表面电荷主导普鲁兰纳米颗粒-人血清白蛋白复合化与可控药物释放

摘要

纳米颗粒设计的关键在于表面化学如何决定血液中的蛋白质吸附。我们合成了三种基于普鲁兰的聚合物——胆固醇修饰普鲁兰（CHP）、胆固醇修饰氨基普鲁兰（CHAP）和胆固醇修饰羧基普鲁兰（CHSP），并通过透析法制备纳米颗粒。动态光散射显示粒径随带电基团数量变化：CHP（73.1 nm，−0.698 mV）、CHAP（116.9 nm，+12.9 mV）、CHSP（156.9 nm，−15.4 mV）。等温滴定量热法揭示了与人血清白蛋白（HSA）结合的不同热力学特征：CHSP、CHP、CHAP 的结合常数分别为 1.41×10⁴、27.7×10⁴、412×10⁴ M⁻¹，反映了表面电荷的影响。荧光与圆二色光谱证实 HSA 复合后 α-螺旋含量降低，CHP 导致构象变化最大。以米托蒽醌为模型药物的体外释放实验表明，HSA 吸附显著减缓释放：48 小时后 CHSP-HSA 释放 35.8%、CHP-HSA 33.9%、CHAP-HSA 32.5%，而游离纳米颗粒分别为 53.7%、58.5%、63.2%。结果表明纳米颗粒尺寸、表面电荷及蛋白冠形成共同决定药物释放动力学，进而影响治疗疗效。

研究背景

靶向纳米药物递送已成为现代肿瘤学的基石，可实现持续释放并降低全身毒性。纳米颗粒要到达肿瘤组织，必须经历血液循环、穿越血管内皮、渗透细胞外基质并进入癌细胞。蛋白质吸附——特别是高丰度血浆蛋白如人血清白蛋白（HSA）——会形成“蛋白冠”，改变纳米颗粒的生物分布、细胞摄取与药物释放。蛋白冠组成受蛋白浓度、纳米颗粒亲和力及表面性质（电荷、疏水性、尺寸）驱动。

普鲁兰是一种中性多糖，可通过化学修饰引入疏水胆固醇基团，生成两性聚合物并自组装成核-壳纳米颗粒。前期研究表明胆固醇修饰普鲁兰（CHP）可包裹抗癌药物，且 HSA 通过疏水作用与 CHP 结合。在此基础上，我们构建了两种新变体：带氨基的 CHAP 与带羧基的 CHSP，以系统探究表面电荷如何影响蛋白吸附与药物释放。

实验方法

材料

HSA（Sigma-Aldrich）、N,N-咪唑、乙二胺、琥珀酸酐等试剂均为分析纯。

CHP、CHSP、CHAP 合成

CHP 通过普鲁兰与胆固醇琥珀酸酯在 DMSO 中酯化制得并纯化。CHAP 由 CHP 与 N,N-二咪唑和乙二胺反应得到；CHSP 经琥珀酸酐偶联合成。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和 ¹H-NMR 确认结构，胆固醇取代度分别为 4.5%（CHP）、7.8%（CHSP）、14.1%（CHAP）。

纳米颗粒制备与表征

聚合物在 DMSO 中透析对水、过滤（0.45 μm）制得纳米颗粒。动态光散射测得 CHP、CHAP、CHSP 平均粒径分别为 73.1、116.9、156.9 nm，Zeta 电位分别为 −0.698、+12.9、−15.4 mV。

等温滴定量热法

在 25 °C 下测定 HSA 与三种纳米颗粒的结合热力学。CHP 和 CHSP 显示放热结合，CHAP 则呈现先放热后吸热的混合特征，反映疏水与静电作用的相互竞争。

荧光光谱

监测 HSA 荧光（激发 280 nm，发射 290–450 nm）随纳米颗粒加入的猝灭情况。修正 Stern-Volmer 方程得出结合常数分别为 2.02、2.99、4.72×10⁵ M⁻¹，证实带正电的 CHAP 相互作用最强。

