL ^-1 青霉素和 100 μg mL ⁻¹ 链霉素 37°C，5% CO2。细胞在6孔板中培养至80-90%汇合。

细胞摄取和竞争结合

将钆浓度为 10 mM 的五种顺磁性脂质体，包括 Gd-LP、P1-Gd-LP、P2-Gd-LP、P3-Gd-LP 和 P2/P3-Gd-LP 在 37°下施用于 HUVEC 和 A549 细胞C 4 小时。 PBS 冲洗两次后，加入硝酸，然后将培养基中的细胞在 65°C 下硝化过夜。在竞争性结合试验中，相应的游离肽与偶联的脂质体和细胞同时孵育。 ICP-OES测定钆终浓度。

MRI 体内检测能力

所有动物程序均符合《实验动物护理和使用指南》。 4周龄雌性BalB/C裸鼠（SLAC，上海，中国）皮下注射A549细胞（1 × 10 ^-4 每个小鼠的细胞）在右侧。当肿瘤大小达到50-100 mm ³ ，荷瘤小鼠被随机分为五组（每组n =5)。对于 MR 成像，小鼠用 10% 氨基甲酸乙酯 (m/v) 腹膜注射麻醉，并在 1.5 特斯拉核磁共振分析仪（飞利浦，GE，美国）上进行扫描。首先，使用以下程序获取 T2 加权图像以定位肿瘤：TR =7.3 ms，TE =2.7 ms，FOV =12.0 × 12.0 cm ² , 切片厚度 =2 mm, 矩阵尺寸 =256 × 128. 静脉注射造影剂前，通过自旋回波序列平扫获得T1加权图像：TR =420 ms，TE =14.8OV =14.8OV 。 × 12.0 cm ² ，切片厚度 =2.0 mm，矩阵 =256 × 128，然后连续观察到六个切片。注射顺磁造影剂后，在 0.5、1、2、4 和 6 小时的时间点获取 T1 加权图像。 MR 图像中肿瘤和后肢肌肉区域的感兴趣区域 (ROI) 被划定，并且使用对比剂注射前后 ROI 中的平均信号强度 (SI) 来估计 SER，如我们之前的研究中所述 [27 ].

统计分析

数据以均值 ± 标准差表示，均值间多重比较采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析。双尾P 值小于 0.05 被认为是显着的。

结果

脂质体表征

在 TEM 下，所有装载有非、单和双靶向肽的脂质体的试剂都显示为类似大小的圆形或椭圆形，围绕着清晰的类脂结构。这些纳米颗粒的直径小于 100 纳米，zeta 电位范围从 - 15 毫伏到 - 60 毫伏，由 zeta 电位计测量。 Gd-LP、P1-Gd-LP、P2-Gd-LP 和 P3-Gd-LP 的平均尺寸分​​别为 87.75 ± 0.87 nm、103.50 ± 1.21 nm、89.91 ± 1.49.9±8.0 和 1.00 nm。

双靶向脂质体的 T1 松弛度

纯Gd-DTPA在五组中具有最高的弛豫值，但与其他四类脂质体没有区别（P> 0.05)（图 1），表明添加脂质和肽组合物对封装的 Gd-DTPA 的弛豫率几乎没有影响。因此，这表明用Gd-DTPA包裹的非、单和双靶向脂质体有望具有足够的分子成像能力。

T1 弛豫度 (s ⁻¹ mM ⁻¹ ) 在不同钆浓度 (mM) 下测量的纯 Gd-DTPA、Gd-LP、P1-Gd-LP、P2-Gd-LP 和 P3-Gd-LP 溶液。数据代表平均值 ± 标准偏差（n =3), (P> 0.05)

细胞摄取和竞争结合

在细胞摄取研究中，双靶向脂质体组中的钆浓度高于其他配方。与非靶向脂质体相比，双靶向组的钆浓度提高了 50%（图 2a）。单靶向脂质体组的钆浓度增加了 20%。此外，混合单靶向脂质体（P2/P3-Gd-LP）的钆浓度显着低于双靶向脂质体。

一 Gd-LP、P1-Gd-LP、P2-Gd-LP、P3-Gd-LP 和 P2/P3-Gd-LP 在 A549 细胞和 HUVEC 中的细胞摄取实验。 b -d P1-Gd-LP、P2-Gd-LP和P3-Gd-LP的细胞竞争研究，分别加入P1、P2和P3以抑制竞争组中的受体。 *P <0.05，与其他组相比

靶向脂质体组中的钆浓度在与配体 P1、P2 或 P3 与 αvβ3-整联蛋白和/或神经纤毛蛋白 1 受体的竞争性结合中显着降低。竞争组的细胞摄取接近于非靶向脂质体（图 2b-d 和表 1）。这些数据表明双靶向脂质体在这些组中具有最好的肿瘤靶向能力，这是由RGD/αvβ3-integrin和A7R/NRP1的结合介导的。

