通过镀金和等离子处理调整聚醚醚酮的表面化学

背景

人类衰老的问题之一是关节磨损，这与骨骼和关节系统的各种疾病的数量急剧增加有关，包括骨折、椎骨退化、关节炎和骨肿瘤。使用人工植入物的骨科手术是目前用于修复受损骨骼和关节的结构和功能的主要方法。通常用于骨科植入物的材料特别是金属、陶瓷、聚合物和复合材料。金属植入物（例如金）在临床实践中被广泛用作永久性替代物（例如髋关节置换物、人造牙）或颞部假体（例如用于固定骨折的椎间盘、铰链、螺钉和杆）。金属因其机械强度、耐磨性和无毒而受到青睐 [1,2,3]。另一方面，它们的高机械强度和低弹性与人体骨骼组织不相容。这可能会对骨植入物产生负面影响，从而导致相邻骨组织被吸收并释放植入物。超高分子量聚乙烯 (UHMWPE)、聚四氟乙烯 (PTFE)、聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)、聚丙交酯 (PLA)、聚乙交酯 (PGA) 和聚羟基丁酸酯 (PHB) 等聚合物广泛用于各种生物医学应用。但是只有有限数量的聚合物被用作骨或关节替代物，因为它们往往过于柔韧和脆弱，无法满足对机械骨科植入物的要求[4, 5]。

聚醚醚酮 (PEEK) 是一种半结晶线性多环芳族热塑性聚合物，于 1978 年首次合成 [6]。 PEEK 通常用作椎间垫片和接骨螺钉的材料 [7, 8]。由于其特殊的化学结构，PEEK具有很高的抗化学和物理变化能力[6, 9, 10]；此外，它耐磨且在高温下稳定[6]。此外，PEEK 生物相容性在体外和体内均已得到证实，并且不会引起任何毒性或致突变作用 [11,12,13]。它的一大优点是弹性类似于人体骨骼，可以在植入物和骨骼之间平衡重量分布；因此，植入后没有应力屏蔽效应。然而，PEEK 具有疏水性和生物惰性，不利于蛋白质吸附和细胞粘附 [14, 15]。因此，为了改善这些性能，需要对PEEK表面进行改性。

材料的表面特性可以通过各种技术进行调整 [16]。其中一种方法是通过等离子体对生物聚合物表面进行改性，该方法使用在包含低压气体的封闭反应器系统和电磁气体激发装置中产生的电离气体。与湿法技术相比，生物聚合物表面的等离子体改性有利于化学灵活性。电磁产生的反应颗粒与反应器中的生物聚合物表面相互作用，导致其物理和化学性质发生变化。与其应用相关的材料块体的机械、电学和光学特性保持不变 [17]，这有利于生物相容性聚合物的设计、开发和制造。另一种用于改善聚合物表面特性的方法是阴极溅射。将金纳米粒子集成到薄膜中对于各种应用很重要，例如组织工程和生物传感 [18]。纳米颗粒尺寸会影响材料表面的行为和表面特性（例如，密度、晶格参数、电学和光学特性）[19]。尤其是小于 100 nm 的纳米颗粒通常会增强细胞粘附和增殖 [20]。

这项工作的目标是通过等离子体处理和金沉积在 PEEK 上形成纳米结构，以改善细胞粘附和增殖，特别是小鼠胚胎成纤维细胞 (L929)。处理前后的表面特性（极性、表面化学和结构）通过各种技术（重量法、测角法、X 射线光电子能谱和电动分析）进行评估。此外，采用原子力显微镜检查 PEEK 表面形态和粗糙度。在潜在的生物医学应用的背景下讨论了结果，主要用于脊柱植入物的构建以及骨科和创伤学的其他替代品。

