5-氨基乙酰丙酸-角鲨烯纳米组件用于肿瘤光检测和治疗：体外研究

背景

医学纳米技术引入了有前途的新药物输送平台。它们由生物相容性和可生物降解的纳米材料组成，有助于提高药理活性化合物的化学稳定性和药代动力学特征，同时在作用部位提供受控递送 [1,2,3]。然而，迄今为止，只有少数纳米粒子系统进入市场。现有纳米颗粒 (NPs) 的主要缺陷主要是它们的载药量较差（通常小于 5%）和“爆释效应”，这会导致大部分药物在到达目标部位之前过早释放。这会导致不良副作用，并可能导致毒性和药理活性的丧失[4]。

角鲨烯 (SQ) 是一种线性三萜，化学式为 C30H50，是胆固醇和其他类固醇的前体 [5]。在人体内，角鲨烯在肝脏和皮肤中合成，并通过血液中的低密度脂蛋白 (LDL) 和极低密度脂蛋白 (VLDL) 转运[6]。在肿瘤治疗的背景下，角鲨烯对某些化疗药物表现出很强的增强作用 [7]。由于在自然界中广泛存在且安全，角鲨烯已在制药技术中作为赋形剂应用于制备脂质乳剂，用于递送疫苗、各种活性化合物和基因 [6, 8, 9]。已发现角鲨烯适用于与不同药物的共价结合。以这种方式创建的先进纳米系统将角鲨烯与吉西他滨 [10,11,12]、紫杉醇 [13]、顺铂 [14] 或阿霉素 [15] 等化疗药物结合。这种方法称为“角鲨烯酰化”，涉及形成纳米胶体系统的前药策略，其中活性成分共价结合 [16, 17]。基于角鲨烯的纳米组件 (NAs) 是由功能成分在水性介质中自组装形成的，其特点是固有的高载药量 [18]。已发现角鲨烯酰化可增强药物稳定性并增加难溶于水的药物的溶解度，从而提高生物利用度并延长药物在体循环中的半衰期 [14, 16]。在大多数情况下，这种自组装 NA 显示出比母体药物更好的药理活性 [16, 19]。此外，角鲨烯酰化提供了一种构建包含治疗和成像模式的 NA 的方法 [20]。 Couvreur 及其同事通过将 MRI 试剂掺入角鲨烯酰-吉西他滨 (SQgem) 纳米组件 [14] 报道了类似的治疗诊断 NA。这些类型的多功能系统可能对开发用于个性化医疗的新型治疗诊断剂具​​有重要意义。

在癌症治疗诊断学的背景下，小分子 5-氨基乙酰丙酸 (5-ALA)（图 1）的给药导致 5-ALA 在临床上用于光动力疗法 (PDT) [21,22,23] 、光诊断 (PD) [24] 和荧光引导的脑癌胶质瘤患者的肿瘤切除 [25,26,27]。由于血红素循环的旁路反馈抑制，5-ALA 的代谢和原卟啉 IX (PpIX) 在癌组织内的选择性积累来实现治疗诊断 [22]。然而，5-ALA PD 和 PDT 的功效受到其在血液中中性 pH 值下的两性离子性质的严重阻碍。已经进行了不同的尝试来改善 5-ALA 的稳定性和药代动力学特征。 5-ALA 的氨基末端和羧基末端都已通过各种方法进行了修饰 [28]。 5-ALA 的羧基酯化生成 5-ALA 甲酯 (Metvix®) [29] 并用于局部治疗光化性角化病、基底细胞癌和急性痤疮。 5-ALA 己酯 (5-ALA-Hex) (Hexvix®) 已获得膀胱癌光诊断 (PD) 的上市许可 [30, 31] 并在实验中用于治疗宫颈癌和严重痤疮 [32 ,33,34]。

NA 积木元素的化学结构。 5-ALA (a ), 5-ALA-十六进制 (b ), 角鲨烯 (c ) 和 5-ALA-SQ (d )

