在钛氧化物传感表面上纳米检测头颈癌

介绍

头颈癌显示头颈区域的异常细胞生长并被广泛报道。它起源于咽喉、口腔、粘膜、口腔上皮、唾液腺和鼻腔[1]；是全球第六大最常见的癌症；并且每年影响超过 644,000 人 [2]。大多数受影响的患者在确诊时已是晚期，严重影响了他们的生存。头颈癌的早期识别对于提高生存率和生活方式是必不可少的。血清学肿瘤标志物已被用于诊断和管理头颈癌的后续治疗。鳞状细胞释放一种主要的鳞状细胞癌抗原 (SCC-Ag)，其在癌症患者中的含量升高，并且 SCC-Ag 已被证明是一种有希望的鳞状细胞相关癌症的肿瘤标志物，例如妇科癌、肺癌、食道癌和肛门癌[3, 4]。考虑到头颈癌，如对癌症患者的不同研究证实，较高水平的 SCC-Ag 与疾病转移、复发和死亡率相关 [5,6,7]。研究人员发现血清 SCC-Ag 对下咽部、口腔和喉部的癌症具有显着的风险水平 [8, 9]。此外，SCC-Ag 水平与头颈癌患者的肿瘤体积之间存在相关性 [10]。明智的做法是量化 SCC-Ag 的水平以识别头颈癌的状况，以便提供早期治疗。目前的研究重点是通过SCC-Ag抗体使用交叉指状电极（IDE）传感器上的纳米颗粒检测较低水平的SCC-Ag。

IDE 是一种电化学生物传感器，具有低成本、便携和灵敏等优点，具有广泛的应用，特别是环境监测和医学诊断 [11, 12]。增强传感表面的电特性可改善生物分子的检测。纳米材料的应用已广泛应用于生物传感器，以增强传感表面上的生物分子检测。纳米材料体积更小，表面积更大，具有良好的导热性和导电性，与生物分子相容，在生物传感器领域显示出巨大的应用能力[13, 14]。纳米材料已以两种不同的方式应用于目的：一种是表面功能化，另一种是结合分析物或目标以改善检测 [15]。金是一种成熟的纳米材料，并应用于各种传感器，包括表面等离子体共振、波导模式传感器、电化学传感器和比色法 [16,17,18]。除此之外，银、石墨烯、铜和钛纳米材料还应用于各种生物医学领域。作为一种环境友好型半导体和低成本，氧化钛 (TiO2) 具有宽禁带，可在 IDE 上进行表面改性以检测 SCC-Ag。由于 TiO2 的高电学和光学性质，它被广泛用于超容量目的、光催化和光电转换 [19,20,21,22,23]。此外，其亲水性和较大表面积的性质适用于表面改性，有助于检测较低水平的生物分子。在这项研究中，TiO2 被涂覆在 IDE 传感表面以增强生物分子相互作用时的电流。为了改善 SCC-Ag 的检测，将抗体与金纳米星（GNS 抗体）结合并固定在 TiO2 涂层表面。由于已经证明金纳米材料偶联的生物分子表现出更高的稳定性并提供适当定向的表面固定化生物分子，因此它具有提高检测限的能力[24, 25]。此外，更多的生物分子可以固定在单个金颗粒上，从而吸引更高水平的目标分子。在这项工作中，两种不同的纳米材料，即 TiO2（用于表面改性）和 GNS（用于抗体偶联），被用于改进 IDE 传感表面上 SCC-Ag 的检测。 GNS的应用有望通过其更大的表面来增强电流传感器的性能，以捕获更多数量的抗体。

材料和方法

试剂和生物分子

SCC 抗原（同种型范围为 45 至 55 kDa 的糖蛋白）购自 Randox Life Sciences（马来西亚）。抗 SCC 抗体购自 Next Gene (Malaysia)。 （3-氨基丙基）三乙氧基硅烷 (APTES)、乙醇胺、白蛋白（一种主要的血液蛋白质，浓度为 45 mg/mL；血液蛋白质的 50-70%，分子量为 66.5 kDa）、磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）和 IV 异丙醇钛来自 Sigma Aldrich（美国）。 Serpin（一种常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂，分子量为 40 至 50 kDa）来自中国生物（中国）。如 Shan 等人所述合成金纳米星。 [26]。所有获得的试剂和化学品均按照制造商推荐的条件储存。