方法

材料和修改

PEEK 箔（厚度为 50 μm，密度为 1.26 g cm ⁻³ ，由英国 Goodfellow Ltd. 提供）用于所有实验。所有 PEEK 样品（圆形，ø =2cm) 用等离子体处理，然后对每个样品的一半进行镀金。 PEEK 样品在直接（辉光、二极管）Ar ⁺ 中处理 在 [18, 21] 中描述的条件下，使用 Balzers SCD 050 设备（BalTec AG, Pfäffikon, CH）进行等离子体处理。处理时间为 60 秒和 240 秒，放电功率为 8.3 W。PEEK 的金涂层是通过 Balzers SCD 050 设备从金靶（纯度为 99.95%，由 Safina Ltd., CZ 提供）完成的。沉积条件为DC Ar ⁺ 等离子体;气体纯度99.995%；溅射时间为 30、150 和 300 秒，电流为 40 毫安（放电功率 15 瓦）；和总 Ar ⁺ 压力。电极距离、功率密度和平均沉积速率的调整与 [18, 22] 中所述类似。制备的样品储存在实验室条件下（24°C，40-60% 湿度）[23]。

测量技术

重力测量

使用 Mettler Toledo UMX2 微量天平通过重量法测量金膜的平均厚度。使用金的体积密度，根据溅射前后的样品重量计算厚度。每种类型的修改的十个样品用于测量。重量测量误差在15%以下。

接触角

样品的润湿性通过测量它们的表面水接触角 (WCA) 来确定。此外，由等离子处理和金沉积引起的结构和成分变化的表征由液滴形状分析系统 DSA 100（KRÜSS GmbH，DE）在室温（24°C，40-60% 湿度）下确定 [23]。使用不锈钢针将 2.0 ± 0.2 μL 的水滴沉积在测试样品上。液滴的图像是在 2 秒延迟后拍摄的。然后，使用 ADVANCE 系统评估接触角。对每个样品的至少三个重复进行至少七次不同位置的测量，并取平均值以产生最终的 WCA 及其标准偏差。 WCA 的测量是对“老化”14 天的样品进行的。

X 射线光电子能谱

所制备样品的化学成分由由 Omicron Nanotechnology ESCAProbeP 光谱仪（由 Omicron Nanotechnology GmbH，DE 提供）测量（三次测量）的 X 射线光电子能谱（XPS）确定，相对误差为 10%。暴露和分析区域的尺寸为2 × 3 mm ² .测量条件在[18, 21]中描述。特征碳 (1s ), 氧气 (1s ) 和黄金 (4f ) 峰进行了搜索。测量在超轻型真空中进行。获得的光谱的评估是通过 CasaXPS 代码进行的 [24]。用于测量的样品“老化”了 14 天。测量前，样品在标准实验室条件下保存。

泽塔电位

通过 SurPASS Instrument (Anton Paar) 测定所有样品的电动分析（电动势、zeta 电位）。在与电解质接触的可调节间隙电池内研究样品 (0.001 mol L ^-1 KCl) 以及缓冲溶液（磷酸盐缓冲盐水 (PBS)）。对于每次测量，将一对具有相同顶层的聚合物薄膜固定在两个样品架上（横截面为 20 × 10 mm ² 并且它们之间的间隙为 100 微米）。所有样品均重复制备两次；均在恒定pH 6.8 条件下测定3 次，实验误差为5%。为确定 zeta 电位，使用流动电流法并应用亥姆霍兹-斯莫洛夫斯基方程计算 zeta 电位 [25,26,27]。用于测量 zeta 电位的老化样品“老化”了 14 天。

原子力显微镜

使用VEECO CP II系统（Bruker Corporation，Billerica，MA，USA）通过原子力显微镜（AFM）检查样品的表面形态。使用弹簧常数为 20–80 N m ^-1 的硅 P 掺杂探针 RTESPA-CP 在“轻敲模式”下测量表面 （布鲁克公司，Billerica，MA，美国）。通过重复测量同一区域 (1 × 1 μm ² )，我们验证了连续扫描 3 次后表面形态没有变化。用于测量的样品老化 14 天。

