黄豆苷元长循环脂质体的制备和药代动力学研究

背景

Daidzein 是一种仅存在于大豆和其他豆类中的天然化合物，在结构上属于一类被称为异黄酮的化合物。据报道，黄豆苷元具有预防和治疗心血管疾病 [1]、缓解更年期 [2]、骨质疏松症 [3]、降低某些激素相关癌症风险 [4] 和抗炎作用 [4] 的药理活性。 5]。由于化学结构，黄豆苷元的水溶性和脂溶性很差，口服后主要在肠道吸收，易代谢形成葡萄糖醛酸结合物或硫酸结合物[6,7,8,9,10]。为了改善其较差的生物利用度，最近的研究集中在其新型给药系统，如黄豆苷元磷脂复合物[11]、黄豆苷元自组装胶束[12]和聚乳酸纳米颗粒[13]。

脂质体是一种有效的药物载体系统，可以包裹疏水性药物、亲水性药物以及与磷脂相互作用的药物[14、15]。由于其非常好的生物相容性，脂质体可以增加肠道通透性，减少化学和生物降解，减少药物的非特异性副作用[16]。然而，常规脂质体的使用不能完全克服它们与血清成分的结合和单核吞噬细胞系统（MPS）的吸收[17]。为了克服这些问题，在过去几年中开发了用亲水性或糖脂如（聚乙二醇）（PEG）或单唾液酸神经节苷脂（GM1）修饰的长循环脂质体。研究表明，长循环脂质体载体表面PEG的存在会形成一层亲水性保护膜，可以防止脂质体与血清中的多种成分相互作用并被吞噬细胞识别消耗[18]。因此，长循环脂质体可以通过减少 MPS 的摄取来延长血液循环时间，从而提高药物的生物利用度 [19, 20]。本文对黄豆苷元长循环脂质体(DLCL)的制备方法及其体外释放和大鼠药代动力学特性进行了研究。研究结果为DLCL的临床应用提供了实验依据。

方法

材料

大豆磷脂酰胆碱 (SPC) 购自 Lipoid GmbH (Germany)。胆固醇和 DSPE-mPEG2000 购自 AVT Pharmaceutical Co., Ltd.（中国上海）。 HPLC 级甲醇和乙腈购自 TEDIA 公司（美国）。氯仿和甲醇（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。水通过 Milli-Q® 水纯化系统（（美国密理博）进行纯化。大豆苷元（纯度≥ 98%）购自元野生物科技有限公司（中国上海）。芹菜素（内标，IS，纯度≥ 98%）购自德尔格医药科技有限公司（中国南京）。磷钨酸水合物（分析级）购自麦克林有限公司（中国）。吐温80和乙基醋酸购自Sigma（美国密苏里州）。甲酸（MS级）购自Fischer（美国）。

动物

10只雄性Sprague-Dawley大鼠（200-210 g）购自湖北省疾病预防控制中心，许可证号SCXK（E）2017-0012。动物实验经湖北大学伦理委员会批准，符合实验动物护理和使用指南。

大豆苷元长循环纳米脂质体 (DLCL) 的制备

以粒径和包封率（EE）为评价指标，进行四因素三水平正交设计（表3），优化SPC与胆固醇摩尔比（A）的最佳匹配，在DSPE-mPEG2000含量为5%的条件下，药物（黄豆苷元）对总脂质（SPC和胆固醇）（w/w）（B）、水合温度（C）和超声时间（D）的影响[21, 22] .

DLCL 采用薄膜蒸发-超声法制备[21]：将大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-mPEG2000 和黄豆苷元溶解在圆底烧瓶中，加入 10 mL 氯仿-甲醇（1:4，v/ v) 混合物。在真空和40 ℃（水浴）条件下，将混合物在旋转蒸发仪（RE-2000A，上海一荣生化仪器厂，中国）中干燥成薄膜，然后用20 mL在冰浴中通过超声处理 (80 w) 24 分钟的超纯水。脂质体悬浮液依次通过0.45 μm和0.22 μm微孔膜过滤，挤出3次。制备好的DLCL溶液在4 °C下保存。长期保存需要在DLCL悬液中加入3%的蔗糖（用作冻干保护剂）并在- 20 °C下冻干保存。

HPLC法测定DLCL中的大豆苷元

柱为Phenomenex ODS分析柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）连接到保护柱（30 mm × 10 mm，3 μm），柱温为40 ℃。流动相由 10 mM 醋酸铵水溶液 (A) 和甲醇 (B) 组成，梯度洗脱如下：0-3.0 min，45% B 至 80% B； 3.0–4.0 分钟，80% B； 4.0–6.0 min，80% B 到 45% B。流速为 1 mL/min。检测波长为240 nm。进样体积为 10 μL。黄豆苷元的线性范围为0.313-50 μg/mL，回归方程为y =35,461x + 1802.4, R ² =0.9999。黄豆苷元的保留时间为 4.30 min，未发现 DLCL 配方对黄豆苷元的测定产生干扰（图 1）。对分析方法的精密度、重现性、稳定性和样品回收率进行了严格考察，满足定量分析要求（表1）。