叉指电极制造

IDE 的基本设计和制造遵循早先报道的 [27]。最初，硅片用标准清洗液清洗，铝 IDE 电极通过传统的湿蚀刻方法沉积在硅片上。然后，在硅片表面沉积正性光刻胶，然后进行热氧化。铝的沉积通过光刻技术进行。包括三个步骤，其中步骤1以1200 rpm持续10 s，然后步骤2以3500 rpm持续20 s，然后是500 rpm持续10 s。然后，将紫外 (UV) 光暴露在传感表面上，将 IDE 的图案转移到样品表面上。之后，使用RD-6显影剂进行15 s的显影过程。进行光刻胶以消除未曝光区域。将显影后的样品在 100°C 下烘烤以清除不必要的水分并提高 SiO2 层与铝之间的附着力。最后，通过使用 23 s 铝蚀刻剂，去除未曝光区域并用丙酮清洁。最终表面用 TiO2 改性以检测 SCC-Ag。在高倍显微镜和 3D 纳米轮廓仪下观察制造的 IDE 表面。使用相关系统以× 50 放大倍率捕获图像。

IDE 传感表面上的 TiO2 涂层

在制备的 IDE 表面上涂覆 TiO2 溶液，并使用钛 IV 异丙醇作为前驱体制备 TiO2 溶液。为此，将乙醇与四氧化钛异丙醇混合并剧烈搅拌 5 分钟。然后，在搅拌条件下滴加稳定剂（100 μL 乙酸），然后在热板上在 85 °C 的温度下加热。混合物的摩尔比固定为 9:1:0.1（乙醇对 TIP 再到乙酸）。混合 3 小时后，获得澄清溶液。在老化过程 24 h 后，使用旋涂机以 2000 rpm 的速度将溶液滴在二氧化硅 (SiO2) 基材上。涂覆后，将表面在 175°C 的温度下干燥 15 分钟，并在 450°C 下退火 1 小时。涂覆三层后，TiO2薄膜得到足够的厚度。

GNS-Conjugated Anti-SCC-Ag 的制备

SCC-Ag 抗体通过使用接头 16-巯基十一烷酸 (16-MDA) 固定在 GNS 上。最初，将 5 mM 稀释的 16-MDA 与 100 μL GNS 混合并在室温 (RT) 下保持 30 分钟。通过以 13,000×g 离心去除与 GNS 结合的 16-MDA ， 5分钟。然后，收集的金颗粒通过 EDC (400 mM) 和 NHS (50 mM) 以 1:1 的比例通过在室温下孵育 15 分钟来活化。通过以 13,000×g 离心去除溶液混合物中未结合的 EDC 和 NHS ， 5分钟。收集含有活化 GNS 的沉淀物以偶联抗体。随后将 200 nM SCC-Ag 抗体与 EDC-NHS 激活的 GNS 混合并在室温下保持 1 小时。最后，通过 13,000×g 离心去除未结合的抗体 ， 5分钟。将与 GNS 结合的抗体保持在 4 °C 以备进一步使用，并通过 UV-Vis 光谱扫描确认结合。在480-560 nM区域进行扫描，发现峰值。

在 TiO2-IDE 表面固定 GNS 抗体

通过 APTES 将 TiO2 包覆的 IDE 表面进一步修饰成胺以固定 GNS 抗体。将含 3% 的 APTES（在 30% 乙醇中稀释）滴在 TiO2 表面并在室温下保持 3 小时。表面用30%乙醇洗涤3次以去除未结合的APTES。为了固定抗体，如上所述进行活化步骤。将抗体或 GNS 抗体滴在表面上，等待 1 h 以完成固定过程。最后，用 PBS 缓冲液清洗表面 5 次以完全去除未结合的抗体。这些抗体或 GNS 抗体修饰的表面用于检测 SCC-Ag 并进行比较。如前所述 [15]，通过原子力显微镜 (AFM)、场发射透射电子显微镜 (FETEM) 和能量色散 X 射线 (EDX) 分析仪分析 GNS 抗体固定的 TiO2 表面。 AFM 观察是在 5 μm 尺度，而 SEM 是在 100 nM 尺度，在 15 kV 下操作。元素的存在是由EDX发现的。

