二氧化钛传感器实现头颈癌早期纳米级检测
摘要
头颈癌是一种异质性疾病，起源于喉（声带）、口腔、咽（喉咙）、鼻腔和唾液腺内壁的鳞状细胞。晚期诊断严重影响患者生存率，亟需合适的生物标志物在早期识别该癌症。鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）是一种循环血清肿瘤生物标志物，在头颈癌患者中水平升高且与肿瘤体积高度相关。本研究利用SCC-Ag抗体在二氧化钛（TiO2）修饰的指互锁电极传感器（IDE）上检测和定量SCC-Ag。检测限为100 fM，当抗体与金纳米星（GNS）偶联后提升至10 fM，实现10倍灵敏度提升。有趣的是，这种灵敏度增强比其他底物高1000倍。特异性分析使用两种对照蛋白显示抗体仅识别SCC-Ag，证实了IDE-TiO2传感表面的特异性检测能力。
引言
头颈癌表现为头颈部异常细胞生长，广泛报道，起源于咽喉、口腔、黏膜、口腔上皮、唾液腺和鼻腔[1]；是全球第六大常见癌症，每年影响超644,000人[2]。多数患者确诊时已处晚期，严重影响生存。早期识别头颈癌对改善生存率和生活质量至关重要。血清肿瘤标志物用于头颈癌的诊断和随访治疗管理。鳞状细胞释放的主要鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）在癌症患者中升高，已被证明是鳞状细胞相关癌症（如妇科、肺、食道和肛门癌）的有前景肿瘤标志物[3,4]。针对头颈癌，多项研究证实SCC-Ag高水平与疾病转移、复发和死亡率相关[5-7]。研究发现血清SCC-Ag在咽下部、口腔和喉癌中处于显著风险水平[8,9]。此外，SCC-Ag水平与头颈癌患者肿瘤体积相关[10]。量化SCC-Ag水平以识别头颈癌状况、实现早期治疗至关重要。本研究聚焦于利用指互锁电极（IDE）传感器上的纳米颗粒通过SCC-Ag抗体在低水平检测SCC-Ag。
IDE是一种电化学生物传感器，具有低成本、便携、灵敏等优势，广泛应用于环境监测和医学诊断[11,12]。增强传感表面电学性能可提高生物分子检测能力。纳米材料在生物传感器中广泛应用以增强传感表面生物分子检测。纳米材料尺寸小、比表面积大、热电导率好、与生物分子相容，在生物传感器领域展现巨大应用潜力[13,14]。纳米材料应用于生物传感器主要有两种方式：表面功能化和偶联分析物/靶标以提高检测灵敏度[15]。金是成熟纳米材料，应用于表面等离子体共振、波导模式传感器、电化学传感器和比色法等各类传感器[16-18]。此外，银、石墨烯、铜和钛纳米材料也用于生物医学应用。作为环境友好型半导体且低成本，二氧化钛（TiO2)具有宽带隙，本研究用于IDE表面修饰以检测SCC-Ag。凭借优异的电学和光学性质，TiO2广泛用于超级电容、光催化和光电转换[19-23]。其亲水性和大比表面积适合表面修饰，有助于在低水平检测生物分子。本研究在IDE传感表面涂覆TiO2以增强生物分子相互作用时的电流流动。为提高SCC-Ag检测，将抗体与金纳米星（GNS抗体）偶联并固定在TiO2涂覆表面。已证实金纳米材料偶联生物分子表现出更高稳定性并提供适当取向的表面固定生物分子，能提高检测限[24,25]。此外，单个金颗粒可固定更多生物分子，从而吸引更高水平的靶标分子。本工作使用两种纳米材料：TiO2（表面修饰）和GNS（抗体偶联），以提高IDE传感表面SCC-Ag检测性能。GNS应用预期通过其更大表面积捕获更多抗体来增强当前传感器性能。
材料与方法
试剂与生物分子
SCC抗原（糖蛋白，同工型45-55 kDa）购自Randox Life Sciences（马来西亚）。抗SCC抗体购自Next Gene（马来西亚）。(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）、乙醇胺、白蛋白（主要血液蛋白，45 mg/mL；占血液蛋白50-70%，分子量66.5 kDa）、磷酸缓冲盐水（PBS；pH 7.4）和异丙醇钛购自Sigma Aldrich（美国）。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白（丝氨酸蛋白酶抑制剂，常见分布，分子量40-50 kDa）购自Sino Biological（中国）。金纳米星按Shan等文献[26]合成。所有试剂化学品按制造商建议储存。
