高负载5-氨基乙酰丙酸-角鲨烯纳米颗粒：增强细胞模型中肿瘤光检测与治疗

摘要

原卟啉IX（PpIX）是5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）给药后内源性产生的光敏剂，是多种恶性肿瘤光诊断（PD）和光动力治疗（PDT）基石。然而，5-ALA两性离子性质限制其跨生物屏障渗透，制约全身临床应用。本文描述一种新型角鲨烯基化5-ALA（5-ALA-SQ），可自组装成平均直径70 nm、低分散指数（0.12）、+36 mV zeta电位、高达26%药物负载的纳米组装体（NAs）。在人前列腺癌（PC3）和胶质母细胞瘤（U87MG）细胞系中，5-ALA-SQ NAs产生的PpIX荧光在可比浓度下匹配或超过商业己酯（5-ALA-Hex），且在早期时间点（≤4 h）表现更优。结果表明5-ALA-SQ NAs是PD和PDT应用中5-ALA全身递送的有前景平台。

背景

纳米技术提供生物相容、可降解载体，可增强治疗剂化学稳定性、药代动力学和部位特异性递送。但许多纳米颗粒（NP）系统药物负载低（<5%）且爆发释放损害疗效和安全性。角鲨烯，天然三萜类和胆固醇前体，已成“角鲨烯化”多功能支架——药物共价连接角鲨烯驱动自发自组装成高负载、稳定纳米组装体（NAs）。角鲨烯化NAs成功用于吉西他滨、紫杉醇、顺铂、多柔比星等化疗药物，常产生优越药理活性，某些情况实现诊疗一体化功能。

5-ALA作为PpIX前体，已临床用于PD、PDT和胶质瘤荧光引导切除。其治疗窗受限于带电结构，限制全身吸收和肿瘤富集。酯化衍生物如5-ALA-Hex虽改善生物利用度，但主要局限于局部给药或特定癌症如膀胱癌。近期研究探索将5-ALA封装于聚合物NAs、脂质体、树枝状聚合物、金纳米颗粒，但尚无转化为临床可行全身制剂。我们的目标是设计5-ALA-角鲨烯共轭物自组装成高药物负载、稳健、高效肿瘤摄取的NAs，从而扩展5-ALA在当前适应症外实体瘤PD和PDT临床应用。

结果与讨论

5-ALA-SQ构建模块合成

共轭物四步汇聚合成。Boc保护5-ALA通过EDC/DMAP介导酯化与羟基化角鲨烯衍生物偶联，随后温和酸去保护，反相HPLC纯化。总收率高，产物经NMR和质谱全表征。

5-ALA-SQ纳米组装体表征

纳米沉淀法诱导自组装：构建块溶于1:1丙酮/乙醇混合液，滴加入搅拌下Milli-Q水，旋蒸除溶剂。动态光散射（DLS）和冷冻透射电镜显示单分散颗粒，平均流体动力学直径70 nm，分散指数0.12。+36 mV zeta电位表明胶体稳定性强且利于与负电细胞膜相互作用。重要的是，26%药物负载显著优于大多数5-ALA纳米制剂（通常<5%）。

癌细胞中PpIX荧光动力学体外研究

PC3和U87MG细胞孵育不同浓度5-ALA-SQ NAs或商业5-ALA-Hex。荧光酶标仪（405 nm激发，630 nm发射）监测24 h。1.0–2.0 mM下，5-ALA-SQ NAs产生PpIX荧光稳步增加，~8 h后趋稳。相反，5-ALA-Hex在0.10–0.30 mM峰值，但>1 mM显示细胞毒性降低总荧光。

4 h和24 h剂量-反应曲线显示，5-ALA-SQ NAs在两细胞系荧光强度匹配或超越5-ALA-Hex。4 h最大荧光达于1–2 mM 5-ALA-SQ，而24 h需更高浓度（达3.3 mM）接近同等水平。值得注意的是，5-ALA-SQ维持更持久荧光谱，仅在最高浓度最长孵育时轻微下降。

与上市5-ALA制剂比较，5-ALA-SQ NAs在U87MG细胞4 h后产生显著更高荧光，这对术中成像至关重要。24 h时，最佳浓度下5-ALA-SQ荧光与5-ALA相当，表明随时间总PpIX生成可比。

5-ALA-SQ增强细胞摄取可能源于单体共轭物白蛋白介导转运，此前角鲨烯-吉西他滨NAs已证实。5-ALA带正电氨基可能朝向水相，疏水角鲨烯核心组装成颗粒内部，解释了相较其他角鲨烯NAs粒径更小的原因。

结论

我们设计了一种5-ALA-角鲨烯共轭物，自发形成高稳定、高负载（26%）纳米组装体，具备有利尺寸和表面电荷。前列腺癌和胶质母细胞瘤细胞体外研究显示，这些NAs高效递送5-ALA，产生匹配或超越商业制剂的PpIX荧光，并在长时间孵育中保持稳健性能。这些发现支持进一步体内评价5-ALA-SQ NAs作为肿瘤光诊断和光动力治疗全身递送平台。

方法/实验

所有试剂购自商业供应商直接使用。5-ALA经Boc保护，用EDC/DMAP与羟基化角鲨烯衍生物（3）偶联，温和酸条件去保护。终产物（5）反相HPLC纯化，NMR和HRMS表征。

纳米组装体制备：1.2 mg构建块（5）溶于50/50丙酮/乙醇混合液（500 μL），以100 μL/min滴加入1.25 mL Milli-Q水。搅拌5 min后，30 °C旋蒸除溶剂，得2.00 mM NA溶液。

粒径、分散指数、zeta电位用DLS（Malvern Nano ZS）25 °C测定。冷冻透射电镜用Vitrobot制备玻璃化样品测定。4 °C下DLS监测1个月稳定性。

PC3（12,000 cells/孔）和U87MG（10,000 cells/孔）接种96孔板，无血清培养基中用5-ALA-SQ NAs、5-ALA-Hex或5-ALA系列稀释孵育至24 h。Safire酶标仪（405 nm激发，630 nm发射）记录PpIX荧光。数据归一化至未处理对照，均值±SD绘图。统计学显著性设p<0.05（GraphPad Prism 6）。