圆二色光谱分析

CD 谱（200–250 nm）评估 HSA 二级结构变化。游离 HSA α-螺旋含量 55%，复合后降至 48–52%，CHP-HSA 下降最明显。

体外药物释放

米托蒽醌（MTO）经透析法包裹于各纳米颗粒中。PBS（37 °C）中测定释放曲线，含/不含 HSA（0.1 mg/mL）。游离药物 4 小时释放 99.8%。纯纳米颗粒 48 小时释放率：CHP 53.7%、CHAP 58.5%、CHSP 63.2%。HSA 存在下降至：CHP-HSA 33.9%、CHAP-HSA 32.5%、CHSP-HSA 35.8%。

结果

聚合物表征

FTIR 确认官能化成功：CHP 在 1731 cm⁻¹ 显示酯羰基峰，CHAP 在 1648 cm⁻¹ 显示酰胺峰，CHSP 在 1710 cm⁻¹ 显示羧基峰。NMR 量化取代度。

纳米颗粒性质

尺寸与表面电荷直接影响自组装：带负电 CHSP 和带正电 CHAP 形成更大颗粒（156.9、116.9 nm），中性 CHP 较小（73.1 nm）。带电基团破坏核心堆积，导致结构更疏松、尺寸更大。

热力学分析

ITC 数据显示 CHP（ΔH = 42.8 kJ mol⁻¹）和 CHSP（ΔH = 80.4 kJ mol⁻¹）放热，CHAP 混合型（ΔH = 22.4 kJ mol⁻¹）。熵变提示 HSA 更易结合 CHP 和 CHAP（ΔS 分别为 0.251、2.775 kJ mol⁻¹ K⁻¹），而 CHSP 较难（ΔS = 0.201 kJ mol⁻¹ K⁻¹）。

荧光光谱

荧光猝灭显示快速吸附期后接缓慢复合形成。Stern-Volmer 分析得出的结合常数与 ITC 一致，突显静电主导 CHAP 结合、疏水主导 CHP 结合。

CD 谱分析

CD 测量显示复合化后 α-螺旋逐步减少：CHP-HSA 降至 48.0%、CHAP-HSA 48.6%、CHSP-HSA 52.0%。CHP 导致螺旋度下降最快，与其紧凑疏水核心一致。

药物释放

HSA 吸附一致减缓所有纳米颗粒的药物释放。48 小时释放速率排序与粒径、电荷序列吻合：游离态 CHSP > CHAP > CHP；结合态 CHSP-HSA > CHP-HSA > CHAP-HSA。结果凸显蛋白冠如何调控扩散与降解路径。

讨论

数据证实表面电荷是 HSA 冠形成与后续药物释放的决定性因子。带正电 CHAP 形成最强复合物，归因于静电吸引与疏水锚定的协同；带负电 CHSP 结合最弱，受静电排斥及疏松壳层阻碍蛋白向核心迁移限制；中性 CHP 处于中间，因紧凑疏水核心显示最高 HSA 覆盖率。

这些相互作用影响药物负载纳米颗粒的体内命运。致密蛋白冠可阻碍内皮穿越、改变器官分布、降低细胞摄取。通过调控表面电荷，可调节蛋白冠组成，进而微调药代动力学与治疗窗口。

结论

我们成功构建了三种表面电荷各异的普鲁兰基纳米颗粒。尺寸、电荷与疏水性共同决定 HSA 吸附、结合强度与药物释放动力学。带正电 CHAP 表现出最强蛋白结合与最慢药物释放，中性 CHP 虽蛋白覆盖率最高但在游离态释放最快。这些发现为设计具有定制蛋白冠特性的纳米载体、优化靶向递送与可控释放提供了蓝图。

缩略语

EDX

能量色散 X 射线能谱

SEM

扫描电子显微镜

TEM

透射电子显微镜

XRD

X 射线衍射