指互锁电极制备
IDE基本设计制备遵循早期报道[27]。硅片经标准清洗液清洗，通过传统湿法刻蚀在硅片上沉积铝IDE电极。随后在硅片表面沉积正性光刻胶，进行热氧化。通过光刻技术沉积铝。分三步：步骤1为1200 rpm 10 s，步骤2为3500 rpm 20 s，步骤3为500 rpm 10 s。随后紫外光照射传感表面将IDE图案转移至样品表面。用RD-6显影液显影15 s。光刻去除未曝光区域。显影样品100℃烘烤以去除水分并改善SiO2层与铝的粘附。最后用铝刻蚀剂蚀刻23 s去除未曝光区域，丙酮清洗。最终表面经TiO2修饰以检测SCC-Ag。制备的IDE表面在高倍显微镜和3D纳米轮廓仪下观察，×50放大倍率捕获图像。
IDE传感表面TiO2涂覆
在制备的IDE表面涂覆TiO2溶液，以异丙醇钛为前驱体制备TiO2溶液。乙醇与异丙醇钛混合剧烈搅拌5 min。滴加稳定剂（100 μL乙酸）于搅拌条件下，随后在热板上85℃加热。摩尔比固定为9:1:0.1（乙醇:TIP:乙酸）。混合3 h后获得澄清溶液。经24 h老化后，用旋涂机以2000 rpm将溶液滴覆在二氧化硅（SiO2）基底上。涂覆后175℃干燥15 min，450℃退火1 h。涂覆三层后TiO2薄膜获得足够厚度。
GNS偶联抗SCC-Ag制备
SCC-Ag抗体通过连接子16-巯基十一烷酸（16-MDA）固定在GNS上。首先，5 mM稀释16-MDA与100 μL GNS混合，室温（RT）孵育30 min。离心（13,000×g, 5 min）去除结合GNS的16-MDA。收集金沉淀，用EDC（400 mM）和NHS（50 mM）按1:1比例活化，室温孵育15 min。离心（13,000×g, 5 min）去除未结合EDC和NHS。收集含活化GNS的沉淀用于偶联抗体。随后200 nM SCC-Ag抗体与EDC-NHS活化GNS混合，室温孵育1 h。最后离心（13,000×g, 5 min）去除未结合抗体。GNS偶联抗体4℃保存备用，UV-Vis光谱扫描确认偶联。扫描区间480-560 nm，观察峰值最大值。
GNS抗体固定于TiO2-IDE表面
TiO2涂覆IDE表面经APTES胺基化以固定GNS抗体。3% APTES（30%乙醇稀释）滴加于TiO2表面，室温孵育3 h。用30%乙醇洗涤三次去除未结合APTES。固定抗体时按上述活化步骤进行。将抗体或GNS抗体滴加于表面孵育1 h完成固定。最后用PBS缓冲液洗涤五次彻底去除未结合抗体。这些抗体或GNS抗体修饰表面用于检测SCC-Ag并对比。GNS抗体固定TiO2表面经原子力显微镜（AFM）、场发射透射电镜（FETEM）和能量色散X射线（EDX）分析表征[15]。AFM观察5 μm尺度，SEM在100 nm尺度、15 kV操作。EDX分析表面元素。
抗体/金纳米星抗体表面SCC抗原检测
检测SCC-Ag时，抗体或GNS抗体修饰的TiO2-IDE表面用1 M乙醇胺封闭抗体自由区域，室温30 min。在乙醇胺封闭表面滴加1 nM SCC-Ag，记录加入前后电流响应。评估检测限时，SCC-Ag从10 fM至1 nM滴定，分别滴加于抗体或GNS抗体修饰表面，记录电流响应。实验三次重复并统计计算。测量采用0-2 V线性扫描电压，步进0.01 V。检测限（LOD）定义为校准曲线低浓度区对背景信号（S/N=3:1）的最低分析物浓度，即LOD = 基线标准差 + 3σ。
SCC-Ag选择性检测
为检查SCC-Ag与其抗体的选择性相互作用，用两种不同蛋白丝氨酸蛋白酶抑制蛋白和白蛋白进行对照实验。将1 nM浓度对照蛋白分别滴加于抗体或GNS抗体修饰表面，记录相互作用前后电流变化。将这些电流水平与SCC-Ag被其抗体和GNS抗体特异性检测的电流对比。其他对照实验包括SCC-Ag与单独GNS的相互作用、SCC-Ag与非免疫抗体标记GNS涂覆的TiO2-IDE表面相互作用。实验三次重复统计计算。测量采用0-2 V线性扫描电压，步进0.01 V。
结果与讨论
