基于纳米脂质体的双重给药系统的理化特性研究

背景

由于 DNA 损伤反应与各种信号网络高度相关 [1,2,3]，因此难治性癌症（如三阴性乳腺癌）对标准疗法的治疗存在限制。已经研究了增加此类顽固性肿瘤的初始化疗敏感性的治疗策略以挑战极限 [4, 5]。最近的一项研究在使用 DNA 损伤剂的同时抑制致癌信号通路是组合治疗策略之一 [6,7,8]。该研究表明，对耐药性癌细胞进行生长因子抑制剂的预处理会协同它们对基因毒性药物的凋亡反应 [9, 10]。临床上非常需要针对多种癌细胞特异性存活途径的治疗策略，以增强肿瘤细胞杀伤的程度并可能减少治疗期间的总药物暴露 [11, 12]。同时，为了将两种药物的体外协同作用转化为临床，由于两种药物的药代动力学（PK）特性不同，因此需要一种能够递送两种药物并以时差方式释放它们的递送系统。药物以及在适当的时间序列中靶向相同癌细胞的困难[13,14,15,16]。

纳米脂质体递送系统是可应用于联合治疗的双药物递送系统之一。脂质体的主要成分通常是类似于细胞膜的磷脂。磷脂形成一个双层同心球体，带有内部隔室和双层膜 [17]。纳米脂质体可以将具有不同理化性质的药物装载到脂质体的内部隔室和双层膜中，然后输送到病变部位。因此，使用纳米脂质体系统递送的两种药物的体内协同作用可以通过增强药物与癌细胞的共定位来实现，不仅通过协调每种药物的 PK 特性，而且通过所谓的增强的渗透性和保留。 EPR) 对肿瘤组织的影响。纳米脂质体除了将药物包裹在内室中外，还可以溶解疏水性药物，增强其稳定性，调节其血液循环特性，从而诱导其在肿瘤组织中的积累[18]。

尽管最近对基于纳米脂质体的联合化疗给药系统进行了研究，但需要优化系统的制备过程以实现可靠和可重复的制造，并且应该阐明它们的物理化学特性以开发更先进的系统 [13, 19]。在我们的研究中，纳米脂质体递送系统与埃罗替尼（ERL；ERL 游离碱，logP =3.3）和阿霉素（DOX；DOX HCl，logP =1.27）在单个脂质体囊泡中被制备为模型纳米脂质体系统。除了所谓的非聚乙二醇化脂质体制剂 [13] 之外，先前的报告还研究了该系统的理化特性。进行体外药物释放研究以研究药物的时间差异释放。在挤压、超声和高压均质等几种方法中 [20,21,22]，使用探头超声仪的超声处理因其更有效的可加工性而被用于减小脂质体直径。对药物负载技术（如 pH 或硫酸铵梯度法）对药物包封率 (EE) 的影响进行了比较研究，以优化药物包封。此外，通过研究工艺条件对药物 EE 的影响，确定了最有效的药物包封工艺。优化了同时包封ERL和DOX的纳米脂质体双重给药系统的制备条件，并以适当的顺序释放药物。优化的制备方法和双重给药系统的特点为可靠和可重复的制备过程和更先进的转化研究递送系统提供了平台。

方法

材料

1,2-二硬脂酰-sn -glycero-3-phosphocholine (DSPC) 和 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-phospho-(1'-rac -甘油）（钠盐）(POPG) 由 Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, Al, USA) 提供。胆固醇来自 Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO, USA)。盐酸多柔比星 (DOX) 和厄洛替尼 (ERL) 游离碱分别购自 Boryung Co., Ltd.（韩国首尔）和 Shanghai Send Pharmaceutical Technology Co., Ltd.（中国上海）。无水硫酸铵 (AS) 和柠檬酸 (CA) 由 Daejung Chemicals &Metals Co., Ltd.（韩国始兴市）提供。所有其他试剂均为试剂级，由 Sigma-Aldrich, Corp.（美国密苏里州圣路易斯）提供。