然而，除 Gliolan™ 外，5-ALA 及其衍生物的临床应用主要限于局部给药。这限制了它们在更重要的癌症类型中的使用，例如乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和前列腺癌。扩大 5-ALA 用途的尝试有 5-ALA 的氨基末端修饰的磷酸酶敏感衍生物，这些衍生物最近显示出非常有希望的活性 [35, 36]。此外，已经尝试将 5-ALA 封装到不同的纳米系统中，包括聚合物 NAs [37,38,39] 或脂质体 [40,41,42,43] 及其与树枝状大分子 [44, 45] 或金 NPs [46] 的结合, 47]。尽管其中一些解决方案有助于提高 5-ALA 的稳定性及其药代动力学特征，但上述尝试均未在癌症纳米医学领域产生成功的临床候选药物。

这项工作的目的是设计和合成 5-ALA-角鲨烯 (5-ALA-SQ) 共轭结构单元（图 1d），该结构单元在水性介质中自组装并含有 5-ALA 的高载药量，这是一个先决条件在癌症中的药理活性。在两种不同的癌细胞系上测试了 NA 的荧光 PD 能力。结合最近关于基于角鲨烯的 NAs 利用血浆脂蛋白实现间接癌症靶向 [48] 的报道，这种 5-ALA 纳米技术方法扩大了 5-ALA 用于不同癌症的 PD 和 PDT 的用途，例如本研究中使用的前列腺癌.

结果与讨论

5-ALA-SQ 构建块合成

一种有效的聚合化学策略用于从角鲨烯和 5-ALA 合成 5-ALA-SQ 构件（图 2）。 5-ALA 首先在氨基末端用 N 保护 -Boc 保护基团使用标准条件。纳米组装诱导角鲨烯醇 (3 ) 是根据文献 [49] 中描述的程序在四个合成步骤中从角鲨烯合成的。 Boc-5-ALA (2 ) 和角鲨烯醇 (3 ) 然后在 EDC 和 DMAP 的存在下偶联得到受保护的酯衍生物 (4 ) 收益良好。最终的 Boc 脱保护必须在温和的酸性条件下进行，以避免在角鲨烯支架上发生亲电加成。最终产物通过反相HPLC纯化，以良好的收率得到NA结构单元。

5-ALA-SQ 积木合成。 5-ALA-SQ由5-ALA和SQ聚合合成，分四步合成

5-ALA-SQ 纳米组件

为了实现纳米颗粒 (NP) 将活性化合物有效递送至其作用部位，纳米颗粒尺寸、形状和表面电荷等参数起着重要作用，并控制着体内纳米递送系统的药代动力学。 50]。特别是，粒径控制着几种药代动力学现象，例如体循环中的 NP 半衰期、巨噬细胞的隔离以及通过渗漏的脉管系统外渗到作用部位 [51]。纳米颗粒的形状和大小调节它们通过脉管系统中发现的开窗渗出的能力 [50, 51]。尺寸和形状对于主动靶向和细胞摄取也非常重要，因为较小的纳米颗粒和球形具有较小的表面积，因此与较大的非球形纳米颗粒系统相比，接触点有限[51]。

5-ALA-SQ 构件的自组装在水性介质中自发发生。 NAs 是通过纳米沉淀形成的。将 5-ALA-SQ 缀合物溶解在有机溶剂中并逐滴加入水中。有机溶剂的全部蒸发产生了 NAs 的水溶液。 5-ALA-SQ NA 是单分散的，多分散指数低，为 0.12。电泳迁移率测量得到 36 mV 的 ζ 电位，动态光散射 (DLS) 显示 NA 的单分散分布，平均尺寸为 70 nm（图 3）。 NA 大小范围为延长血液循环提供了良好的潜力 [50]。尽管如此，5-ALA-SQ NAs 明显小于先前报道的 SQ 复合材料，其范围在 100 到 300 nm 之间，表明不同的超分子排列 [19]。