电感耦合等离子体质谱

电感耦合等离子体质谱检测器 (ICP-MS) 用于测定释放到 PBS 中的金离子量 (pH =7.4)。 Au 浸出液的痕量元素分析使用连接到自动进样器的 Agilent 8800 三重四极杆质谱仪（安捷伦科技，日本）进行。使用配备蠕动泵的 MicroMist 装置进行样品雾化。测量的不确定度（每个样品一式三份）小于 3%。 ICP-MS 的浸出液是通过将样品在 PBS 中在 5% CO2 的加湿气氛中在 37°C 下静态孵育 6、24 和 72 小时来制备的。浸出液按1:8的比例用蒸馏水稀释后分析。

细胞培养

根据国际标准 EN ISO 10993-5，使用小鼠成纤维细胞的 L929 细胞系（Sigma，USA）在体外进行细胞相容性测试。 PEEK 样品（原始、等离子体处理和镀金）在闪烁计数器小瓶中的 70% 乙醇中灭菌 20 分钟，插入 12 孔板（Jet Biofil，Ø 2.14 cm），用 PBS 洗涤，并安装到孔上底部带有由聚（甲基丙烯酸甲酯）制成的中空塑料圆柱体。 L929 细胞以每孔 30,000 个细胞的密度接种在含有 10% 胎牛血清（FBS，Invitrogen，USA）和 2 mM 的 1 mL 高葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，Sigma，美国）中的样品顶部稳定的 l-谷氨酰胺（l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，Sigma，美国）。 L929 细胞在 37°C 下保持在 5% CO2 的湿润气氛中。

荧光显微镜

在所需的孵育时间（6、24 和 72 小时）后，按照 [28、29] 中所述类似的方式固定和染色细胞。 L929 细胞用 PBS 洗涤并用 PBS 中的 4% 甲醛（Thermo Scientific，美国）固定（37°C，20 分钟）。 PBS 洗涤后，细胞骨架的 F-肌动蛋白在 PBS 中用鬼笔环肽-Atto 565（Sigma，美国）标记 20 分钟。然后，细胞核用 DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐，Sigma，美国）染色 10 分钟，用 PBS 冲洗细胞，用封固剂覆盖（Vector Laboratories，美国），和安装在显微载玻片和盖玻片之间。所有样品（“陈化”14 天）均一式三份进行测试。

扫描电子显微镜

通过扫描电子显微镜 (SEM) TESCAN LYRA3 GMU (Tescan, CZ) 以二次电子模式表征在原始 PEEK、等离子体/金界面和对照（玻璃盖玻片）上生长的受检细胞的详细形态。用于 SEM 分析的细胞用 PBS 洗涤，用 Karnovsky 溶液 [30, 31] 固定在 0.1 M 甲胂酸盐缓冲液 (pH 7.2) 中，然后脱水（增加乙醇的百分比，然后在六甲基二硅氮烷中孵育 10 分钟的两个最后步骤并在 40°C 的烘箱中干燥 2 小时）。脱水后的样品包覆一层10 nm的金层。

结果与讨论

所有测量均使用等离子处理和金溅射后 14 天的“老化”样品进行。众所周知，在等离子体处理过的聚合物表面上形成的官能团是不稳定的，并且会随着时间而变化 [32]。材料表面往往会恢复到未经处理的状态 [33]。因此，等离子体处理产生的化学基团的重新取向发生了改变[34, 35]。

通过重量分析研究了等离子处理过程中的 PEEK 烧蚀，然后是 Au 溅射。由烧蚀引起的聚合物质量损失和溅射引起的质量增长连续转化为聚合物厚度。等离子处理（60 秒和 240 秒，功率为 8.3 瓦）后测定的质量损失如表 1 所示。随着暴露时间的增加，明显的消融损失很明显，但只是翻了一番。轻微的损失可能是由 PEEK 的芳香特性引起的，这导致比例如聚烯烃的脂肪链 (UHMWPE) 的情况下增强的抗裂解性。对于金溅射，将 30 和 300 秒的时间段确定为不连续和连续层的代表性示例 [19, 36]。减少的烧蚀损失导致金在 PEEK 表面的锚定得到改善，这对于具有 150 秒和 300 秒金涂层的样品来说是显而易见的。

