15 nm金纳米颗粒对HT29结肠癌与SPEV胚肾细胞增殖、凋亡及球体形成的影响

摘要

细胞培养模型为评估纳米材料潜在毒性、剖析其对癌症生物学机制影响提供可靠平台。本研究评价15 nm柠檬酸稳定金纳米颗粒（AuNPs）对两种不同来源上皮细胞系的影响：持续性猪胚肾细胞系SPEV和人结直肠癌细胞系HT29。暴露于1-12 µg/mL AuNPs浓度范围，监测细胞黏附、增殖、凋亡/坏死及多细胞球体形成能力。结果显示：6-12 µg/mL AuNPs显著抑制两系细胞增殖、增加早晚期凋亡/坏死群体；低剂量（1-3 µg/mL）刺激球体形成，高剂量在悬浮培养中表现细胞毒性和抗粘附效应。结果揭示AuNPs剂量依赖性双重角色，支持其作为靶向抗癌策略持续探索。

研究背景

金纳米颗粒（AuNPs）凭借生物相容性、光学性质和新兴治疗潜力，在乳腺、肝、胃、结肠、肺等多种癌症研究中备受青睐。AuNPs独特理化性质——尺寸、形状、表面电荷、浓度——决定其细胞摄取、分布和生物学效应。尽管多研究聚焦AuNPs抗癌功效，但在临床相关模型中全面毒性谱分析对安全转化至关重要。

AuNPs靶向递送至肿瘤组织仍具挑战；不同来源上皮细胞摄取速率差异已有报道。膜成分、糖蛋白表达、内吞能力差异可能是根本原因，凸显正常与恶性上皮细胞系比较研究必要性。

细胞培养分析提供可控环境剖析细胞对AuNPs响应，兼顾安全评估与治疗优化。本研究利用黏附、增殖、凋亡/坏死、球体形成指标，比较AuNPs对正常样胚肾系（SPEV）和结直肠癌系（HT29）的影响。

实验方法

SPEV细胞培养

SPEV细胞维持于DMEM（Sigma，美国）含5% FCS（HyClone，美国）、青霉素/链霉素（PAA，奥地利）、两性霉素B（5 µg/mL）。接种密度0.5-2×10⁴ cells/cm²，5% CO₂、95%湿度培养。每48 h换液，汇合时传代，保持单层形态。

HT29细胞培养

HT29细胞生长于RPMI-1640（Sigma，美国）含10% FCS、2 mM L-谷氨酰胺、40 mg/mL庆大霉素（Sigma，美国）。工作密度0.5-4×10⁴ cells/cm²。细胞来源于乌克兰国家科学院RE Kavetsky实验病理、肿瘤学与放射生物学研究所细胞库。

AuNPs处理

AuNPs经柠檬酸还原法合成，由俄罗斯科学院植物与微生物生物化学与生理学研究所提供。平均粒径15 nm，储存浓度57 µg/mL。暗场电镜和消光谱确认粒径分布（图1）。细胞经1、3、6、12 µg/mL AuNPs处理24-48 h；未处理培养为对照。

黏附与增殖实验

黏附量化：播种后30、60、120、180、1440 min倒置显微镜计数贴壁扁平细胞。增殖1-4天经胰酶-EDTA消化、Goryaev计数板计数。数据为均值±标准误。

凋亡/坏死评估

AuNPs暴露4天后，Annexin-V/7-AAD染色，流式细胞术（FACS Calibur，BD）分析，WinMDI v2.8处理数据。

多细胞球体形成

球体制备：24孔板涂1%琼脂，接种5×10⁴ cells/cm²，培养基含0.24%羧甲基纤维素（CMC），80 rpm旋转培养。球体形成24 h后，加入AuNPs维持额外48 h。暗场显微镜测量球体尺寸数量，Axio Vision 4.7分析，体积计算公式V=0.4×a×b²（a、b为直径）。按体积（1×10⁻⁴-1×10⁻² mm³）分组确定中位体积和计数。

统计分析

单因素方差分析（ANOVA）和Student's t检验（Statistica 8）处理数据。显著性设定p≤0.05，数据为均值±标准误。

结果

SPEV与HT29细胞黏附

图2展示AuNPs对SPEV黏附影响。1 h后，1、3、6 µg/mL AuNPs降低贴壁细胞计数，12 µg/mL致1.8倍下降并持续24 h。HT29趋势相似：低浓度影响不显著，6和12 µg/mL分别降低黏附1.16和1.28倍（图3）。

SPEV与HT29细胞增殖

图4显示：1-6 µg/mL AuNPs前2-4天不改变SPEV增殖，12 µg/mL致细胞数最多1.5倍下降。HT29增殖前3天无变化；第4天6和12 µg/mL分别降低1.33和1.44倍（图5）。

凋亡/坏死诱导

低剂量（1-3 µg/mL）AuNPs未显著改变两系Annexin-V/7-AAD分布（表1-2）。6-12 µg/mL下，SPEV和HT29早晚期凋亡/坏死群体均增加。SPEV中12 µg/mL使Annexin-V⁺/7-AAD⁺细胞增加7.8%（p≤0.05）；HT29中6和12 µg/mL分别增加3.2%和4.8%。

球体形成

图6-7展示AuNPs调控球体数量和体积。对照HT29球体平均体积5.19×10⁻³ mm³，SPEV为0.79×10⁻⁵ mm³。1-3 µg/mL AuNPs使SPEV球体体积放大9.7和7.4倍，HT29放大1.4和1.2倍。增至12 µg/mL则两系球体体积均下降（HT29：7.18→4.24×10⁻³ mm³；SPEV：7.69→4.58×10⁻⁵ mm³），但HT29球体数视野内从3增至10，SPEV从32降至19。

讨论

数据证实15 nm AuNPs在SPEV和HT29中呈剂量依赖性细胞毒性谱。6-12 µg/mL抑制增殖、增强凋亡/坏死、破坏悬浮培养细胞粘附（球体尺寸数量改变佐证）。HT29较高敏感性（6 µg/mL）对比SPEV（12 µg/mL）与AuNPs差异摄取和细胞骨架破坏前报告一致。

机制上，AuNPs可能干扰局灶黏附复合物、调节肌动蛋白动力学、触发线粒体氧化应激——最终导致细胞周期阻滞和程序性死亡。高剂量抗粘附效应可能反映细胞-细胞连接破坏，导致球体碎片化增加。

体外发现虽具前景，体内验证仍为确认疗效安全性的关键。但本研究为设计利用AuNPs双重能力（抑制肿瘤生长、调节细胞微环境）的抗癌策略提供严谨基准。

结论

15 nm AuNPs对正常样SPEV和恶性HT29细胞呈现明确浓度依赖性效应：抑制增殖、增加凋亡/坏死、改变球体动力学。低剂量（1-3 µg/mL）促进球体形成；高剂量（6-12 µg/mL）施加细胞毒性和抗粘附作用。这些发现支持进一步探索AuNPs作为靶向抗癌模式，关注剂量优化以实现最大治疗获益和最小脱靶毒性。