双药物包裹纳米脂质体的制备

制备 ERL 和 DOX 包裹的纳米脂质体的一般过程如图 1 所示。简而言之，ERL 包裹的脂质体是使用所谓的脂质薄膜水化法制备的 [23]。将 ERL 添加到脂质混合物中，形成脂质薄膜，以将药物封装到脂质体的脂质双层膜中。脂质体直径通过用探头超声仪（Vibra Cell；Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, USA）进行超声处理而减小。使用纳米脂质体的跨膜离子浓度梯度，将 DOX 封装到 ERL 封装的纳米脂质体的内部水性隔室中。以下部分建议了该过程的详细实验和分析方法。

双重包裹药物纳米脂质体的制备及表征方法

ERL 封装脂质体

由 DSPC、胆固醇和 POPG 以 27:20:3 (w /w /w ) 与 ERL 游离碱以药物与总脂质的重量比 3:50 混合。将这些混合物溶解在 9 mL 氯仿:甲醇 =2:1 (v /v ）。将脂质溶液置于圆底烧瓶中，为了形成脂质膜，使用旋转蒸发仪（Rotavapor R-210；BÜCHI Labortechnik AG，Flawil，Switzerland）在 40°C 下真空除去溶剂。将膜在真空中干燥过夜以除去所有残留溶剂。在这些过程中，ERL分子通过疏水性吸引力插入脂质膜，然后自发地包裹在脂质体的脂质双层膜中，并通过以下水合过程形成。

为了使含有 ERL 的脂质膜水合，将 8 mL 的 250-400 mM AS 或 300 mM 柠檬酸缓冲液（pH 3.9）添加到在圆底烧瓶内表面形成的膜中。通过旋转烧瓶将膜在 65°C 下孵育 30 分钟后，使用浴式超声仪（Branson 3510E-DTH；Branson，Danbury，CT，USA）对脂质体悬浮液进行超声处理。为了减小脂质体直径，在冰水浴中使用探针超声仪在诸如脉冲 5 秒和 2 秒关、振幅 20% 和能量 36 J/脉冲等条件下对脂质体悬浮液进行超声处理，或磁力搅拌下的水浴。为了去除卸载到纳米脂质体中的 AS，在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中使用透析管纤维素膜（14,000 分子量截止（MWCO）；Sigma-Aldrich Corp., St.美国密苏里州圣路易斯）。在使用柠檬酸缓冲液制备纳米脂质体悬浮液的情况下，使用 300 mM 碳酸氢钠缓冲液将溶液的 pH 值调节至约 6.5，以在纳米脂质体内部和外部之间形成梯度。

DOX 加载到 ERL 封装的纳米脂质体中

为了将 DOX 封装到 ERL 封装的纳米脂质体中，首先在 65°C 下将 DOX 盐酸盐溶解在 0.9% NaCl 水溶液中。通常，将 2 mL 的 1.5 mg/mL DOX 溶液添加到 8 mL 的 AS 和 ERL 封装的或柠檬酸和 ERL 封装的纳米脂质体悬浮液中。添加 DOX 的纳米脂质体悬浮液的载药过程包括孵育、使用浴式超声波仪进行超声处理、室温 (RT) 平衡以及使用透析管纤维素膜对 PBS (pH 7.4) 进行透析以从细胞中去除未封装的 DOX纳米脂质体悬浮液。使用四个实验组研究了 DOX 加载条件对 DOX EE 的影响。第 1 组是 DOX 溶液和脂质体的混合物，按照 65°C 孵育 30 分钟、65°C 超声 5 分钟和透析过夜的顺序对其进行处理。第 2 组在 65°C 下孵育 30 分钟，在 65°C 下超声处理 5 分钟，在室温下平衡 30 分钟，然后透析过夜。第 3 组在 65°C 下孵育 30 分钟，在 65°C 下超声处理 15 分钟，然后透析过夜。第 4 组在 65°C 下孵育 30 分钟，在 65°C 下超声处理 15 分钟，在室温下平衡 30 分钟，然后透析过夜。