根据等离子体处理和金溅射时间测量的样品的水接触角值如表 2 所示。等离子体处理后，WCA 从 79.5 ± 2.4°（未改性的原始 PEEK）增加到 94.0 ± 5.5° 和 95.6 ± 2.1° （PEEK 分别用等离子处理 60 秒和 240 秒）。与值的偏差相比，等离子处理后 WCA 值的差异可以忽略不计。与等离子处理的样品相比，WCA随着Au涂层的增加而降低，表面变得更加亲水。

聚合物表面的元素浓度（六至八个原子层的可及深度）通过 XPS 方法检测；结果总结在表 2 中。 XPS 数据是针对原始 PEEK、等离子处理的样品和等离子处理的样品然后镀金获得的。从 XPS 测量中，可以看出氧浓度随着治疗时间的延长而增加。这可能是由于含氧基团重新定向到聚合物体积中所致 [37,38,39]。证明基团的取向在等离子体处理后立即发生；因此，在样品的“老化过程”中，其表面会发生变化。出于这个原因，当样品的“老化”状态稳定时，样品在等离子体处理后测量了 14 天 [40, 41]。氧浓度随着等离子体处理的延长而增加。聚合物表面被更强的等离子体放电破坏，在表面上产生自由基；等离子体功率越高，聚合物改性越明显。这些部位与空气中存在的氧气发生反应，并增加处理过的表面上的氧气浓度 [42, 43]。金溅射后，氧浓度降低，但金层受损。金的浓度随着溅射时间的减少而增加，而表面没有受到太多破坏。

图 1 显示了通过 AFM 获得的 PEEK 表面形态。在两种暴露时间（60 秒和 240 秒）内，等离子体处理都会导致 PEEK 表面发生可检测到的变化，但正如预期的那样，长时间暴露于等离子体会导致表面更粗糙，从而导致样品金属化的差异。通过等离子体处理更长时间的样品形成了更明确的金属簇。这种效果在具有厚（溅射 300 秒）和非常薄（溅射 30 秒）金层的样品上尤为明显。短时间（60 秒）等离子体处理的样品形成较少数量的较大且不规则的簇。至于仅溅射 30 秒的层，只有在等离子体处理 240 秒的基板上才能轻松识别金属簇。正如预期的那样，簇大小和表面粗糙度通常随着金溅射时间的延长而增加。这种行为与 XPS 测量非常吻合。用金属溅射 30 秒的样品的大部分表面已经被金属覆盖，进一步的溅射主要导致簇的垂直生长；因此，它对金浓度没有如此显着的影响，仍然留下了部分未覆盖的聚合物表面。此外，依赖于等离子体处理时间的簇形状的差异与 XPS 的发现非常吻合。仅短时间（60 秒）等离子处理的样品上的不规则大簇覆盖了相对较大的 PEEK 表面；因此，通过 XPS 测定的金浓度略有增加。用不同厚度的金属层溅射的原始材料之间的形态差异可以与聚-l-乳酸 (PLLA) [44] 和聚四氟乙烯 (PTFE) [45] 获得的数据进行比较。原始 PTFE 具有非常粗糙的表面；因此，我们没有观察到小金属簇的形成，而是表面粗糙度普遍降低。这是由溅射金属更喜欢填充聚合物表面上的“谷”以保持在“峰”上的现象引起的。另一方面，PLLA 表面显示出更多的颗粒化和与 PEEK 结构相似的结构的形成，但规则性较低。这些数据表明，溅射聚合物上规则颗粒结构的形成受聚合物表面规则性的严重影响；因此，PEEK（PEEK、PLLA和PTFE中表面粗糙度最小的聚合物）可以在表面形成最规则的金属簇。