空白脂质体的典型色谱图 (a ), 黄豆苷元对照品 (b ) 和 DLCL 示例 (c )

正交试验筛选处方

以粒径和包封率（EE）为评价指标，进行四因素三水平正交设计，优化SPC与胆固醇摩尔比（A）、药物质量比（黄豆苷元）的最佳匹配在DSPE-mPEG2000含量为5%的条件下对总脂质(SPC和胆固醇)(w/w)(B)、水化温度(C)和超声时间(D)的影响[21, 22]。

DLCL 的直径和形态

通过激光粒度分析仪（Zetasizer Nano90，Malven Instruments Limited，Worcestershire，UK）在室温、230 V和50 HZ下测量制备的DLCL溶液的粒径和zeta电位。将配制好的DLCL溶液用纯水稀释10倍后用镊子从铜网边缘取下。在室温下干燥并用磷钨酸水溶液（2％，w / v）复染后，使用场发射透射电子显微镜（JEM-2100（HR），JEOL Ltd.）观察完全干燥的DLCL的形貌。 ，东京，日本）在加速度 200 kV 和发射机 LaB6。

DLCL 的 EE 和载药量

制备的DLCL的EE和载药量通过如下所述的透析方法测定：(1)将500 μL制备的DLCL溶液加入到截留分子量为8000-14,000的透析袋中(BioSharp Sai-Guo Biotechnology Co., LTD)，然后将透析袋两端扎紧，将透析袋放入 20 mL 的水（透析液）中。振摇12 h后，取1 mL透析液，12000 rpm离心10 min，测定游离药物浓度（C 1) 在上清液中。 (2)取500微升制备的DLCL溶液与2000 μL甲醇混合，涡旋15 min破坏脂质体，12000 rpm离心10 min，测定总药物浓度(C 0) 在上清液中。 (3) 10 毫升制备的DLCL溶液(V 0) 冻干称重固体粉末质量 (W 0）。 (4) EE和载药量按以下公式计算：

体外药物释放

DLCL和游离黄豆苷元的体外释放通过透析法测定。模拟胃液为含0.5% Tween-80的0.1 mol/L HCl(pH 1.2)，模拟肠液为含0.5% Tween-80的25 mM PBS缓冲液(pH 6.9)。将制备好的DLCL溶液0.5 mL加入截留分子量为8000-14000的透析袋中，分别放入20 mL的两种释放介质中。在 37 °C 下连续搅拌 (100 rpm) 释放测试介质。在指定的时间点（0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72、96、120 和 144 h），样品的等分试样（1 mL ) 从透析液中取出，然后补充等量的新鲜释放介质。以每毫升1毫克黄豆苷元（溶于DMSO）为对照，分别置于上述两种释放介质中进行相同处理。各时间点测定大豆苷元，按公式计算累积释放率：

式中，V 1为每个时间点的采样量，V 2 是透析介质的体积，C 1~C 我 是每个时间点测得的黄豆苷元浓度，V 0 和 C 0为加入透析袋的DLCL的体积和浓度。

DLCL 在大鼠体内的药代动力学

10 只雄性 Sprague-Dawley 大鼠随机分为两组（n =5)。一组为黄豆苷元（悬浮于0.5%羧甲基纤维素钠）组，另一组为DLCL（溶于水）组。两组黄豆苷元的剂量均为30 mg/kg。大鼠口服前禁食12 h，自由饮水。大鼠灌胃后，黄豆苷元组于3 min、5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min、60 min、5 min、10 min、15 min、45 min、每只大鼠眼底静脉丛取血0.5 mL。 、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h和36 h。同时，DLCL组于1 min、3 min、5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min、1.5 min、1.5 h、2 h、0.5 mL血, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h, 和 36 h。将血样置于肝素化离心管中，4000 rpm离心10 min，取血浆- 80 ℃保存。通过建立的LC-MS/MS方法测定血浆样品中黄豆苷元的含量，以获得其在受试大鼠中的药物-时间曲线。采用DAS3.0软件（中国药理学会专业会员，中国上海）采用非房室模型计算药代动力学参数。