5-ALA-SQ NA 的表征。低 (a ) 和高 (b ) 放大冷冻 TEM 图像，DLS 分析 (c )，以及 4°C 下的稳定性 (d )

与 SQ 部分相比，较小的尺寸可能是由于带正电荷的氨基和相对较小的 5-ALA 分子。已经证明，附着在角鲨烯上的小分子的变化会导致化合物-角鲨烯共轭物的自组装和堆积发生变化，从而改变 NAs 的形状和大小 [16]。 5-ALA 的带正电荷的氨基可能会朝向大量水，​​而亲脂性链占据这些 NA 的内部；然而，确切的超分子结构仍有待阐明。尽管与其他角鲨烯纳米复合材料相比，NAs 的尺寸明显更小，但其表现出优异的货架稳定性，尺寸和 PDI 在数周内保持不变。

新的 5-ALA-SQ NA 的另一个重要方面是它们实现了 26% 的载药量，与其他报道的载药效率低得多的 5-ALA 纳米颗粒系统相比，这是很高的 [37, 38, 41]。载药量在 NP 递送中非常重要，因为在载药量较差的 NPs 中，给药剂量可能不足以达到靶组织中的药理活性浓度 [4]。考虑到5-ALA和5-ALA-SQ的分子量，可以通过简单的计算确定负载量，因为5-ALA以1:1的摩尔比与角鲨烯支架共价结合。

癌细胞中的 PpIX 荧光动力学测量

在用 5-ALA-SQ NAs 和 5-ALA-Hex 作为参考孵育的 PC3 人前列腺癌细胞和 U87MG 胶质母细胞瘤中评估 PpIX 的时间依赖性形成。图 4 显示了在 24 小时内暴露于浓度增加的 5-ALA-SQ NAs 或 5-ALA-Hex 的 PC3 人前列腺癌细胞中的 PpIX 形成。

PC3 细胞中 PpIX 积累的动力学荧光测量。将细胞与浓度逐渐增加的 5-ALA-SQ NAs (a ) 或 5-ALA-十六进制 (b )

观察到 5-ALA-SQ NA 的浓度依赖性 PpIX 荧光谱。在 1.0 和 2.0 mM 时，PpIX 荧光在 24 小时内稳定增加，同时在低浓度孵育 8 小时后达到平台期。另一方面，如先前报道的，5-ALA-Hex 在 0.10 和 0.30 mM 之间的较低浓度范围内诱导了最高的 PpIX 积累 [35, 52]。然而，发现浓度高于 1 mM 的 5-ALA-Hex 对细胞有毒，这会降低观察到的整体荧光并阻碍其使用 [36]。

接下来，在 PC3 和 U87MG 人胶质母细胞瘤癌细胞中进行剂量依赖性 PpIX 积累，目的是估计最佳 NA 剂量。与 5-ALA-SQ NA 和 5-ALA-Hex 孵育 4 和 24 小时时的荧光强度如图 5 所示。非常重要的是，5-ALA-SQ NA 在两种细胞系中都诱导了 PpIX 的产生。此外，在两种细胞系中，最大荧光水平与 ALA-Hex 对照相当。还可以注意到，在 PC3 细胞中，1.0 和 2.0 mM 浓度的 5-ALA-SQ NA 是诱导 PpIX 最高积累的最佳选择。在 U87MG 细胞中，不同浓度的 5-ALA-SQ NA 在短孵育时间之间没有显着差异（图 5c）。在 24 小时时，发现 PpIX 积累依赖于 5-ALA-SQ NAs 或 5-ALA-Hex 的浓度，类似于 PC3 细胞。在较高浓度的 5-ALA-SQ NAs 下孵育较长时间后，发现 PpIX 诱导的降低与 ALA-Hex 有点相似。

