Au 纳米颗粒对 HT29 和 SPEV 细胞系影响的体外研究

背景

金纳米粒子 (AuNPs) 的生产和研究不仅对金的广泛治疗应用具有很高的潜力 [1, 2]，而且使它们适用于特定的生物医学应用，例如靶向治疗 [3, 4]。最近的报告表明，AuNP 的使用为新型抗肿瘤疗法提供了机会，并降低了产生耐药性的风险。因此，多项研究证实了纳米颗粒对乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌的抗肿瘤活性[5, 6]。

众所周知，纳米颗粒 (NPs) 可以调节细胞命运、诱导或防止突变、启动细胞间通讯和调节细胞结构 [7, 8]。此外，由于其生物相容性和抗肿瘤活性，AuNPs 优于其他金属 NPs [8,9,10,11,12]。 AuNPs 的细胞毒性和基因毒性作用与其形状、大小、电荷、浓度、相互作用时间等有关 [12,13,14]。因此，有关纳米材料在临床环境中使用的潜在毒性和对人类健康影响的信息是必要的。

目前，尽管靶向治疗取得了巨大成功，但在靶组织中选择性递送 AuNPs 的问题仍未解决。一些研究已经注意到不同来源的上皮细胞对 NPs 的吸收率不同 [15, 16]。然而，尽管它们可能有助于实现 AuNPs 的组织选择性靶向，但缺乏解释这种现象的研究。不同上皮细胞之间的解剖学或生理学差异可以解释 AuNPs 摄取和运输速率的差异。特别是，吸收率可能受到细胞质膜特性和纳米颗粒与细胞表面糖蛋白和蛋白聚糖的结合以及细胞囊泡运输能力的影响 [17]。因此，考虑到纳米颗粒不可能与靶细胞发生完全选择性的相互作用，为了避免癌症治疗的不良后果，对其与正常细胞和致癌细胞相互作用的特征进行比较研究是局部的 [8,9,10]。

尽管体内模型对于评估纳米粒子的生物毒性很有价值，但细胞培养模型对于临床前生理学和毒理学研究非常有用。目前，细胞培养广泛应用于生物学、医学、兽医学和生物技术等各个领域。细胞培养的使用允许探索在生物体水平上进行研究的困难且有时不可能的生物过程。细胞培养在许多疫苗、测试系统和生物活性物质的生产中的生物技术中发挥着重要作用。细胞培养物被用于诊断各种病因的疾病，作为测试新药理、治疗和美容剂以及食品添加剂时的测试对象[18]。

在这项关于细胞培养模型的工作中，我们试图检查 AuNPs 对连续和致癌细胞系来源的上皮细胞的影响特征。当应用 AuNPs 抗肿瘤治疗时，上皮细胞 SPEV（胚胎猪肾上皮接种系）和 HT-29（结肠癌细胞系）细胞的单层培养可被视为正常和癌症上皮组织的模型。几种传统的细胞毒性试验，包括粘附、增殖、坏死/凋亡和多细胞球体被用来验证AuNPs的细胞毒性。

方法

SPEV 细胞培养

SPEV 细胞在含有 5% FCS (v /v )（HyClone，美国）补充有青霉素/链霉素（PAA，奥地利）和两性霉素 B（5 μg/ml）（5% CO2，95% 湿度），如 [19] 所报道。播种浓度为 0.5–2 × 10 ⁴ 细胞/cm ² .每 2 天更换一次培养基。细胞在 100% 汇合时传代 [20]。 SPEV细胞系在连续传代过程中生长并保留了单层的初始形态结构，在培养过程中没有细胞变性的证据。

HT29 细胞培养

HT29 细胞在塑料烧瓶（Nunc，丹麦）中在 RPMI-1640 培养基（Sigma，美国）中培养，其中含有 10% FCS（v /v )（HyClone，美国）在标准条件（5% CO2，95% 湿度）下补充 2 mM L-谷氨酰胺（Sigma，美国）和 40 mg/ml 庆大霉素（Sigma，美国）[21]。最佳细胞密度为 0.5–4.0 × 10 ⁴ 单元格/cm ² .细胞由乌克兰RE Kavetsky实验病理学、肿瘤学和放射生物学研究所人体和动物组织细胞系库提供给我们。