LC-MS/MS 测定大鼠血浆中大豆苷元

大鼠血浆样品预处理如下：大鼠血浆（50 μL）、甲醇（10 μL）、内标（IS）芹菜素溶于甲醇（10 μL、500 ng/mL）和5%甲酸水溶液（100 μL） ) 在干净的 1.5 毫升试管中混合。短暂涡旋混合后，将 1.2 mL 乙酸乙酯加入混合物中。在室温下振摇5 分钟后，将混合物以12,000 rpm离心10 分钟。将得到的上层有机相 (1 mL) 转移到另一个干净的 1.5-mL 试管中，蒸发并重新溶解在流动相 (100 μL) 中。收集通过以 12,000 rpm 离心 10 分钟获得的上清液用于 LC-MS/MS 分析。大鼠血浆样品的定量条件描述如下： GL Inertsustain C18（100 mm × 2.1 mm，3 μm）连接到一个Shim-pack Column Holder保护柱（5.0 mm × 2.0 mm，1.6 mm，柱温为1.6 μm） 40 °C；流动相为水（A）-甲醇（B），50% B~80% B（0-2.00 min），80% B，流速0.2 mL/min梯度洗脱（2.00–4.00 分钟）、80% B 到 50% B（4.00–6.00 分钟）和 50% B（6.10–8.00 分钟）。进样体积为 10 μL。采用负离子多反应监测模式（MRM）检测黄豆苷元（m /z 253.0 → 224.15) 和 IS (m /z 269.00 → 117.05）。其他条件如下：ESI离子源，加热块温度400 °C，DL管加热温度250 °C，雾化气体（N 2）体积流量3.0 L/min，干燥气（N 2）体积流量15.0 L/min，离子喷雾电压- 4.5 V。黄豆苷元和内标（芹菜素）的保留时间分别为4.5 min和5.4 min，血浆中内源性物质不干扰测定黄豆苷元和内标（图 2）。定量方法学经过严格研究，符合生物样品定量分析的要求（表2）。

空白血浆的 HPLC (a )、黄豆苷元 + 芹菜素（内标） + 空白血浆（b ) 和血浆样本 (c ）。 1、黄豆苷元； 2、芹菜素（IS）

统计分析

数据表示为平均值 ± 标准偏差（SD）。使用单向方差分析 (ANOVA) 进行统计比较，然后使用 Tukey 检验。 p 处的值被认为具有统计学意义 <0.05。

结果与讨论

制备工艺对纳米脂质体特性的影响

正交试验设计及试验结果见表3，方差分析结果见表4。直观分析（表3）表明4个因素对粒径的影响顺序为药脂比> SPC-胆固醇比例> 水合温度> 超声时间，对包封率影响不大。方差分析（表 4）显示了药物-脂质比率； SPC-胆固醇比例对粒径有显着影响。 DLCL的最佳制备条件为A1B1C2D1，SPC与胆固醇的比例为55：40，药物与脂质的比例为1：10，水化温度为50 ℃，超声时间为24 min。

按照上述优化工艺并行制备三批DLCL。 EE为85.3 ± 3.6%，载药量为8.2 ± 1.4%。平均粒径为 156.1 ± 3.0 nm，PDI 为 0.294 ± 0.012，zeta 电位为 - 49 ± 0.6 mV。 DLCL 的粒径分布如图 3 所示，表明在优化的制备工艺条件下，制备的 DLCL 具有窄且均匀的粒径分布。 TEM观察到的DLCL颗粒的形状和结构呈圆形或椭圆形，尺寸基本均匀（图4）。

DLCL的粒径分布

DLCL的TEM照片

大豆苷元是典型的亲水亲油性较差的药物。药物与磷脂极性端的定向结合，可使两者均处于高度分散状态。药物的晶体特性受到抑制，脂溶性增加[11]。据报道，在黄豆苷元与脂质双层的相互作用中，约15%的黄豆苷元位于脂质体膜的亲水区域[23, 24]，其余分布于水/膜界面[25]。 TEM结果表明DLCL双结构明显，黄豆苷元的插入不影响脂质双结构。

制备工艺对体外药物释放的影响

体外释放实验结果如图5所示，在模拟胃液（0.1 mol/L HCL，含0.5% Tween-80）的释放介质中，黄豆苷元在1 h的累积释放率约为85%并在12 h完全释放； DLCL 在 1 h 时释放 18%，在 12 h 时释放 60%，在 48 h 时释放 100%。在模拟肠液的释放介质（含0.5% Tween-80的25 mM PBS缓冲液，pH 6.9）中，黄豆苷元的累积释放率在1 h时约为73%，在12 h时约为84%，在24 h时完全释放; DLCL在1 h释放3%，12 h释放59%，48 h释放100%。

DLCL 和游离黄豆苷元在含有 0.5% Tween 80 (a ) 和磷酸盐缓冲液 (pH 6.9) 含有 0.5% Tween 80 (b ) (mean ± SD, n =3)