原始 PEEK、经等离子体 (pl) 处理 60 和 240 秒的 PEEK 以及溅射 30、150 和 300 秒的金 (Au) 的 AFM 图像

电动分析表明，经过单独的表面改性步骤后，PEEK 表面化学和电荷发生了变化。在第一步中，等离子体处理导致在 PEEK 表面产生新的极性基团，从而导致 zeta 电位增加 [19, 25,26,27]。在第二个修改中，金簇在样品表面的沉积也对表面化学和 zeta 电位产生影响（图 2）。由于聚合物表面存在金属，因此表面电荷变化的影响起着重要作用——电子的积累 [27, 46]。我们还观察到新鲜和“老化”样品的不同 zeta 电位。在 PBS 中测量的 zeta 电位检测到更显着的变化，这是由不同浓度的离子给出的。而在 KCl 溶液中，KCl 的浓度为 0.001 mol L ^-1 ;在 PBS 中，离子浓度高出三个数量级。 PBS 中较高的离子浓度会导致双电层受压并导致 zeta 电位（绝对值）降低 [27, 46]。因此，即使从负值变为正值，更高浓度的离子也会导致表面电荷发生变化。因此，在 PBS 溶液中测定的 PEEK zeta 电位的变化更加剧烈，表面化学和电荷的变化更加明显。因此，很明显，等离子体处理和随后的 Au 沉积会导致聚合物表面化学和电荷发生巨大变化，这取决于等离子体处理的时间以及 Au 沉积。这些结果证实了其他进行的分析。

等离子体处理的 PEEK（60 和 240 秒）和 Au 溅射（30、150 和 300 秒；电流 40 毫安）PEEK 样品在 1 mM KCl 溶液中的 Zeta 电位（绿色柱 ——新鲜样品； 棕色柱子 —老化样品）和 PBS 溶液（灰色柱状 )

为了确定在细胞培养过程中释放到培养基中的金浓度，我们使用了一个简单的 PBS 水性系统来模拟这些条件。通过 ICP-MS 测量静态孵育 6（细胞粘附时间）和 72 小时（细胞增殖）后释放到 PBS 中的金，结果总结在表 3 中。PBS 具有与细胞培养基相同的 pH 值和渗透压;因此，它被用于 ICP-MS 测量。一方面，PBS是一个简化的系统；另一方面，没有可能干扰 ICP-MS 测量的成分，就像在完全细胞培养基的情况下一样。我们发现，与 300 秒相比，涂有 Au 30 秒的 PEEK 样品释放到 PBS 中的 Au 浓度更高。这可能是由于金层的不连续特性造成的，可能会形成小金簇，这些簇溶解得更快 [47]。与 PEEK/240/300 相比，样品 PEEK/60/300 中金的释放程度更高，因为其表面烧蚀程度较低，并且金的锚定程度明显较低。

在下一步中，检查了聚合物的表面改性是否可以促进内皮细胞粘附。 PEEK 表面通过等离子体处理和金溅射活化。 PEEK 细胞相容性是根据细胞粘附（6 小时）和增殖（24 小时和 72 小时）的结果确定的，如图 3 所示。每两列（PEEK/血浆 (ab) 和 PEEK/(ab) /Au (cde)) 代表一个样本的两半。在原始 PEEK 和对照组织培养聚苯乙烯 (TCPS) 上生长的 L929 细胞数量的差异在测量误差范围内。在样品表面接种细胞后 6 小时监测细胞粘附。很明显，与处理过的样品相比，原始 PEEK 的细胞数量有所增加。细胞生长 24 小时后，我们观察到细胞数量仅略有增加，这可能是由于细胞适应新环境时的滞后期所致 [48]。很明显，接种 72 小时后，与其他测量样品相比，在沉积 30 秒（60 和 240 秒等离子体处理）的样品上生长的细胞数量非常少。这些值与 ICP-MS 测量的结果一致，其中金最大程度地释放到 PBS 中。在这种情况下，沉积在 PEEK 上的 Au 层（30 秒）具有不连续特征 [36]；因此，金簇可以释放到细胞培养基中。通过这个过程，培养基可能对培养的细胞产生毒性。在样品 PEEK/pl 60 s/150 s 上观察到在金层上生长的最大细胞数（与等离子体处理的样品相比），金层在其上是连续的。接下来，在接种 72 小时后，最适合 L929 细胞生长的环境是用等离子体处理 60 或 240 秒并随后用金包被 300 秒的样品。这些样品上的金层也是连续的 [36]。根据 ICP-MS 的数据，只有极少量的 Au 被释放到细胞培养基中。然而，这种释放的金可能是等离子体处理表面细胞增殖增加的原因。