使用 AuNP 进行操作

AuNPs 由俄罗斯科学院植物与微生物生物化学与生理研究所友情提供。 AuNPs是通过柠檬酸盐法合成的[22]。纳米颗粒的平均尺寸为 15 nm。金的初始浓度为 57 μg/ml。暗场电子显微镜的结果、15 nm AuNP 的图像和 15 nm AuNP (b) 的消光光谱如图 1 所示（图 1a；注意--尺寸分布图）[23]。在 37°C 下通过被动扩散将 AuNP 引入细胞中。研究的浓度为 1、3、6 和 12 μg/ml。以相同条件下不含AuNPs的细胞为对照。

暗场电子显微镜结果，a 15 nm AuNP 的图像（注意–尺寸分布图），b 15 nm AuNPs 的消光光谱

粘附和增殖细胞

通过粘附特性和增殖活性判断细胞培养物的形态功能状态。使用倒置显微镜目视评估SPEV和HT29细胞的粘附性能；培养开始后30、60、120、180和1440分钟计数贴壁和扁平细胞数。

SPEV 和 HT29 细胞的增殖动力学研究了 1-4 天。为了检查研究培养物中细胞数量的增加，以研究术语，它们被酶促（1:1（0.25% 胰蛋白酶溶液：EDTA，PAA））从塑料上分离，并计算细胞数量。 Goryaev室中培养细胞总数采用传统方法计数。

细胞凋亡/坏死过程

使用膜联蛋白-V（BD，美国）、7-氨基-放线菌素（7AAD）（BD）染料使用 FACS Calibur Becton-Dickinson 在 4 天内研究了暴露于 AuNP 的 SPEV 和 HT29 细胞的凋亡和坏死过程。结果用WinMDI v.2.8软件进行分析。

多细胞球体

生成多细胞球体 (MS) 以估计 AuNP 对所研究细胞的迁移和聚集潜力的体外影响。 SPEV和HT29细胞的球体（3-D）模型系统采用常规方法培养，该方法由[24]报道并在我们实验室[25]中修改。简而言之，使用台盼蓝和相同数量的细胞（5×10 ⁴ 细胞/cm ² ) 种植在完全补充的培养基中。 MS 生成是通过在 24 孔板中用 0.24% 羧甲基纤维素 (CMC) 处理细胞培养物来实现的，该 24 孔板用 1% 琼脂旋转 (80 rpm) 24 小时。之后，3-D 细胞培养保持在标准条件下。为了研究 MS 的大小和数量对 AuNP 浓度的依赖性，在 AuNP 存在的情况下生成了 MS。在平板不断旋转的情况下进行进一步培养 48 小时。在下一阶段，使用 Carl Zeiss Stemi 2000 显微镜通过暗场方法制作显微照片图像。在 Axio Vision Release 4.7 程序（蔡司）的帮助下研究 MS 形态。该程序允许测量细胞聚集体的几何尺寸。然后，计算文件中所有 MS 的体积。它与以下公式一起使用：V =0.4 × a × b ² , 其中 a 和 b ——MS 的几何直径 [24]。为了统计分析，所有细胞聚集体按大小分组，从 1×10 ⁻⁴ 毫米 ³ 到 1 × 10 ⁻² 毫米 ³ 增量为 1 × 10 ⁻³ 毫米 ³ .估计每组的MS数量和MS体积的中位数。