体外释放实验结果表明，DLCL在pH 1.2和pH 6.9的透析介质中显着缓释，在pH 1.2的透析介质中的释放速度快于pH 6.9的透析介质。这可能是由于脂质双层结构在酸性条件下脆弱且稳定性差。

制备工艺对体内药代动力学的影响

黄豆苷元和DLCL单剂量口服后的平均血浆浓度-时间曲线见图6，两组黄豆苷元的主要非房室药代动力学参数见表5。 结果表明两组在等剂量黄豆苷元(30 mg/kg)下,DLCL组黄豆苷元血药浓度始终高于黄豆苷元组。 AUC0−t DLCL组黄豆苷元（血浆药物浓度-时间曲线下面积，代表单次给药后总吸收，反映药物吸收程度）为1515.52 ± 532.40 μg/L*h，为2.5倍大豆苷元组 (p <0.05)。此外，MRT0−t （平均停留时间，即清除体内63.2%的药物所需的时间）和t DLCL组黄豆苷元的1/2（消除半衰期，即末期血浆药物浓度减半所需的时间）分别比黄豆苷元组延长1.6倍和1.8倍（ <0.05)。药代动力学结果表明，DLCL不仅可以降低黄豆苷元的首过效应促进其口服吸收，而且可以延长其平均驻留时间以达到缓释作用。

口服单剂量黄豆苷元（30 mg/kg）后DLCL和游离黄豆苷元的平均血浆浓度-时间曲线（平均值 ± SD，n =5)

结论

据报道，纳米脂质载体，包括自乳化给药系统（SEDDS）、固体脂质纳米粒（SLN）和纳米结构脂质载体（NLC），可以有效提高溶解性、渗透性、胃肠道稳定性和药物的口服生物利用度。 SEDDS由无水各向同性油、乳化剂、辅助乳化剂、增溶剂和药物组成。通过对胃肠道脂质的乳化作用，增加药物的表面积吸收和渗透性，促进药物进入体循环。但SEDDS载药量低，容易发生药物结晶和体内沉淀，体内外结果相关性较差[26, 27]。 SLN 由药物、脂质和表面活性剂组成。 SLN具有独特的颗粒结构特征和可控释放的优势，用于包封抗癌药物时可以显着提高靶向性和促进癌细胞的摄取。然而，SLN 不适合包封亲水性药物和带阳离子电荷的药物[28]。 NLC是由液体和固体脂质混合形成的第二代脂质纳米粒，比SLN具有更高的稳定性。可以有效包裹疏水性分子，延长药物在体内的停留时间，但其制备成本较高[29]。

为了改善黄豆苷元口服生物利用度差的问题，最近的研究集中在其新型给药系统上，例如负载黄豆苷元-磷脂复合物的脂质纳米载体，具有 91.7 ± 1.5% 的 EE 和 6.87 倍的 AUC [11]、黄豆苷元-自组装纳米递送系统，EE 的 85.9 ± 2.7% 的 AUC 增加了 9 倍 [12]，黄豆苷元-PLGA 纳米粒子的 EE 的 81.9% 和 AUC 的增加了 5.57 倍 [13]。

在目前的工作中，优化条件下制备的DLCL的EE和载药量分别为85.3 ± 3.6%和8.2 ± 1.4%。 DLCL在pH 1.2和pH 6.9介质中的体外完全释放时间分别是游离药物的4倍和2倍。大鼠口服单剂量黄豆苷元（30 mg/kg）和DLCL（含等剂量黄豆苷元）后，t 1/2, MRT0−t , 和 AUC0–t DLCL组黄豆苷元含量较黄豆苷元组分别升高1.8、1.6、2.5倍，说明DLCL促进大鼠口服吸收，延长黄豆苷元在大鼠体内的平均驻留时间。

数据和材料的可用性

作者声明，材料、数据和相关协议可立即提供给读者，无需材料转让协议中的不当资格。本研究中生成和分析的所有数据均包含在本文中。

缩写

AUC：

时间-浓度曲线下面积;

C 最大：

峰浓度

DL 管：

溶剂管

DLCL：

大豆苷元长循环脂质体

DSPE-mPEG2000：

二硬脂酰磷酸乙醇胺-PEG2000

EE：

封装效率

ESI：

电喷雾电离

HPLC：

高效液相色谱

IS：

内标

LC-MS/MS：

液相色谱-串联质谱

m /z ：

质荷比

MPS：

单核吞噬细胞系统

MRM：

多反应监测模式

捷运：

平均停留时间

MS：

质谱

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

PDI：

多分散指数

PEG：

聚乙二醇

RSD：

相对标准推导；

标准差：

标准差

SEM：

均值的标准误

SPC：

磷脂酰胆碱

t 1/2 :

消除半衰期

TEM：

透射电子显微镜

T 最大：

浓度达峰时间