在 TCPS、原始 PEEK 和具有等离子处理（60 和 240 秒）和金溅射（30、150 和 300 秒）区域的金界面的 PEEK 上培养 6、24 和 72 小时后的 L929 细胞数量

为了进一步更详细地评估细胞形态和细胞间连接，我们对在测试基质上生长的 L929 细胞进行了高分辨率扫描电子显微镜检查；结果如图 4 所示。 SEM 分析的扫描是在原始 PEEK 和等离子处理过的镀金 PEEK 以及用作对照的玻璃盖玻片上进行 72 小时后进行的（通常使用SEM 分析 [49] 以及免疫荧光研究 [29]）。从图 4 可以看出，细胞在原始 PEEK、PEEK 等离子体处理 60 秒（后半部分是 300 秒 Au）和 240 秒（后半部分是 150 和 300 秒 Au）以及玻璃盖玻片上生长培养 72 小时后具有相似的形状。细胞完全分布在等离子体处理过的表面上，在该细胞层之上，新的增殖细胞层的形成是明显的。尽管环境不适合细胞增殖，但细胞在 PEEK/60（后半部分为 150 s Au）和 PEEK/240/30 s Au 样品的表面呈球形。在 PEEK/240/300 s Au 上观察到最圆的细胞，这与图 3 中显示的数据完全相关。

L929 细胞在原始 PEEK、等离子体处理的 PEEK（60 和 240 秒）上培养 72 小时的 SEM 图像，以及它们的镀金部分溅射 30 和 300 秒（显微玻璃盖玻片作为对照）。 比例尺 对应于 10 μm

结论

我们比较了两种不同的 PEEK 修饰方式，以创造一种具有改善细胞粘附和生长的材料。获得的结果证实了在个别修改步骤后表面特性的可变变化。两种采用的改性方式都会导致表面化学、形态、润湿性和电荷发生变化。 240 秒的等离子体处理导致 PEEK 的重量损失比 60 秒的处理高两倍。 PEEK 表面的润湿性没有被等离子体处理显着改变。 XPS 测量证实了一个普遍事实，即随着等离子体处理时间的增加，PEEK 表面的碳浓度降低，相反，氧浓度增加。等离子处理 60 秒后，沉积的金膜的厚度更高。金溅射增加了 PEEK 的表面润湿性。 XPS 分析的结果显示，两种等离子体处理的样品（60 秒和 240 秒）具有相同的趋势，碳和氧浓度随着沉积时间的增加而降低，有利于金浓度的增加。 AFM 图像也证实了 XPS 测量结果，特别是对于经等离子体处理 60 秒和镀金 300 秒的样品，其上不规则的大簇覆盖了相对较大的 PEEK 表面；因此，金浓度略有增加。还发现金层薄而厚的样品不适合细胞繁殖。

这项研究表明，与原始材料相比，等离子体处理提高了 PEEK 的细胞相容性。此外，当金被释放到细胞培养基中时，等离子体处理是一种比金溅射更好的聚合物改性方法以促进细胞生长。

缩写

原子力显微镜：

原子力显微镜

二氧化碳：

二氧化碳

DAPI：

4',6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐

DMEM：

Dulbecco改良Eagle培养基

FBS：

胎牛血清

ICP-MS:

Inductively coupled plasma mass spectrometry

KCl:

Potassium chloride

L929:

Mouse embryonic fibroblasts

PBS:

Phosphate-buffered saline

PEEK:

Polyetheretherketone

PGA:

Polyglycolide

PHB:

Polyhydroxybutyrate

PLA:

Poly(l-lactide)

PMMA:

Polymethylmethacrylate

PTFE:

Polytetrafluorethylene

SEM:

Scanning electron microscopy

TCPS:

Tissue culture polystyrene

UHMWPE:

Ultra-high-molecular-weight polyethylene

WCA:

Water contact angle

XPS：

X射线光电子能谱