统计分析

方差和学生 t 的单因素分析 采用Statistica 8软件包对数据进行统计处理，显着性阈值为0.05。结果以平均值和标准误 (M ± SE) 表示。

结果

AuNPs 对 SPEV 和 HT-29 细胞粘附的影响

细胞粘附是细胞功能状态的一个指标，是培养物进一步生长所必需的。当粘附终止时，细胞变平并获得适当的形态。 SPEV细胞的粘附特性见图2。

AuNPs暴露后SPEV细胞的粘附动力学，*p ≤ 0.05 与对照组相比显着

用 1、3 和 6 μg/ml 的 AuNPs 培养 SPEV 细胞 1 小时后，粘附细胞的数量低于对照值。这些浓度的 AuNP 样品中扁平细胞的百分比与对照没有显着差异。与 12 μg/ml 的 AuNP 孵育 1 小时后，粘附减慢。与对照相比，每平方厘米的粘附细胞数量减少了 1.8 倍。这种粘附趋势在所有测试期间都持续存在。观察 24 小时后，粘附细胞的数量比对照低 1.3 倍。同时，以小浓度（1 和 3 μg/ml 与肿瘤细胞 (HT29) 孵育 AuNP 对粘附细胞的数量没有显着影响。将 AuNP 浓度增加到 6 和 12 μg/ml 导致降低粘附部分中肿瘤细胞的数量分别为 1.16 和 1.28 倍（图 3）。获得的数据可能受几个过程的影响。一个是 AuNPs 对肿瘤和肿瘤粘附部分的细胞抑制/细胞毒作用。胚胎细胞系，这会导致细胞死亡、转变为细胞凋亡或坏死。另一个过程是细胞粘附的减少，在 AuNPs 的影响下和细胞转移到悬浮液部分。值得注意的是，这两个过程可以同时实现，并且每一种都有助于粘附分数中活细胞数量的减少。

AuNPs暴露后HT29细胞的粘附动力学，*p ≤ 0.05 与对照组相比显着

AuNPs 对 SPEV 和 HT-29 细胞增殖的影响

研究了浓度范围为 1-12 μg/ml 的 AuNP 对 SPEV 细胞培养中增殖过程的影响（图 4）。在用 1、3 和 6 μg/ml 的 AuNP 培养的第 2-4 天，细胞数量与对照没有显着差异。在用 3 和 6 μg/ml 的 AuNPs 培养的第 4 天，与对照相比，该指数分别下降了 1.15 和 1.23 倍。与对照相比，在 SPEV 培养物中观察到细胞数量减少了 1.5 倍（第 2 天和第 3 天），并在用 12 μg/ml 的 AuNP 培养的第 4 天减少了 1.15 倍。因此，12 μg/ml 的 AuNP 浓度在观察到的时间段内减缓了细胞生长。

AuNPs暴露后SPEV细胞的增殖，*p ≤ 0.05 与对照组相比显着

图 5 显示了浓度为 1 到 12 μg/ml 的 AuNP 对单层培养物中 HT 29 细胞数量的影响。 AuNPs 没有统计学差异。在培养的第 4 天，注意到 2D 培养中细胞数量呈剂量依赖性减少。因此，培养 4 天后，对于低浓度的 AuNP（1 和 3 μg/ml），HT 29 细胞的数量与对照相比没有显着差异。但在较高的 AuNP 浓度（6-12 μg/ml）下，HT29 细胞数分别低于对照的 1.33 倍和 1.44 倍。

AuNPs暴露后HT29细胞的增殖，*p ≤ 0.05 与对照组相比显着

AuNPs 对 SPEV 和 HT-29 细胞凋亡/坏死过程的影响

在标准条件下，在 AuNP 存在下的 SPEV 和 HT-29 细胞培养 4 天。用1和3 μg/ml AuNPs培养SPEV和HT29细胞，凋亡/坏死过程指标与对照无显着差异（表1和2）。