双药物包裹纳米脂质体的直径、形态和物理稳定性

使用粒度分析仪（ELS-Z；Otsuka Electonics Co., Ltd.，Osaka，Japan）在 25°C 下测量药物包封的纳米脂质体的直径。使用场发射透射电子显微镜（FE-TEM）（JEM 2100F；JEOL Ltd.，Tokyo，Japan，安装在韩国基础科学研究所）在 200 kV 下观察单或双药物包封的纳米脂质体的形态和平均直径。为了制备样品，将纳米脂质体悬浮液滴铸到涂有碳的铜网格上，网格在室温下风干，然后在显微镜下观察。通过监测脂质体直径随时间的变化，研究了在 PBS (pH 7.4) 中孵育的双药物包裹纳米脂质体在 4、25 和 37°C 的不同温度下的物理稳定性。使用粒度分析仪（Zetasizer Nano ZS，Malvern Instruments Limited，Worcestershire，UK）测量脂质体直径。

药物的 EE

DOX 或 ERL 在双药物封装纳米脂质体中的封装效率 (EE) 通过以下方程确定。 (1).

其中 C f 是在用 10% Triton-X 100 破坏纳米脂质体以完全释放 ERL 或 DOX 之后测量的纳米脂质体中 ERL 或 DOX 的包封量。 ERL 的吸光度使用紫外可见分光光度计（DU-800 分光光度计；Backman Coulter Inc.，Fullerton，CA，USA）在 345 nm 处测量，DOX 的荧光强度使用分光荧光计（SFM-25；Tegimenta AG，Rotkreuz ，瑞士）分别在 495 和 590 纳米的激发和发射波长下。 ERL 或 DOX 的量使用预先准备的 ERL 或 DOX 的校准曲线计算。 C 我 是添加到脂质混合物或 ERL 封装的纳米脂质体中的 ERL 或 DOX 量。通过测量每种药物在相应波长下的吸光度或荧光强度来确定数量。

药物发布

透析盒（10,000 MWCO，Slide-A-Lyser Dialysis Cassette G2；Thermo Scientific Corp.，Rockford，IL，USA）充满了用 DOX 和 ERL 封装的纳米脂质体悬浮液。将盒置于 PBS (pH 7.4) 中，并在 37°C 下连续搅拌释放测试介质。在预定的时间点，从盒中取出等分试样以确定每种药物的浓度，然后通过以下方程计算药物释放。 (2).

其中 D t 是释放测试期间和 D 在给定时间保留在纳米脂质体中的 DOX 或 ERL 的浓度 我 是药物释放实验前包裹在纳米脂质体中的 DOX 或 ERL 的浓度。 DOX 浓度是通过用荧光光谱仪分别在 495 和 590 nm 激发和发射波长处测量样品的荧光强度来确定的。 ERL 浓度是通过使用紫外-可见光谱仪测量样品在 345 nm 处的吸光度来确定的。