在抗体/金纳米星抗体表面检测 SCC 抗原

为了检测 SCC-Ag，抗体或金纳米星抗体修饰的 TiO2-IDE 表面被 1 M 乙醇胺封闭，以掩盖无抗体的表面区域，并在室温下保持 30 分钟。在乙醇胺封闭的表面上，1 nM 的 SCC-Ag 相互作用，并且在添加 SCC-Ag 之前和之后观察到电流响应。为了评估检测限，将 SCC-Ag 从 10 fM 滴定到 1 nM 并单独滴在抗体或 GNS 抗体修饰的表面上，并记录对电流的反应。一式三份进行实验并计算统计量。在 0.01 V 阶跃电压下使用 0 到 2 V 的线性扫描电压进行测量。检测限 (LOD) 被认为是分析物（来自低浓度校准线）相对于背景信号 (S /N =3:1)，换句话说，LOD =基线的标准偏差+ 3σ .

选择性检测 SCC-Ag

为了检查 SCC-Ag 与其抗体的选择性相互作用，用两种不同的蛋白质，即丝氨酸蛋白酶抑制剂和白蛋白进行了对照实验。将 1-nM 浓度的这些对照蛋白滴在抗体或 GNS 抗体修饰的表面上，观察相互作用前后电流的变化。这些电流水平与 SCC-Ag 的抗体和 GNS 抗体的特异性检测进行了比较。其他控制实验设置包括 SCC-Ag 与单独的 GNS 以及 SCC-Ag 与由非免疫抗体标记的 GNS 包被的 TiO2-IDE 表面的相互作用。一式三份进行实验并计算统计量。在0.01 V步进电压下，0到2 V的线性扫描电压用于测量。

结果与讨论

头颈癌被描述为在鼻子、嘴巴、喉部和鼻窦内或周围发生不同的肿瘤 [28]。必须使用合适的生物标志物进行早期诊断和治疗，以提高患者的生存率。 SCC-Ag 被发现是头颈癌的合适血清生物标志物；在本文中，进行实验以通过其抗体检测和量化 TiO2 修饰的叉指电极 (IDE) 传感器上 SCC-Ag 的水平。 TiO2 在此用于改善生物分子相互作用期间的电流响应。与其他纳米材料相比，TiO2 因其在沿电极表面的活性行为和电催化活性的提高而被认为在电化学传感器中具有吸引力。此外，它为表面提供了更高的稳定性，从而提高了电极响应的可重复性，并通过增加峰值电流来提高检测限 [29,30,31]。为了利用这一积极特性，在本研究中，在 IDE 表面 (IDE-TiO2) 上涂覆了 TiO2 可改善电流。另一种纳米材料 GNS 用于将抗 SCC-Ag 抗体固定在 IDE-TiO2 表面并提高删除限制。由于已经证明金缀合的生物分子固定化表面提高了对目标的检测 [32, 33]，这里，检测到 SCC-Ag，并与抗体和 GNS 抗体修饰的 IDE-TiO2 表面进行比较。正如其他地方所概括的那样，随着纳米颗粒表面积的增加，生物分子附着力将增强。在这种情况下，与球形金纳米颗粒相比，GNS 具有更大的表面。为了实现这个想法，目前的实验已经使用 GNS 来提高灵敏度。

表面表征和 GNS 抗体固定

图 1 显示了在 IDE-TiO2 传感表面上检测 SCC-Ag 的示意图。如图 1a 所示，最初，IDE 传感表面涂有 TiO2，然后在有或没有 GNS 缀合的情况下固定抗体。这些抗体修饰的表面用于检测 SCC-Ag 的水平。在进行检测之前，GNS 与抗体的结合通过 UV-Vis 光谱进行了确认。确定了在与抗体缀合之前和之后具有所需波长范围的 GNS 扫描图谱。可以清楚地看到，固定后，位移从 535 移动到 545 nM（图 1b）。这一结果证实了抗体在 GNS 表面的结合。另一方面，从形态上观察制造的传感表面。图 2a 显示了高倍显微镜图像，而图 2b 描述了从 3D 纳米轮廓仪成像中捕获的图像。两个成像轮廓都清楚地显示了间隙和电极区域，它们形成了手指。间隙和手指的排列似乎是均匀完整的。