用 6–12 μg/ml 的 AuNP 培养增加了 Annexin V+/7AAD+、Annexin V-/7AAD+ 和 Annexin V+/7AAD-细胞的百分比，并降低了活细胞的百分比。 Annexin V ⁺ 的数量 /7AAD ⁺ SPEV 细胞比对照值高 7.8 ± 0.7% (p ≤ 0.05) 与 12 μg/ml 的 AuNP。 Annexin V ⁺ 的数量 /7AAD ⁺ HT 29 细胞比对照值高 3.2 ± 0.4% (p ≤ 0.05) 与 6 μg/ml AuNP 和 4.8 ± 0.6% (p ≤ 0.05)，含 12 μg/ml AuNP。

金纳米粒子对 SPEV 和 HT29 细胞生成多细胞球体的影响

为了确定多细胞球体 (MS) 的大小和数量对 AuNP 浓度的依赖性，在 48 小时内以不同浓度的 AuNP 生成 MS。我们的数据证明了 HT29 和 SPEV 细胞在相同微环境条件下形成多细胞球体的多样性能力（图 6 和 7）。

与 AuNPs 孵育后 MS 细胞的数量和体积 SPEV，#p ≤ 0.01（对于 MS 数）； **p ≤ 0.01（对于 MS 的体积）

与 AuNPs 孵育后 MS 细胞 HT29 的数量和体积。 #p ≤ 0.01（对于 MS 数）； **p ≤ 0.01（对于 MS 的体积）

因此，如果 HT29 细胞的对照样品 48 小时形成平均体积为 5.19 × 10 ^-3 的球体 毫米 ³ , SPEV 细胞的平均体积球体为 0.79 × 10 ⁻⁵ 毫米 ³ .同时，AuNPs对HT29和SPEV电池的影响具有相同的趋势。细胞微环境中金纳米粒子的存在刺激了两种培养物中多细胞球体的形成。因此，当金纳米粒子的浓度为 1 和 3 微克/毫升时，SPEV 的 MSs 体积分别比对照增加了 9.7 和 7.4 倍（图 6），相同的金纳米粒子浓度也刺激了 MSs 体积的增加HT29 分别为 1.4 和 1.2 倍（图 7）。

AuNP 浓度的进一步增加导致两种培养物中 MS 的平均体积降低。 AuNP 浓度从 1 到 12 μg/ml 的升高使 HT29 MS 的体积从 7.18 × 10 ^-3 减少 毫米 ³ 到 4.24 × 10 ⁻³ ，在 1.69 倍，根据控制。对于 SPEV，当 AuNPs 的浓度从 1 增加到 12 μg/ml 时，MSs 的体积从 7.69 减少到 4.58 × 10 ^-5 毫米 ³ ，在1.68倍，按控制。然而，AuNP 浓度的增加与 MS 体积的减少一致，并与 HT29 细胞培养物中球体数量的增加相关（图 6 和 7）。在 AuNP 浓度从 1 到 12 μg/ml 时，HT29 MS 的数量从每个视场 3 个增加到 10 个。同时，SPEV MS的数量分别从32个减少到19个。

获得的数据（图 6 和 7）表明 AuNP 能够影响细胞间系统中的内聚相互作用。我们的数据显示，小浓度的 AuNP（1–3 μg/ml）刺激了胚胎和肿瘤细胞的多细胞球体的形成。然而，较高的 AuNP 浓度（6-12 μg/ml）对悬浮细胞具有细胞毒性和抗粘连作用。这一过程有助于形成大量 HT29 MS，平均体积降低。对于 SPEV，高浓度的 AuNP 可能具有抑制细胞生长的作用，从而减少了粘附部分中的细胞数量和悬浮液中的 MS 数量。此前，作者报告说，碳纳米粒子会降低细胞对基质的粘附，刺激细胞转移到悬浮液中，并导致多细胞球体的形成 [25, 26]。在文献中，有关于 AuNP 能够破坏肌动蛋白/肌球蛋白微丝结构并减少细胞增殖、粘附和分化的能力 [27]。我们的数据证实了这一假设。