统计分析

除非另有说明，结果均以平均值 ± SEM表示。

结果与讨论

制备工艺对纳米脂质体特性的影响

制备双药物包裹的纳米脂质体，将 ERL 包裹在脂质双层膜中，将 DOX 包裹在纳米脂质体的内部隔室中。仅用 ERL 封装的脂质体是通过用 AS 水溶液水合掺入 ERL 的脂质膜制备的。在这些过程中，ERL 分子通过疏水性吸引力结合到脂质膜中，然后自发地封装到脂质体的脂质双层膜中。水合后，脂质体悬浮液使用喇叭型探头超声仪进行超声处理，以减小脂质体直径。为了研究超声处理和冷却方法对脂质体直径的影响，在不同冷却条件下增加超声处理时间对脂质体进行处理，结果如图 2 所示。图 2a 表示超声处理时间对脂质体直径的影响在冰水浴冷却条件下处理的脂质体的直径和多分散指数（PDI）。未经超声处理的 ERL 封装脂质体的直径为 759 ± 44 nm。然而，直到超声处理 10 分钟，脂质体直径才显着降低至 222 ± 40 nm，10 分钟后，随着超声处理时间的增加，脂质体直径没有明显变化。这些结果表明，通过水合作用形成的 ERL 包裹的脂质体主要是多层囊泡 (MLV)。通过超声处理传递给 MLV 型脂质体的高能量会剥落多层 MLV 并分解大脂质体。在水溶液中，与 MLV 分离的脂质通过疏水性吸引力自组装，从而转化为大单层囊泡 (LUV) 或小紫外线 (SUV) 型纳米脂质体。随着这些现象的重复，平均纳米脂质体直径逐渐减小 [24,25,26]。如图 2a 所示，脂质体的直径在短时间的超声处理中显着减小。据认为，在此期间，大部分 MLV 型脂质体转化为 LUV 或 SUV 型脂质体[27]。超过 10 分钟的超声处理导致脂质体直径略有减小，表明随着超声处理时间的延长，囊泡类型的转化较少。脂质体直径的 PDI 随着超声处理时间的增加而降低，表明尽管 20 分钟后 PDI 略有增加，但脂质体直径随时间变得均匀。图 2b 表示超声波处理时间对在水浴冷却条件下处理的脂质体的直径和 PDI 的影响。未经超声处理的脂质体的直径为 1433 ± 143 nm。脂质体直径显着降低至 337 ± 67 nm，直到超声处理 5 分钟，5 分钟后，直径逐渐减小，直到 15 分钟，随后直径几乎没有变化。脂质体直径的 PDI 随超声处理时间而变化，直至 15 分钟，此后达到平台期。在水浴条件下，脂质体直径减小到未处理脂质体直径30%以下的时间比冰水浴条件下的时间短。据认为，脂质体直径的减小是通过将超声产生的热能转移到 MLV 型脂质体来实现的。与冰水浴条件相比，在水浴条件下超声处理的脂质体悬浮液的温度升高得太高，这意味着由于超声空化的整体加热而发生的脂质体悬浮液的热量释放效率较低。为了防止脂质体悬浮液出现副作用，例如介质蒸发和过热引起的脂质分子可能变质，选择冰水浴作为超声处理的冷却条件。另一方面，超声处理的脂质体被透析以去除未封装的 AS。使用超声处理和透析制备的 ERL 和 AS 封装的纳米脂质体的平均纳米脂质体直径约为 140 nm，表明通过透析纳米脂质体直径略有减小。采用AS梯度法将ERL和AS包封的纳米脂质体用于DOX包封到纳米脂质体的内室中。

探针超声时间对 ERL 包裹的纳米脂质体直径和多分散指数的影响：冰水浴 (a ) 或水浴 (b ) 在超声处理期间冷却容器中的脂质体悬浮液 (n =3，数据表示为平均值 ± SEM)

图 3 显示了 DOX 和 ERL 封装的纳米脂质体的直径，根据在 DOX 加载过程中使用浴式超声波仪进行超声处理的时间。直径的低变化与 ERL 封装的纳米脂质体超声 10 分钟后的相似，如图 2a 所示。尽管超声处理时间增加，纳米脂质体直径直到超声处理 45 分钟才发生显着变化。这些结果可归因于 DOX 和 ERL 封装的纳米脂质体是 LUV 或 SUV [27]。同时，当超声处理时间超过 45 分钟时，平均纳米脂质体直径的 SEM 出现增加，表明脂质体样品之间的差异增加。随着超声处理时间的增加，直径的 PDI 降低。这些结果表明，尽管超声处理 60 分钟后 PDI 略有增加，但脂质体直径的均匀性随着超声处理时间的增加而增加。简而言之，在脂质体从 MLV 转化为 LUV 或 SUV 的转化阶段，超声处理引起的纳米脂质体直径变化最大。因此，当在脂质膜的水化和DOX包封到ERL包封的纳米脂质体的内部隔室之间进行较短持续时间的处理时，超声处理减小脂质体直径是最有效的。