MR 图像分析

将常规脂质体和包裹钆造影剂的脂质体注射到荷瘤小鼠体内，以评估对 MRI 中肿瘤信号增强的影响（图 3）。在 SER 方面，纯 Gd-DTPA 和非靶向脂质体组的成像效果相似（图 4）。 SER 在注射后 1 小时达到峰值，并在接下来的 6 小时内急剧下降，而单靶向和双靶向脂质体显示出与上述两组不同的增强模式。 SER 在 1 小时达到峰值，但从 2 小时到 6 小时时间点缓慢下降。其中，双靶向脂质体达到最高SER值，在所有时间点均具有统计学意义。与纯 Gd-DTPA 和非靶向脂质体相比，它增加了大约三倍，并且在注射后 2 小时是单靶向脂质体的 1.5 倍。 SER 逐渐降低，6 h 时仅降低峰值的 40%。

荷瘤小鼠在不同时间点注射不同造影剂前后的MR图像。 一 纯 Gd-DTPA。 b Gd-LP。 c P1-Gd-LP。 d P2-Gd-LP。 e P3-Gd-LP

通过注射纯 Gd-DTPA、Gd-LP、P1-Gd-LP、P2-Gd-LP 和 P3-Gd-LP，测定不同时间点的 SER。 N =3, 和 *P <0.05 P1-Gd-LP vs 其他四组

讨论

小脂质体颗粒，尤其是直径小于 100 nm 的脂质体颗粒，倾向于延长生物半衰期，增强实体瘤的渗透性，从而在局部肿瘤组织中积累 [4]。我们成功构建了直径在纳米颗粒范围内的非、单肽和双肽修饰脂质体，并证明这些脂质体可以有效地封装顺磁 MRI 造影剂 Gd-DTPA。各种脂质体制剂的 T1 弛豫率低于纯 Gd-DTPA，但无统计学差异（P> 0.05)。一个可能的原因可能是脂质双层有效地封装了钆离子并阻止了它们与水的交换[28]。此外，脂质体表面的肽修饰不会改变脂质体的完整性[29]。另一个原因可能是脂质体的硬度，这归因于其对水的渗透系数低的胆固醇和饱和磷脂成分 [30]。从这个意义上说，脂质体成分对造影剂Gd-DTPA的成像能力的影响很小。

血管生成，即从现有血管形成新血管，是许多病理进展中的关键事件，尤其是在肿瘤的生长侵袭和转移中 [15, 16]。大量的分子参与了肿瘤血管生成的进程，例如VEGF等实体瘤血管化的因素，涉及与膜受体的相互作用 [17, 31]。一种这样的受体是神经纤毛蛋白-1 (NRP1)，它是 VEGFR-2 的共同受体，可增强 VEGF165 的结合和生物活性，其具有广泛的组织分布，包括一些肿瘤衍生细胞和内皮细胞 [32]。 Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg (ATWLPPR) 是一种七肽，已被证明与 NRP1 特异性结合并成功用于检测 NRP-1 阳性肿瘤 [12, 17]。然而，单体 A7R 相对较低的亲和力表明进一步改进以提供成功的成像 [33]。整合素是细胞粘附受体之一，在肿瘤血管生成和转移中也起着关键作用，尤其是在肿瘤细胞和活化的血管内皮细胞上高表达的整合素αvβ3[34]。与整合素αvβ3特异性结合的Arg-Gly-Asp氨基酸序列(RGD)已被广泛用于肿瘤的无创成像[7, 21, 27, 35]。

在过去十年中，在成像领域越来越多地研究同时靶向多个受体 [23, 25, 26, 36]。 TF LP 或 RGD LP 递送系统、αvβ3 和具有顺磁性 Anx/RGD 脂质体的半乳糖凝集素-1 已用于肿瘤成像 [37, 38]。双靶向基序的协同效应可能通过多种方式发挥作用。首先，结合位点的可用性是与肽配体结合的关键因素。同时靶向两种受体可以增加同一细胞上的结合位点。其次，双靶向肽可以结合两种不同的受体，以增加递送剂到感兴趣区域的可能性。此外，与两个不同受体家族的联系增加了与异质肿瘤细胞结合的可能性。

在我们之前的研究中，通过将含有 RGD 的序列和 ATWLPPR 基序与带有赖氨酸-甘氨糖 (KGG) 间隔区和棕榈酸 (Pal) 锚的偶联物连接，然后偶联，成功构建了新型双靶向紫杉醇包裹的脂质体到脂质体的表面 [39]。结果表明，与两种单靶向肽相比，双靶向肽具有更高的结合活性。这些双靶向脂质体还保持了比单靶向制剂更好的结合特性。