讨论

我们评估了 AuNPs 对增殖、坏死/凋亡和上皮细胞连续和致癌细胞系来源的多细胞球体形成的影响。结果表明，6-12 μg/ml 的 AuNP 减少了 SPEV 和 HT29 细胞的数量，并增加了细胞凋亡和坏死早期和晚期的细胞数量。小浓度的 AuNP 刺激 HT29 和 SPEV 细胞形成多细胞球体。然而，较高的 AuNP 浓度对悬浮细胞具有细胞毒性和抗粘连作用。与 SPEV 细胞 (12 μg/ml) 相比，HT29 系 (6 μg/ml) 显示出对 AuNPs 作用的高度敏感性。

AuNPs对细胞形态和细胞骨架的影响最近才受到更多关注，其潜在机制和即将发生的后果尚未深入研究[28,29,30]。在这方面，所有新型 AuNP 类型都必须评估它们的内吞摄取途径和细胞内定位作为时间的函数。对于不同类型的 AuNP，其影响被描述为依赖于细胞内 AuNP 浓度并且是短暂的，在反复细胞分裂后，细胞内 AuNP 浓度呈指数下降，不再观察到影响。此外，必须评估 AuNPs 可能的内体逃逸。由于细胞骨架缺陷已被描述为明显依赖于 AuNP 浓度，因此应测试广泛的颗粒浓度范围，以尝试评估最大的细胞负载能力，而不会产生任何影响。此外，由于细胞骨架也参与许多细胞内信号通路，AuNPs诱导的细胞骨架破坏是否会导致继发效应仍有待研究[31]。

由于 NPs 具有一定的物理尺寸，它们占据的细胞内体积会导致细胞形态的改变或影响细胞骨架网络的结构 [28, 29, 31]。后来的影响也可能是由于 NP 对细胞内吞方式的高要求。 AuNPs 已被描述为对几种细胞类型的形态学具有深远的影响，例如 A549 人肺癌细胞 [32]。 AuNPs 也被描述为对人真皮成纤维细胞的肌动蛋白原纤维具有浓度依赖性影响 [33, 34]。米罗纳瓦等人。 [35, 36] 进一步表明，尽管肌动蛋白或 β-微管蛋白的表达水平不受影响，但细胞骨架细丝会随着 AuNP 暴露时间、浓度和纳米颗粒的大小而被破坏。

所使用的细胞类型也很重要，因为不同的细胞类型，即使是密切相关的，对相同类型的纳米材料的反应也会大不相同 [37, 38]。优选地，应测试那些最涉及 NPs（未来）生物医学应用的细胞类型（例如，上皮细胞、内皮细胞），或来自不同胚层的多种细胞。在研究细胞毒性作用时，应尽量减少使用癌细胞类型，因为它们会导致异常结果 [39]。癌细胞有几个特定的​​特征和改变的细胞内信号通路，这些信号通路注定要上调增殖并维持细胞活力，这将使它们不太容易产生一些 NP 介导的细胞毒性作用。

我们认为，AuNPs 与细胞表面官能团（例如跨膜蛋白）的结合可以是可逆的或不可逆的，从而导致暂时或永久性的结构损伤 [40, 41]。细胞的生物力学特性（例如，硬度和弹性）、粘附性和表面电特性变化的潜在影响是可以感知的。因此，硬度或弹性的变化可能会影响表面结构的柔韧性、细胞分裂机械能的产生和细胞运动。至于粘附性，细胞微环境通常由细胞外基质和特定分子组成，使细胞能够粘附在周围环境中 [42]。表面电荷无疑在细胞与其周围环境的相互作用中起着重要作用。

其他作者也报道了 NPs 优先定位于线粒体并引起氧化应激以及加强结构损伤 [40]。潘等人最近的一篇文章。描述了 1.4 nm AuNPs 通过 Hela 细胞中的氧化应激和线粒体损伤诱导坏死 [43]。纳米颗粒在生物降解过程中在细胞培养基中的积累是不安全的，因为它可能会破坏细胞器甚至导致基因突变。