超声浴时间对 DOX 和 ERL 包裹的纳米脂质体直径和多分散指数的影响 (n =3，数据表示为平均值 ± SEM)

载药方法对EE的影响

双药物包裹的纳米脂质体是使用 DOX 加载到 ERL 包裹的纳米脂质体中制备的，ERL 的 EE 约为 30%，纳米脂质体直径为 140 nm。在用表面活性剂破坏脂质体以从脂质体中完全释放药物后，测量脂质体中封装的 DOX 或 ERL 的量。 DOX的荧光强度和ERL的吸光度分别用荧光分光光度法和紫外-可见分光光度法测量。为了研究 DOX 加载方法对 ERL 和 DOX 包裹的纳米脂质体中 DOX EE 的影响，采用主动加载方法，如 pH 梯度或 AS 梯度方法将 DOX 包裹到脂质体中。考察了两种载药方式的EE差异，结果如图4所示。AS-梯度法DOX的EEs在90%以上，pH-梯度法的EEs约为17%，表明AS-梯度法比pH-梯度法更有效地包封DOX[28]。

根据 DOX 负载方法和硫酸铵 (AS) 浓度：CA 柠檬酸 (n) 在双药物封装纳米脂质体中的 DOX 封装效率 =3，数据表示为平均值 ± SEM)

当根据 AS 浓度比较 DOX 的 EE 变化时，EE 最高，EE 的 SEM 在 350 mM AS 时最低。 AS梯度或pH梯度法利用药物易位机制，由于纳米脂质体跨膜离子浓度梯度产生的驱动力，诱导纳米脂质体外部的药物迁移到纳米脂质体的内部隔室[29, 30]。但是，AS 梯度法 DOX 的 EE 远高于 pH 梯度法。这些结果可以归因于这样一个事实，即 AS 梯度法比 pH 梯度法更有效地开发结晶复合物，因为电离的 DOX 与纳米脂质体内的抗衡离子之间具有更高的结晶性 [31, 32]。

载药条件对 EE 的影响

为了研究 DOX 溶液和 ERL 包裹的纳米脂质体混合物的处理条件在 DOX 加载过程中对 DOX EE 的影响，根据不同的处理条件设计并实验了图 5a 所示的四个实验组。第 1 组是按照孵育、超声处理和过夜透析的顺序处理的混合物。在第 2 组中，为了研究超声处理混合物的平衡对 EE 的影响，将混合物孵育、超声处理、在室温下平衡 30 分钟，然后透析过夜。作为研究长期超声处理对 EE 影响的一组，第 3 组是混合物孵育，在 65°C 下超声处理 15 分钟，然后透析过夜。此外，作为研究长期超声处理和平衡对 EE 的影响的组，第 4 组是孵育的混合物，在 65°C 超声处理 15 分钟，在室温平衡 30 分钟，然后透析过夜。在所有组中，使用 AS 梯度法进行 DOX 加载。如图 5b 所示，第 1、2、3 和 4 组的 DOX 的 EE 分别为 93 ± 7.8、98 ± 2.5、83 ± 4.9 和 59 ± 4.2%。与第 3 组的 EE 相比，第 1 组的 EE 更高，表明较短的浴超声处理时间是增加纳米脂质体中 EE 的更有效处理。与第 1 组的 EE 相比，第 2 组的 DOX EE 更高。第 4 组的 EE 在所有实验组中最低。与第 2 组短期超声处理后平衡的 EE 增强相反，第 4 组长期超声处理后的平衡对 EE 增强无效。这些结果可能是由于传递给悬浮液的能量过多，这可能会在上述浴声处理过程中破坏纳米脂质体。此外，据认为，在第 3 组和第 4 组中，通过长期水浴超声处理，由于纳米脂质体中 AS 含量的降低，EE 降低。由于纳米脂质体悬浮液的温度升高远远超过相变温度（T c ) 通过长期的浴超声处理，脂质双层的流动性增加，因此诱导脂质体中的 AS 释放。第 3 组的纳米脂质体样品在超声浴后立即透析，表明样品快速冷却。相比之下，第 4 组的纳米脂质体样品通过长期水浴超声处理然后平衡，这可能会维持 AS 释放，增加脂质体外 DOX-硫酸盐复合物的形成，从而降低 EE。虽然长期超声处理后的平衡无效，但这些结果表明 DOX 加载过程，例如 DOX 溶液和 ERL 封装的纳米脂质体的混合物的顺序处理 - 高于 T c 磷脂，水浴超声处理，低于 T 的平衡 c 例如，在 RT 和过夜透析——是一种比其他未经平衡处理的过程更有效的提高 EE 的方法 [33,34,35]。