一 检测 SCC-Ag 的示意图。 IDE-TiO2 表面通过 APTES 修饰成胺，然后固定抗体或 GNS 抗体。 APTES 的氨基与抗体上的羧基反应。通过抗原区域的相互作用检测 SCC-Ag 并进行比较。 b 使用 GNS 进行紫外-可见光谱测量。扫描范围在 480 到 560 nM 之间，峰值最大值为 ~ 530 nM。带和不带抗体的 GNS 用箭头表示

一 IDE 表面的高倍显微镜图像。图像是在 × 50 处拍摄的。b IDE 表面上的 3D 纳米轮廓仪图像。在 × 50 处捕获图像。显示了电极和间隙区域。间隙用星号表示。统一的安排表明制造成功。 c 原子力显微镜图像。 AFM 分别通过暗点和亮点显示了 TiO2 和 GNS 之间的清晰区分。 d 场发射透射电子显微镜图像。 e 能量色散 X 射线分析。表示在表面发现的元素

抗体和 GNS 抗体固定化 TiO2-IDE 传感表面的比较

SCC-Ag 通过抗体或 GNS 抗体固定的表面在 TiO2-IDE 表面检测到。 AFM、SEM 观察和 EDX 分析证实了 GNS 在 TiO2 表面的附着（图 2c）。在 AFM 观察下，通过暗点和亮点分别注意到 TiO2 和 GNS 之间的明显区别。这得到了 SEM 和 EDX 分析的支持，其中观察到显着的金峰和中等钛峰。这些结果证明了在 TiO2 表面上出现了 GNS。图 3 显示了抗体和 GNS 抗体在胺修饰的 IDE-TiO2 传感表面上的固定过程。 TiO2 改性的 IDE 传感表面显示电流水平为 4.65E-12（图 3a）。加入APTES后，当前水平提高到5.37E-11；电流的这种增加表明表面被 APTES 改性为胺。当抗体固定后，电流水平从 5.375E-11 变为 1.05E-9。注意到电流差异为 1.04E-9（图 3a）。这种固定是由于来自 APTES 的胺基团和抗体中的 COOH 基团的化学相互作用而发生的 [18]。电流的变化证实了抗体在 APTES 修饰表面上的结合。之后，剩余的表面被 1 M 乙醇胺覆盖，以减少生物分子在传感表面的非特异性结合造成的生物污染效应。类似地，GNS 抗体固定在 TiO2-IDE 表面，当 GNS 抗体固定在 APTES 修饰的表面时，电流水平从 4.41E-12 增加到 1.23E-9（图 3b）。可以清楚地发现，当抗体固定在 GNS 表面时，它在胺修饰的表面上显示出更高的响应。这可能是由于大量抗体结合在单个 GNS 的表面上，并且该复合物在胺修饰的表面上具有很强的结合力。这种结合的发生是由于 APTES 中的氨基末端基团取代了 GNS 上的柠檬酸盐基团并化学固定在 APTES 修饰的 IDE 表面 [34]。众所周知，传感表面生物分子的检测主要取决于两个因素，即相互作用分子的结合亲和力和分子在传感表面的适当表面固定。传感表面上更高的生物分子固定化极大地改善了对较低水平目标的检测。本研究采用GNS将抗SCC-Ag抗体固定在IDE-TiO2表面，以提高抗体结合的机会，从而实现高效的SCC-Ag检测。

IDE-TiO2 表面的固定过程。 一 带抗体。 b 带有 GNS 抗体。表面修饰由 3% APTES 开始，然后是 EDC 和 NHS 激活以固定抗体； 1 M乙醇胺用于封闭未连接的抗体区域。在 0.01 V 阶跃电压下使用 0 到 2 V 的线性扫描电压进行测量。每次固定后电流的适当变化证实了抗体和GNS抗体在传感表面的结合