剂量反应曲线。 PC3 中 5-ALA-SQ NA（蓝色）和 5-ALA-Hex（红色）的浓度依赖性 PpIX 积累 (a , b ) 和 U87MG (c , d ) 培养 4 小时（左）和 24 小时（右）后的细胞

图 5 表明，在 24 小时时，PpIX 生产曲线在 PC3 和 U87MG 细胞中均呈钟形。虽然 1 mM 浓度的 5-ALA-SQ NAs 在 PC3 细胞中诱导了最高的 PpIX 积累，但 U87MG 细胞耐受更高的浓度，并且在高达 2 mM 5-ALA-SQ NAs 时观察到 PpIX 荧光的增加。一般来说，与 5-ALA-Hex 相比，需要更高浓度的 5-ALA-SQ NA 才能有效诱导 PpIX 的生物合成，这可能是由于癌细胞内酯键的裂解率不同。由于 5-ALA-Hex 的非特异性毒性，当使用浓度高于 1 mM 的 5-ALA-Hex 时，观察到 PpIX 产量减少。这种效果对于 5-ALA-SQ 而言不太明显，其中荧光仅在最高测试浓度（3.3 mM）和延长孵育时间（图 5b、d）时，水平才开始下降。然而，两种化合物的荧光水平相似，NAs 没有观察到任何荧光滞后。

还在 U87MG 胶质母细胞瘤中针对 5-ALA 对照测定了 NA，该对照在市场上销售用于手术切除期间胶质母细胞瘤的 PD。图 6 显示了 4 小时和 24 小时后 U87MG 细胞的荧光。与在临床环境中高度相关的 5-ALA 相比，5-ALA-SQ NA 在 4 小时后诱导显着更高的荧光。在 24 小时时，由于 5-ALA 的缓慢、主动摄取在细胞内提供了足够的 5-ALA，因此荧光谱在较低浓度下偏向于 5-ALA。在最佳 1.0 和 2.0 mM NA 浓度下，NA 仍表现出与 5-ALA 相似的荧光水平（图 6b）。

剂量反应曲线。 4 小时后 U87MG 细胞中浓度依赖性 PpIX 积累 (a ) 和 24 小时 (b ) 与 5-ALA-SQ NAs（蓝色）和 5-ALA（绿色）一起孵育

在临床实践中，5-ALA 可局部或口服给药，但由于其带电性质，根据细胞类型，只有一小部分初始剂量通过内源性肽转运蛋白（如 PEPT1、PEPT2 或 BETA 转运蛋白）进入靶细胞[40, 53]。最近对来自 SQgem 衍生物的 NA 的研究表明，细胞进入受白蛋白增强的单分子构建块扩散控制，并且发现它高度依赖于细胞外蛋白的存在 [54, 55]。此外，我们最近报道的远红荧光 NAs 也表现出快速内化，5-ALA-SQ 荧光动力学实验和剂量反应曲线证实了单分子构建块内化和有效的后续代谢，以产生荧光 PpIX。

结论

在这项体外概念验证研究中，使用收敛化学策略从角鲨烯和 5-ALA 合成 5-ALA-SQ 构建块。 5-ALA-SQ NAs 是通过在水中自发纳米沉淀制备的。 NA 是单分散且稳定的，平均粒径为 70 nm，多分散指数为 0.12，正 ζ 电位为 36 mV，5-ALA 负载量高达 26%。通过测量荧光随时间的增加并与 5-ALA 和 5-ALA-Hex 进行比较，在体外评估了两种癌细胞系中 PpIX 的产生。结果表明，SQ-ALA NAs 在诱导 PC3 和 U87MG 癌细胞类型的 PpIX 产生方面非常有效。在体外孵育 4 和 24 小时，它们在更高浓度的荧光诱导方面优于 5-ALA-Hex；然而，与 5-ALA 相比，它们在更短的孵育时间内显示出更好的荧光诱导。根据这些发现，我们可以得出结论，5-ALA-SQ NAs 提供了一种有吸引力的纳米技术解决方案，可以克服 5-ALA 的药代动力学缺陷。此外，体内实验将评估其全身递送5-ALA用于荧光PD和PDT治疗肿瘤的潜力。