不同载药条件下DOX在双载药纳米脂质体中的包封率：各实验组载药条件(a ) 和实验组的药物包封率 (b ) (n =3，数据表示为平均值 ± SEM)

双药物包裹纳米脂质体的形态和物理稳定性

图 6 显示了通过 TEM 观察到的纳米脂质体的形态。用于 TEM 观察的样品是通过将 ERL 和 DOX 共同封装的纳米脂质体滴铸到碳涂层铜网上并在室温下在空气中干燥来制备的。为了比较双药物包裹脂质体与单药物包裹脂质体的特性，通过透射电镜观察 ERL 包裹或 DOX 包裹的纳米脂质体的形态。如图 6a 所示，双药物包裹的纳米脂质体的直径小于 200 nm，形状接近球形。通过 TEM 分析观察到的脂质体直径与使用动态光散射的粒度分析仪测量的值一致。图 6b 显示了在脂质体内含有 DOX-硫酸盐复合物的单个纳米脂质体的图像。复合物被假定为通过质子化 DOX 阳离子和二价硫酸根阴离子之间的吸引力形成的晶体 [36]。图 6c 显示了高分辨率 (HR-) TEM 图像，其显示了图 6b 中纳米脂质体最外层区域的药物晶体。该图像显示，纳米脂质体内部隔室中的高度结晶晶格和结晶度较低的区域具有靠近网格上碳的无定形区域 [37]。纳米脂质体最外层区域的无定形域可能是由于脂质双层暴露于高能量电子束时的不稳定性。图 6d 中的选区电子衍射 (SAED) 图案显示出规则的明亮衍射点，表明图 6c 中所示的晶体具有高度有序的晶格 [38]。为了比较双药物包裹的纳米脂质体与单一药物包裹的纳米脂质体的 TEM 分析结果，通过 TEM 观察 ERL 包裹的纳米脂质体，图像如图 6e 所示。通过 HR-TEM 观察图 6e 中存在的纳米脂质体的最外区域，结果如图 6f 所示。 From the result, it was found that the outermost region was composed of a number of small crystals and amorphous domains adjacent to the carbon on the grid. Figure 6g shows a SAED pattern of the crystals shown in Fig. 6f. The SAED pattern exhibited a ring made up of small spots arising from the individual crystals. Therefore, it is considered that the ERL intercalated between the lipid bilayer are present as small crystals with less ordered orientation [39]. On the other hand, as the other comparison, TEM analysis of the DOX-encapsulated nanoliposomes was carried out and the result is shown in Fig. 6h. The morphology and the diameter of the nanoliposome observed by TEM were similar to those of the dual drug-encapsulated nanoliposome. The HR-TEM image shown in Fig. 6i confirmed the crystalline lattice of the DOX-sulfate formed inside of the DOX-encapsulated liposome. The SAED pattern shown in Fig. 6j suggest that the crystals inside the liposome have a highly ordered crystalline lattice. These results verify that the diffractions of the ERL- and DOX-encapsulated nanoliposome by the electron beam were originated predominantly not by the ERL crystals in the lipid bilayer but by the DOX-sulfate crystals inside the nanoliposome. In summary, the morphology of the dual drug-encapsulated nanoliposomes and the crystals of each drug formed in the liposomes were identified by TEM, HR-TEM, and SAED analyses [40].