抗体或GNS抗体对IDE-TiO2表面SCC-Ag的比较检测

由于抗体 GNS 显示出在 IDE-TiO2 表面上的有效固定，因此在抗体和 GNS 抗体表面上检测到类似的 1 nM 浓度的 SCC-Ag，并比较了电流水平的变化。图 4a 显示了抗体修饰表面上 1 nM 的 SCC-Ag 检测。在进行检测之前，抗体修饰的表面被封闭剂乙醇胺覆盖，以避免生物分子的非特异性结合。乙醇胺显示当前变化为 4.65E-12。添加 1 nM SCC-Ag 后，电流水平增加到 1.33E-09。这些电流变化清楚地表明 SCC-Ag 与其抗体结合。在 GNS 抗体表面的情况下，乙醇胺显示当前水平为 1.33E-11；添加 1 nM SCC-Ag 后，它增加到 1.62E-09（图 4b）。对于类似浓度的 SCC-Ag，与仅抗体修饰的表面相比，GNS 抗体的当前变化更高。这可能是由于通过 GNS 结合在 IDE-TiO2 表面的抗体数量较多。

使用 a 检测 SCC-Ag 抗体和b GNS 抗体。使用上述步骤在 IDE-TiO2 表面上进行测试，直到 1 M 的乙醇胺封闭。在 0.01 V 阶跃电压下使用 0 到 2 V 的线性扫描电压进行测量。在与 1 nM 的 SCC-Ag 相互作用后，两种情况下的电流水平都增加了；同时，GNS抗体显示出更高的电流变化

抗体或 GNS 抗体对 IDE-TiO2 表面 SCC-Ag 的检测限制

抗体或 GNS 抗体修饰的表面显示出对 SCC-Ag 的清晰检测，并且在两个表面上估计了检测限以进行比较（图 5a、b）。为此，将浓度从 10 fM 到 1 nM 的 SCC-Ag 稀释并单独滴在这些表面上，并记录电流的变化。图 5a 显示了不同浓度的 SCC-Ag 结合在抗体修饰的表面上。乙醇胺后，10 fM 的 SCC-Ag 相互作用，目前没有注意到任何变化。当浓度增加到 100 fM 时，电流从 4.65E-12 到 6.54E-11 有微小的变化。此外，浓度增加到 1 pM、10 pM、100 pM 和 1 nM，电流水平分别增加到 4.69E-10、7.91E-10、8.78E-10 和 1.33E-09。这些结果清楚地表明，随着浓度的增加，结合也在增加。根据 3σ 计算检测限 ，并且是 100 fM（图 6a）。

与 a 的剂量依赖性相互作用 抗体和b IDE-TiO2 表面上的 GNS 抗体。表面用上述步骤直至1 M乙醇胺封闭。在 0.01 V 阶跃电压下使用 0 到 2 V 的线性扫描电压进行测量。从 10 fM 到 10 nM 的 SCC-Ag 浓度在两个表面上相互作用，并且注意到了电流变化。使用 10 mM PBS (pH 7.4) 在每个步骤以五个反应体积进行洗涤。随着 SCC-Ag 浓度的增加，两种情况下的电流水平都逐渐增加。 GNS 抗体显示从 10 fM 开始的当前变化，而仅使用抗体观察到从 100 fM 开始的变化。在两种情况下（抗体和 GNS 抗体），1 nM SCC-Ag 都显示饱和。当浓度进一步增加时，无法观察到电流的任何显着变化

比较抗体和 GNS 抗体修饰表面上不同浓度 SCC-Ag 的电流变化。 一 SCC-Ag 检测限的线性回归图。显示带有抗体（红线）和带有 GNS 抗体（蓝线）。发现检测限为使用 GNS 抗体时为 10 fM，而仅使用抗体时为 100 fM。 b SCC-Ag 和抗体相互作用的电流变化。对于所有浓度，在 GNS 抗体表面发现更高水平的电流变化。在 0.01 V 阶跃电压下使用 0 到 2 V 的线性扫描电压进行测量。误差条表示三次重复的平均值 (n =3) 标准偏差在± 0.1到0.15 × 10 ⁻⁹ 的范围内 A. 检测限 (LOD) 被认为是分析物（来自低浓度校准线）相对于背景信号 (S) 的最低浓度 /N =3:1)，换句话说，LOD =基线的标准偏差+ 3σ