方法/实验

试剂购自商业供应商 Sigma-Aldrich（Bucks，瑞士）和 Acros Organics（巴塞尔，瑞士），无需进一步纯化即可使用。氘代 NMR 溶剂购自 Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, USA)。四氢呋喃 (THF) 和二氯甲烷 (CH2Cl2) 来自基于无水工程氧化铝柱的干燥系统。使用的所有其他溶剂均为 HPLC 级。 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、甲醇 (CH3OH)、乙醚 (Et2O) 和丙酮购自 Sigma-Aldrich（Buchs，瑞士）。乙酸乙酯 (AcOEt) 购自 Biosolve (Dieuze, France)；乙腈 (CH3CN) 由 Carlo Erba Reagents (Balerna, Switzerland) 提供。 ≥ 95% 的正己烷购自 Fisher Chemical（瑞士巴塞尔）。用于制备的水通过 Milli-Q 实验室水系统 (Millipore, Molsheim, France) 去离子。使用标准注射器隔垫进行化学反应，氩气正压以确保无水条件。

薄层色谱 (TLC) 使用铝背硅胶板 (Merck-Keiselgel 60 F254) 和合适的流动相进行，并使用 UV 荧光灯（254 和 366 nm）进行观察和/或用茚三酮、20% 硫酸展开酸或磷钼酸 (PMA)。快速色谱在来自 Interchim (Montlucon, France) 的自动 PuriFlash® 4100 机器上使用配备有 PDA 检测器 (200–800 nm) 和自动馏分收集器的 Interchim 硅胶柱 puriFlash® HP 30 μm 进行。使用 Flash Interchim 软件 5.0x 版监测洗脱曲线。半制备型 HPLC 柱在 Waters Symmetry 300TM - 5 μm (19 × 150 mm)、C8 柱（Baden-Dättwil，瑞士）上进行。分析 UPLC 使用 Macherey-Nagel EC50/2 Nucleodur Gravity 1.8 μm 色谱柱（50 × 2.1 mm）进行，该色谱柱安装在配备 Waters PDA 检测器（Baden-Dättwil，瑞士）的水系统上。缓冲液 A =CH3CN + 0.1% 甲酸）和缓冲液 B =H2O + 0.1% 甲酸。流速 =400.0 μL/min，25°C。 ¹ H 和 ¹³ C NMR 光谱是在 Varian Gemini 300 MHz、Varian Innova 500 MHz 或 Bruker Avance III Cryo 600 MHz 光谱仪上在 298 K 下记录的。化学位移 (δ) 以百万分之几 (ppm) 表示，耦合常数 (J) 以赫兹 (Hz)。 s 为单峰，d 为双峰，dd 为双峰的双峰，t 为三重峰，q 为四重峰，m 为多重峰。残留溶剂峰用作质子和碳化学位移的内参。核磁共振谱用 Mnova 10.0.2 版软件包处理。低分辨率质谱 (LRMS) 在 HTS PAL-LC10A – API 150Ex 仪器上以 ESI（正模式）进行。高分辨率质谱 (HRMS) 在 QSTAR Pulsar (AB/MDS Sciex) 仪器上以 ESI（正模式）进行。使用 ChemBioDraw Ultra 14.0.0.117 版软件包根据 IUPAC 命名法绘制和命名化学结构。 pH 在万通 691 pH 计上使用矛头电极（Zofingue，瑞士）测量，并用万通缓冲液校准。使用 GraphPad Prism 6, 2016, (GraphPad Software) 软件进行统计分析。 P 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

SQ-ALA 构建块的合成

5-(叔丁氧基羰基氨基)-4-氧代戊酸 (2)