Transmission electron microscopy (TEM) and selected area electron diffraction (SAED) analyses of dual drug- or single drug-encapsulated nanoliposomes:ERL- and DOX-encapsulated nanoliposomes (scale bar, 200 nm) (a ), a single nanoliposome containing ERL and DOX-sulfate complexes (scale bar, 50 nm) (b ), a high resolution- (HR-) TEM image representing DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome and ERL crystals in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (c ), a SAED pattern of DOX-sulfate crystals and ERL crystals present in a nanoliposome (d ), a single nanoliposome encapsulated with ERL (scale bar, 50 nm) (e ), a HR-TEM image representing small crystals of ERL and amorphous domains in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (f ), a SAED pattern of ERL crystals present in an outermost region of the nanoliposome (g ), a single nanoliposome encapsulated with DOX (scale bar, 100 nm) (h ), a HR-TEM image representing crystalline lattices of DOX-sulfate inside the nanoliposome (sale bar, 5 nm) (i ), and a SAED pattern of DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome (j )

As a result of a physical stability study on the dual drug-encapsulated nanoliposomes, Fig. 7 shows the percent change in diameter of the nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at 4, 25, and 37 °C, respectively, as a function of the time. When incubated at 4 °C, in comparison with the initial diameter at day 0, the diameter of the nanoliposomes increased by 14.8% on day 5 and varied thereafter in a smaller extent of change in the diameter. The overall change of the diameter, however, was in a range of ± 15.0% during the stability test period. At 25 °C, the diameter of the nanoliposomes increased by 10.9% on day 5 and then decreased − 8.0% on day 19, indicating that the overall change was in a range of ± 10.0% during the test period. In addition, at 37 °C, the overall change in the diameter of the nanoliposomes was in a range of ± 6.0% during the test period, showing the smallest degree of change compared with the other test conditions. Based on the fact that in all three conditions tested, there was no significant change in the diameter of the nanoliposome, it is considered that the nanoliposomes prepared in our study have the physical stability in PBS (pH 7.4) for at least 3 weeks without aggregation or flocculation, which can affect therapeutic efficacy, targeting, and toxicity of the drug(s) encapsulated in the nanoliposomes. It has been acknowledged that the two important factors determining physical stability of nanoliposomes are T c of phospholipid(s) and a content of cholesterol constituting the nanoliposomes [41]. The high stability of the nanoliposomes at 37 °C may be due to the low probability of phase transition of the phospholipid bilayer made up of DSPC, which has a high T c and is utilized in general as a main lipid component in various liposome formulations. Also, a high composition ratio such as 40 wt% of cholesterol in the nanoliposomes seems to contribute to enhance the physical stability of the nanoliposomes [42]. On the other hand, nonetheless a low T c (− 2 °C) of POPG having a double bond in its one acyl chain, a very low composition ratio such as 3 wt% of POPG had little effect on the stability of the nanoliposomes.