在本研究中，我们将 MRI 造影剂 Gd-DTPA 封装在脂质体中用于分子成像，而不是治疗药物。靶向顺磁性脂质体的细胞摄取升高，双靶向脂质体表明比单靶向脂质体和混合单靶向脂质体具有更高的结合亲和力。目前，双靶向常用的策略有两种，一种是两种单一配体的混合[25, 38]，另一种是一个分子中两种配体的组合[39, 40]。与使用单个肽的混合物相比，我们假设应用一种偶联与两个靶标结合可以在每个脂质体表面移植更多的肽。在竞争性结合试验中，它提供了一个关键证据，证明脂质体对肿瘤细胞的有效靶向是由αvβ3-integrin和neuropilin-1的配体和受体的特异性结合介导的。这些数据再次证实了RGD-ATWLPPR结合的双靶向脂质体促进了药物在肿瘤中的传递和积累。

在 MR 成像实验中，纯 Gd-DTPA 和非靶向脂质体因其小分子、水溶性以及增强的渗透性和保留效应（EPR 效应）而被快速代谢 [41, 42]。相比之下，双靶向脂质体在肿瘤组织中的循环周期延长和逐渐积累已证明具有与肿瘤细胞上的受体特异性结合的能力。 P特别是 ，双靶向脂质体比单靶向脂质体更有效。双靶向脂质体可能发挥协同效应和将Gd-DTPA递送至肿瘤部位的特异性。

近年来，由于结合亲和力和特异性的提高，已经成功设计和合成了大量用于肿瘤成像的双靶向纳米粒子。例如，吴等人。还使用 RGD 和 ATWLPPR 基序设计了双 αvβ3 和 NRP-1 靶向异二聚体肽，用于通过正电子发射断层扫描 (PET) 成像检测恶性胶质瘤 [43]。在他们的研究中，c (RGDyK) 肽通过谷氨酸接头与 ATWLPPR 连接，然后用氟 18 (F-18) 标记用于放射性核素成像。体外受体结合试验证明双靶向探针的细胞吸收和结合亲和力得到改善。此外，F-18 标记的双 RGD-ATWLPPR 的体内肿瘤吸收显着高于单靶向分子，并且这种异二聚体肽也具有最高的肿瘤器官比。与其放射性标记的肽探针相比，我们的非放射性双靶向顺磁性脂质体由于具有更大的负载能力，可以更有效地将造影剂输送到肿瘤部位。在另一项研究中，Zhang 等人。成功构建了 68Ga-BBN (Bombesin)-RGD，一种针对 GRPR（胃泌素释放肽受体）和整合素 αvβ3 的异二聚体 PET 示踪剂，临床数据表明双靶向 PET 放射性示踪剂在前列腺癌诊断和分期中的安全性和有效性[44]。然而，这种双靶向 PET 放射性示踪剂只能用于前列腺癌的无创成像，因为 GRPR 是前列腺癌的重要生物标志物。与 BBN-RGD 肽探针不同，RGD-ATWLPPR 肽可以与实体瘤新血管系统中 VEGFR 和/或整联蛋白过表达的大多数肿瘤结合。因此，这种双αvβ3-integrin-NRP1靶向顺磁性脂质体有望用于多种肿瘤的早期检测。

结论

在我们的研究中，双靶向顺磁性脂质体是通过将 αvβ3-integrin 和neuropilin-1 受体的两种配体结合在表面上并在脂质体的核心加载 MRI 造影剂 Gd-DTPA 来制备的。这种修改不会显着干扰 Gd-DTPA 的特性。双靶向脂质体促进了体外的特异性细胞摄取，表明双靶向配体的亲和力和结合似乎协同增加。此外，体内成像表明，双肽修饰脂质体可以比非靶向或单靶向对应物在更大的部分和更长的时间内保持在循环中，然后表现出优异的选择性和特异性。综上所述，我们成功构建了一种新型靶向血管生成的顺磁性脂质体，该脂质体具有可有效结合肿瘤组织的双靶向异二聚体肽，预计这些双靶向顺磁性脂质体具有改善MRI造影剂效果的潜力。用于早期肿瘤特异性成像。

缩写

ATWLPPR：

Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg

BBN：

轰炸机

C6：

6-氨基己酸

CT：

计算机断层扫描

DMEM：

Dulbecco 改良 Eagle 培养基

DMSO：

二甲基亚砜

FMOC：

芴基甲氧基羰基

视场：

视野

Gd-DTPA：

钆二亚乙基三胺五乙酸

HPLC：

高效液相色谱

HUVEC：

人脐静脉内皮细胞

ICP-OES：

电感耦合等离子体发射光谱仪

mPEG2000-DSPE：

N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺

MRI：

磁共振成像

NRP1：

Neuropilin-1

朋友：

棕榈酸

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

PC：

磷脂酰胆碱

PET：

正电子发射断层扫描

RGD：

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸

投资回报率：

感兴趣的区域

序列号：

信噪比

SER：

信号增强率

SI：

信号强度

STIR：

反转恢复自旋回波

TE：

回声时间

TEM：

透射电子显微镜

TR：

重复时间

VEGF-R：

血管内皮生长因子受体