相同浓度的 SCC-Ag 在 GNS 抗体修饰的表面上独立相互作用。当 10 fM 的 SCC-Ag 滴在表面上时，它清楚地将电流从 1.33E-11 更改为 3.74E-11。该结果表明，即使是 10 fM 的 SCC-Ag 也能明显地与 GNS 抗体固定的表面相互作用，这在仅使用抗体的情况下是无法检测到的。此外，当浓度增加到 100 fM、1 pM、10 pM、100 pM 和 1 nM 时，电流水平进一步增加到 4.69E-10、9.23E-10、1.41E-09、1.48E-09 和分别为 1.62E-09（图 5b）。具有标准偏差的统计计算在± 0.1到0.15 × 10 ^-9 的范围内 A. 与上述两个表面的传感相比，GNS 抗体修饰的表面在所有 SCC-Ag 浓度测试中显示出更高的电流变化（图 6b）。基于 3σ ，它可以发现检测限为 10 fM（图 6a），与仅使用抗体修饰的表面相比，检测效果好（低）10 倍。具有标准偏差的统计计算在± 0.1至0.15 × 10 ⁻⁹ 范围内 A. 此前，SCC-Ag 已经在不同的纳米材料上进行了评估，例如锶纳米颗粒和石墨烯；然而，与目前的研究[35]相比，这些表面的敏感性低约 1000倍。

在抗体/GNS 抗体修饰表面上选择性检测 SCC-Ag

SCC-Ag 的选择性检测与两种对照蛋白进行了比较，即血流中丰富的丝氨酸蛋白酶抑制剂和白蛋白。 Serpin是一种蛋白酶抑制剂，具有不同的人体生理功能和生物过程，而白蛋白占45 mg mL ⁻¹ 并在血清中贡献 50-70%。如图所示，这两种对照蛋白和 SCC-Ag 的 1 nM 浓度分别滴在表面抗体或 GNS 抗体上（图 7a）；可以清楚地看到，在两种情况下，当前的变化都只在 SCC-Ag 上被注意到，表明抗体只能识别 SCC-Ag。与对照蛋白质的相互作用，电流中没有注意到显着变化。该实验证实，当前的实验装置可以专门检测/诊断 SCC-Ag。通过 SCC-Ag 与单独的 GNS 以及 SCC-Ag 与涂有非免疫抗体标记的 GNS 的 TiO2-IDE 表面的相互作用，其他对照实验提供了进一步的支持。与特定交互相比，当前注意到的没有显着变化（图 7b）。

一 在抗体和 GNS 抗体修饰的表面上选择性检测 SCC-Ag。进行了与 C1-丝氨酸蛋白酶抑制剂和 C-2-白蛋白的相互作用。表面用上述步骤直至1 M乙醇胺封闭。值通过三次重复平均。在这两种情况下，抗体只识别 SCC-Ag，表明特异性检测。 b 控制测量。将特异性相互作用与非特异性相互作用进行比较。注意到明显的歧视。在 0.01 V 阶跃电压下使用 0 到 2 V 的线性扫描电压进行测量。误差条表示三次重复的平均值 (n =3) 标准偏差范围在± 0.1到0.15 × 10 ⁻⁹ 一个

结论

头颈癌是一种常见的癌症，会影响口腔、喉咙和唾液腺区域。必须使用合适的生物标志物诊断头颈癌，以便为患者提供必要的治疗并改善他们的生活方式。 SCC-Ag 已被发现是癌症的重要生物标志物之一； herein, SCC-Ag was detected on the titanium oxide-coated interdigitated electrode sensing surface (IDE-TiO2). Antibody for SCC-Ag was immobilized on IDE-TiO2 surface and detected the SCC-Ag. The detection limit was found as 100 fM, and further increment in the limit of detection was attained by conjugating the antibody with gold nanostar (GNS antibody). The limit of detection was improved by 10-folds (to 10 fM), this might be due to the larger number of antibody bound on the amine-modified TiO2 surface through GNS. Moreover, control experiments were carried out with two different proteins and not able to recognize by the anti-SCC-Ag, indicating the selective detection of SCC-Ag. The demonstrated IDE-TiO2 sensing surface helps to diagnose the head and neck cancer, a strategy can be followed for the earlier detection.

数据和材料的可用性

All of the data are fully available without restriction.

缩写

16-MDA:

16-Mercaptoundecanoic acid

APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

GNS:

Gold nanostar

IDE:

Interdigitated electrode

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

RT：

Room temperature

SCC-Ag:

Squamous cell carcinoma antigen

SiO2：

二氧化硅

TiO2:

Titanium oxide

紫外线：

紫外线