Stability of dual drug-encapsulated nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at different temperatures of 4, 25, and 37 °C, respectively:percent change in nanoliposome diameter relative to initial diameter as a function of incubation time

Time-Differential Drug Release

There are a number of systems that can carry two kinds of drugs with different physicochemical properties on one vehicle. The representative examples are a micelle system containing the two drugs in the same compartment of the system, a polymer matrix system composed of different compartments containing each drug, and a liposome or a polymersome system containing each drug in the core and shell of the system, respectively [43,44,45,46]. In particular, when sequential actions of the two drugs are essential to cause a synergistic effect of the drugs, the time-differential release of each drug from the dual drug-encapsulated carrier is highly important. The in vitro time-differential release of DOX and ERL from the dual drug-encapsulated nanoliposomes was investigated, and the results are shown in Fig. 8. The releases of DOX and ERL from the nanoliposomes were monitored against a test medium, PBS (pH 7.4), under continuous stirring. The released amount of DOX or ERL after designated release test period was calculated measuring the fluorescence intensity of DOX and the absorbance of ERL with the fluorescence spectrometer and the UV-Vis spectrometer, respectively.

In vitro release profiles of ERL and DOX from dual drug-encapsulated nanoliposomes:time-differential release (a ) and release rates of ERL and DOX (b ) (n  = 3, the data are presented as mean ± SEM)

As shown in Fig. 8, the ERL release was 36 ± 0.01%, while the DOX release was less than 10% until 8 h of the release test period. In particular, during this period, the release rate of ERL was much faster than that of DOX. By 48 h, 65 ± 0.07% of ERL were released from the nanoliposomes in contrast to 30 ± 0.01% release of the DOX. The release rates of ERL and DOX are shown in Fig. 8b. Until 8 h, the release rate of ERL was more than 4% per hour in contrast to less than 1% per hour of the DOX release rate. After 8 h, the release rate of ERL was slowed down. Compared with the release of ERL, DOX showed a slow release and had an almost zero-order release rate. These results suggest that during the initial period of release test, much more amounts of ERL were released from the liposomes than those of DOX and there was a time-differential release between ERL and DOX. The sequential release of the drugs was thought to be originated from the difference between the physicochemical states of each drug in the liposomes [28, 32, 47]. These results on the dual drug-encapsulated nanoliposome system can contribute to translation of in vitro synergistic effects of two kinds of drugs into the clinic through overcoming both the difference between PK properties of each drug and the difficulty in targeting the same cancer cells in proper temporal sequence.

结论

As a dual drug delivery system, a nanoliposomal delivery system encapsulating both ERL and DOX was prepared and characterized. The liposome diameter was controllable by ultrasonication, and the sonication for diameter reduction was effective when carried out after the film-hydration and before DOX encapsulation. The nanoliposome diameter decreased remarkably during an initial period of ultrasonication. DOX was loaded into ERL-encapsulated nanoliposomes through pH- or AS-gradient method. AS-gradient method showed higher EE of DOX than pH-gradient, and the AS concentration for higher EE of DOX was determined. Equilibration of a mixture of DOX solution and ERL-encapsulated nanoliposomes in DOX-loading process was advantageous for EE increase of DOX. By HR-TEM and SAED analyses of the dual drug-encapsulated nanoliposomes, not only the highly oriented crystals formed between protonated DOX cations and divalent sulfate anions inside the liposome but also the less oriented small crystals of ERL in the outermost layer of the nanoliposome were identified. ERL and DOX co-encapsulated in the nanoliposomes showed a time-differential release, indicating much faster release of ERL than that of DOX from the liposomes. The elucidated preparation methods of the nanoliposomal dual drug delivery system can contribute to development of advanced dual drug delivery systems and translational researches of the combination therapies exhibiting synergistic effects via sequential actions of the drugs.

缩写

DOX:

Doxorubicin

DSPC:

1,2-Distearoyl-sn -glycero-3-phosphocholine

EE：

Encapsulation efficiency

EPR:

Enhanced permeability and retention

ERL:

Erlotinib

PK:

Pharmacokinetic

POPG:

1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-phospho-(1′-rac -glycerol) (sodium salt)

SAED：

选区电子衍射

SEM：

Standard error of mean

T c ：

Phase-transition temperature

TEM：

透射电子显微镜