Boc-5-ALA 根据公开的程序合成。光谱数据与文献[56]相同。 ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.12 (s, 1H), 7.06 (t, J =5.9 Hz, 1H), 3.76 (d, J =5.9 Hz, 2H), 2.61 (t, J =6.Hz, 1H) , 2H), 2.40 (t, J =6.5Hz, 2H), 1.38 (s, 9H)。 ¹³ C NMR (151 MHz, DMSO) δ 206.62, 174.07, 156.21, 78.54, 49.97, 40.38, 40.24, 40.11, 39.97, 39.83, 39.656, 39.652,34.34 [M+H] ⁺ 232.1，发现 232.7。

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-pentaen-1-ol (3)

角鲨烯醇3 根据报道的程序[49]，由角鲨烯在四个合成步骤中以 23.7% 的产率合成为无色油。 ¹ H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.17-5.06 (m, 5H, CH), 3.62 (q, J =6.3 Hz, 2H, CH2-OH), 2.17 – 1.92 (m, 18H, CH2), 1.67 (s, 3H, CH3), 1.59 (m, 17 H, CH3 和 CH2)。 ¹³ C NMR（75 MHz的，CDCL 3）δ135.35，135.17，135.14，134.81，131.49，125.05，124.64，124.60，124.47，63.07，39.98，39.95，39.89，36.24，30.92，28.48，26.98，26.88，26.78，25.94，17.92 , 16.28, 16.23, 16.08。 LRMS (ESI)：为 [M+NH4] ⁺ 计算的 m/z 404.4，发现404.8。

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-pentaen-1-yl 5-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代戊酸酯 (4)

角鲨烯醇 (3 )（100 毫克，0.26 毫摩尔）、EDC（74 毫克，0.38 毫摩尔）和 DMAP（94 毫克，0.78 毫摩尔）和 5-（叔丁氧基羰基氨基）-4-氧代戊酸 (2)（77 毫克，0.34 毫摩尔）溶解在 DCM (15 mL) 中。在环境温度下搅拌过夜后，在减压下蒸发溶剂并通过使用DCM/乙酸乙酯(EA)梯度的快速色谱纯化粗产物，得到无色油状物(108mg，0.18mmol，70％)。 ¹ H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.31 – 5.20 (br s, 1H), 5.13 – 5.07 (m, 5H), 4.09 – 3.95 (m, 4H), 2.75 – 2.53 (m, 4H) – (1H), 2.05 m, 20H)、1.64 (s, 3H)、1.63 – 1.50 (m, 19H)、1.41 (s, 9H)。 ¹³ C NMR（75 MHz的，CDCL 3）δ204.46，172.65，135.30，135.16，135.09，133.75，131.43，125.34，124.60，124.57，124.48，124.45，64.81，50.53，39.96，39.93，39.87，35.92，34.56，28.52，28.47 , 28.43, 28.24, 28.02, 26.97, 26.86, 25.92, 23.11, 17.90, 16.25, 16.21, 16.06。 LRMS (ESI)：为 [M+NH4] ⁺ 计算的 m/z 617.5，发现 617.8。

5-氨基的三氟乙酸盐-(((4E,8E,12E,16E)-4,8,13 ,17,21-pentamethyldocosa-4,8,12,16,20-pentaen-1-yl)oxy)-4-oxopentanoate (5)

化合物4 (34mg，57mmol)溶解在DCM(2.0mL)中。添加三氟乙酸 (TFA) (200 μL)，并将反应混合物在环境温度下搅拌。 10 分钟后，在低温下真空蒸发溶剂，并通过与 EA (3 × 10 mL) 共蒸发除去痕量 TFA。通过RP-HPLC使用全H 2 O/AcN (0.025% TFA)梯度纯化粗产物，产生无色油状物(25 mg，74%)。 %）。 ¹ H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.31 – 5.20 (br s, 1H), 5.13 – 5.07 (m, 5H), 4.09 – 3.95 (m, 4H), 2.75 – 2.53 (m, 4H) – (1H), 2.05 m, 20H)、1.64 (s, 3H)、1.63 – 1.50 (m, 19H)。 LRMS (ESI)：为 [M+H] ⁺ 计算的 m/z 500.4，发现 500.6。

