双药负载纳米脂质体封装厄洛替尼与多柔比星的优化制备与理化表征

摘要

协同组合化疗关键在于协调递送作用机制不同的药物。我们提出一种可重现、非PEG化纳米脂质体平台，将厄洛替尼（ERL）封装于脂质双分子层，多柔比星（DOX）封装于水相核心。脂质（DSPC、胆固醇、POPG）经薄膜水化法组装，探针超声制备亚200 nm囊泡。DOX利用硫酸铵（AS）或pH梯度负载；AS梯度法DOX封装效率（EE）超90%，pH梯度法仅约17%。ERL EE达30%。透射电镜显示结晶DOX-硫酸盐核心和双层中有序度较低的ERL晶体。囊泡4-37 °C尺寸稳定，ERL快速释放（<8 h）而DOX缓慢释放，实现时差协同谱。确立了适合转化研究的稳健双药纳米脂质体平台。

背景

三阴性乳腺癌等难治性肿瘤因交织的DNA损伤和存活通路抵抗标准单药疗法。先用生长因子抑制剂致敏肿瘤再暴露于基因毒性药物的联合方案显示临床前协同效应。为将此类体外效应临床转化，尤其是药代动力学差异巨大时，能协同递送两药并同步释放的载体至关重要。

纳米脂质体——磷脂双分子层囊泡——天然在核心封装亲水性药物、膜中封装疏水性药物，实现共定位并通过渗透滞留效应（EPR）增强肿瘤富集。然而，可靠可重现制备方案和全面理化数据稀缺，限制临床转化。

方法

材料

DSPC、POPG、胆固醇（Avanti Polar Lipids）、DOX·HCl和ERL游离碱（Boryung Co./上海森德）、硫酸铵、柠檬酸（大jung）、试剂（Sigma-Aldrich）。

双药纳米脂质体制备

ERL掺入27:20:3（w/w/w）DSPC:胆固醇:POPG混合物（药脂比3:50 w/w）干燥成薄膜。65 °C下用250-400 mM AS（或300 mM柠檬酸，pH 3.9）水化形成多层囊泡。探针超声（5 s开/2 s关，20%振幅，36 J/脉冲）冰水浴中将尺寸缩至~140 nm。透析过夜除去多余AS（PBS，pH 7.4）。

向8 mL ERL负载脂质体加入DOX（1.5 mg/mL，2 mL），通过pH梯度或AS梯度负载。评估四种DOX负载方案（孵育、超声、平衡、透析）优化EE。

表征

动态光散射测粒径和多分散指数；TEM（JEM-2100F）观察形貌和晶体结构。EE由Triton X-100释放药物计算，UV-Vis（ERL）或荧光（DOX）定量。体外释放用透析盒在PBS（pH 7.4）37 °C进行。物理稳定性通过4、25、37 °C下21天粒径监测评估。

结果与讨论

超声控制粒径

未处理ERL脂质体~760 nm，探针超声10分钟内缩至~222 nm；进一步超声尺寸变化可忽略。水浴超声虽更快达同样缩减但升温多，故首选冰水冷却。透析后脂质体平均140 nm。

DOX负载效率

AS梯度负载产生90%+ EE，远超pH梯度~17%。350 mM AS浓度最大化EE并最小化变异，可能因有利DOX-硫酸盐结晶。四方案中，65 °C孵育、15分钟探针超声、室温平衡30分钟（第2组）产生最高EE（~98%）。延长超声或延迟平衡降低EE，推测因AS泄漏。

形貌与结晶度

TEM图像确认球形囊泡<200 nm。高分辨TEM和SAED显示核心高有序DOX-硫酸盐晶体和双层外表面有序度较低ERL晶体。单药对照显示类似结晶模式，验证双药体系结构完整性。

物理稳定性

21天内4 °C粒径变化<15%，25 °C<10%，37 °C<6%，显示稳健稳定性。DSPC高相变温度和40%胆固醇含量可能贡献此韧性。

时差释放

PBS中ERL 48 h释放~65%，DOX释放~30%。初始8 h窗口ERL释放速率>4% h⁻¹，DOX<1% h⁻¹，确认有利于协同作用的序贯释放谱。

结论

我们建立可规模化、非PEG化纳米脂质体平台，高EE且可控粒径共封装ERL和DOX。薄膜水化后探针超声最优缩减囊泡直径。AS梯度负载，特别是350 mM AS配合超声后短暂平衡，产生最高DOX EE。TEM和SAED确认各药物独特结晶排列。囊泡物理稳定并展现ERL和DOX时差释放，定位为协同抗癌疗法有前景载体。

缩略语

DOX

多柔比星

DSPC

1,2-二硬酰磷脂酰胆碱

EE

封装效率

EPR

渗透滞留效应

ERL

厄洛替尼

PK

药代动力学

POPG

1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)（钠盐）

SAED

选区电子衍射

SEM

均值标准误

Tc

相变温度

TEM

透射电镜