大多数细胞类型在细胞凋亡过程中发生的变化是相似的。在凋亡细胞中，质膜脂质成分发生变化：磷脂酰丝氨酸从双层细胞质部分转移到外侧，引起caspase级联激活、染色质凝聚、线粒体电子传递链紊乱，最终阻止ATP合成。程序性细胞死亡可由受体介导的生理刺激引发，这些刺激是由遗传疾病、暴露于化学或物理因素以及细胞的其他变化引起的。我们在 6–12 μg/ml 的 AuNPs 中观察到了这种效果。

多细胞聚集体（球体、胚状体）代表单层生长细胞和组织培养之间的间歇水平。球体是细胞三维生长和组织、细胞间相互作用和微环境条件影响的客观模型，例如 AuNP 浓度、增殖强度以及细胞粘附和微聚集体的形成。对于肿瘤和胚胎细胞系，MS 形成是一种成熟的培养方法 [24, 44, 45]。在我们的工作中，通过添加 CMC 作为人工细胞外基质的一部分和 1% 琼脂表面涂层来实现球体的形成和生长，从而抑制细胞对表面的粘附并刺激细胞聚集。在这些条件下，由于细胞团生长受限或胚胎细胞的自发分化，可以实现 MS 培养，直到聚集体形成中央坏死。

在文献中，有关于 AuNPs 与结肠癌细胞系和胚胎细胞系相互作用的信息 [46, 47]。根据这些数据，即使暴露于极低浓度的 AuNPs 也可能通过应激细胞增殖、分化和凋亡细胞死亡对人胚胎神经前体细胞和 HT29 产生破坏作用。

已发表的数据表明，AuNP 的作用基于 G0/G1 期积累、S 和 G2/M 期消耗，以及人口腔鳞状细胞癌细胞 (HSC-3) 中 ATP 水平的降低 [48]。细胞周期调节可以通过违反细胞与底物的焦点接触以及细胞转移到 2D 培养中的悬浮部分和抑制 3D 培养中间隙连接中的细胞间接触来解决 [48,49,50]。由于 AuNP 的纳米尺寸（接近 15 纳米），它不能成为细胞的凝聚中心。同时，AuNPs嵌入细胞膜[51]，对细胞膜AuNP zeta电位的影响[3​​2]，以及对形成细胞与细胞/细胞与表面接触的影响明显可以触发坏死/凋亡的机制、细胞毒作用和细胞周期停滞。破坏细胞与底物的焦点接触和细胞转移到悬浮部分是细胞周期调节的一种方式 [48, 49]。小浓度的 AuNPs 对细胞没有统计学上显着的细胞毒性作用。然而，较高的 AuNP 浓度对悬浮细胞具有细胞毒性和抗粘连作用。这个过程有助于形成更多的 MS，平均体积下降。我们假设 AuNP 楔入细胞的粘性接触并破坏它们。因此，我们关于 AuNPs 对 SPEV 和 HT29 细胞系影响的实验支持它们在 AuNP 介导的癌症治疗中的进一步应用。

尽管未来的研究将有必要确认对体内动物研究的抗癌作用。尽管如此，我们深信，如果我们了解物质的性质及其可能的负面影响，我们就能够避免 AuNP 的不利影响并利用其积极的生物技术潜力。我们的研究可以非常可靠地应用于抗癌治疗的有效材料中，并具有最大的医学优势。

结论

我们的结果支持 AuNPs 在 SPEV 和 HT29 细胞中诱导剂量依赖性细胞毒性的观点。此外，该报告首次表明，浓度为 6-12 μg/ml 的 15 nm AuNP 降低了 SPEV 和 HT29 细胞的增殖，并增加了细胞凋亡和坏死早期和晚期的细胞数量。此外，还表明小浓度的 AuNP (1–3 μg/ml) 会刺激多细胞球体的形成。然而，较高的 AuNP 浓度对悬浮细胞具有细胞毒性和抗粘连作用。与 SPEV 细胞 (12 μg/ml) 相比，HT29 系 (6 μg/ml) 显示出对 AuNPs 作用的高度敏感性。