纳米组件的制备

NAs 是通过在别处详细描述的纳米沉淀制备的 [20]。简而言之，构建块 5 （1.2 毫克，2.0 微摩尔）溶解在 50/50 V /V 丙酮/乙醇混合物（500 μL）。然后在磁力搅拌下使用微型注射器以 100 μL/min 将有机相滴加到 MilliQ 水 (1.25 mL) 中。在搅拌下 5 分钟后，移除磁力搅拌棒并在 30°C 下使用旋转蒸发器移除有机溶剂和过量的水。纳米组件的最终浓度为 2.00 mM。

5-ALA-SQ NA 的特征

5-ALA.SQ NA 的 5-ALA 负载量由 5-ALA 和 5-ALA-SQ 偶联物的分子量的各自贡献计算如下[19]：

使用来自 Malvern（英国伍斯特郡）的 NANO ZS 仪器运行 ZetaSizer 7.01 软件，通过动态光散射 (DLS) 测量 NA 的流体动力学直径。在来自 Brand（德国韦特海姆）的聚苯乙烯 (PS) 微量比色皿中，在 25°C 下以 173° 的散射角使用 4 mW He-Ne 激光 (633 nm) 进行分析。 Zeta 电位 (ZP) 使用来自 Malvern 的相同 Nano ZS 仪器在来自 Malvern 的折叠毛细管细胞 DTS 1070 中测定。从数据计算尺寸分布和尺寸平均直径。在 1 个月的时间里，通过 DLS 在固定时间点测定 4°C 下储存的 NAs 的稳定性。

使用 TECNAI® G ² 通过低温透射电子显微镜 (cryo-TEM) 评估 NAs 的形态 Sphera 显微镜（FEI，Thermo Fisher Scientific）配备 2000 x 2000 像素高分辨率数码相机 TCL（Gräfelfing，德国）。使用 Virtobot 低温柱塞（FEI，Thermo Fisher Scientific）制备玻璃化冰样品。将 NA（2.0 μL，2.0 mM）应用于 Quantifoil Cu/Rh 200 目 R3.5/1 网格（SPI，West Chester，美国）并使用液体乙烷进行玻璃化。

细胞培养

人类前列腺癌细胞 PC3 (ATTC® CRL-1435™) 和人类胶质母细胞瘤细胞 U87MG (ATTC® HTB-14™) 在 F-12K 营养混合物（21127-022，Thermo Fisher Scientific）或最​​低限度中通过连续传代培养和维持Essential Media (31095-029, Thermo Fisher Scientific)，分别。细胞培养基补充有胎牛血清（10%，CVFSVF00-01，Eurobio）、链霉素（100 μL/mL）和青霉素（100 IU/mL，15140-122，Thermo Fisher Scientific）。细胞在 37°C 下在含有 95% 空气和 5% CO2 的湿润气氛中培养。

体外 PpIX 荧光动力学测量

将人前列腺癌细胞 PC3（12,000 个细胞/孔）和胶质母细胞瘤细胞 U87MG（10,000 个细胞/孔）接种在 96 孔板（透明底黑色板，3603，康宁）中。第二天，将细胞暴露于无血清培养基中浓度不断增加的 5-ALA-SQ NA、5-ALA-Hex 和 5-ALA。在不同的时间点用读板器（Safire，Tecan，Switzerland）记录 PpIX 荧光。激发波长设置为 405 nm，发射波长设置为 630 nm。平均值和标准差每块板每个时间点的每个浓度减去参考值（未处理）并绘制每个细胞系。