头颈癌被描述为在鼻、口、喉和鼻窦周围发展的不同肿瘤[28]。早期诊断和配合合适生物标志物治疗对提高患者生存率至关重要。SCC-Ag被发现是头颈癌合适的血清生物标志物；本实验在TiO2修饰的指互锁电极（IDE-TiO2)传感器上通过其抗体检测和定量SCC-Ag。TiO2用于改善生物分子相互作用时的电流响应。与其他纳米材料相比，TiO2因其电极表面的活性行为和电催化活性增强，被认为在电化学传感器中具有吸引力。此外，它赋予表面更多稳定性，产生电极响应的重复性并通过增加峰值电流提高检测限[29-31]。利用这一优势，本研究在IDE表面涂覆TiO2（IDE-TiO2)改善电流流动。另一种纳米材料GNS用于在IDE-TiO2表面固定抗SCC-Ag抗体并提高检测限。已证实金偶联生物分子固定表面提高靶标检测[32,33]，本研究在抗体和GNS抗体修饰的IDE-TiO2表面上检测SCC-Ag并对比。概括而言，纳米颗粒表面积增加将增强生物分子附着。GNS比球形金纳米颗粒具有更大表面积。为实施这一想法，本实验使用GNS增强灵敏度。
表面表征与GNS抗体固定
图1展示IDE-TiO2传感表面检测SCC-Ag的示意图。图1a显示IDE传感表面先涂覆TiO2，再固定含/不含GNS偶联的抗体。这些抗体修饰表面用于检测SCC-Ag水平。检测前，UV-Vis光谱确认GNS与抗体偶联。测定GNS偶联抗体前后的扫描谱（所需波长范围）。明显看到固定后峰值从535 nm移至545 nm（图1b），确认抗体在GNS表面固定。另一方面，制备的传感表面进行形貌观察。图2a显示高倍显微镜图像，图2b为3D纳米轮廓仪成像。两者清晰显示间隙和电极区域形成指状结构。间隙和手指排列均匀完整。
抗体与GNS抗体固定TiO2-IDE传感表面对比
SCC-Ag在TiO2-IDE表面通过抗体或GNS抗体固定表面检测。GNS在TiO2表面的附着经AFM、SEM观察和EDX分析确认（图2c）。AFM观察到TiO2和GNS分别呈现暗亮斑点的清晰区分。SEM和EDX分析支持此结果，观察到明显的金峰和适度钛峰。这些结果证明GNS存在于TiO2表面。图3展示抗体和GNS抗体在胺基修饰IDE-TiO2传感表面的固定过程。TiO2修饰IDE传感表面电流水平为4.65E-12（图3a）。加入APTES后电流升至5.37E-11，表明表面经APTES胺基化。固定抗体时电流从5.375E-11变为1.05E-9，电流差为1.04E-9（图3a）。此固定源于APTES胺基与抗体羧基的化学相互作用[18]。电流变化确认抗体在APTES修饰表面结合。随后用1 M乙醇胺覆盖剩余表面减少非特异性结合生物污染。类似地，GNS抗体固定于TiO2-IDE表面，固定时电流从4.41E-12增至1.23E-9（图3b）。明显当抗体固定在GNS表面时，在胺基修饰表面显示更高响应。这可能因单个GNS表面结合更多抗体，且该复合物在胺基修饰表面强结合。此结合因APTES氨基末端取代GNS柠檬酸基团并化学固定于APTES修饰IDE表面[34]。生物分子在传感表面检测主要取决于两因素：相互作用分子结合亲和力和分子在传感表面的适当固定。传感表面更高生物分子固定量显著提高低水平靶标检测。本研究用GNS在IDE-TiO2表面固定抗SCC-Ag抗体以增强抗体结合机会，实现高效SCC-Ag检测。
抗体或GNS抗体在IDE-TiO2表面SCC-Ag比较检测
因GNS抗体在IDE-TiO2表面高效固定，在相同1 nM SCC-Ag浓度下在两表面检测并对比电流变化。图4a显示抗体修饰表面1 nM SCC-Ag检测。检测前抗体修饰表面用乙醇胺封闭避免非特异性结合。乙醇胺显示电流变化4.65E-12。加入1 nM SCC-Ag后电流升至1.33E-9。电流变化明确指示SCC-Ag与其抗体结合。GNS抗体表面乙醇胺显示电流1.33E-11；加入1 nM SCC-Ag后增至1.62E-9（图4b）。相同SCC-Ag浓度下GNS抗体电流变化高于仅抗体修饰表面。这可能因更多抗体通过GNS结合在IDE-TiO2表面。
抗体或GNS抗体在IDE-TiO2表面SCC-Ag检测限
抗体或GNS抗体修饰表面均清晰检测SCC-Ag，在两表面估算检测限对比（图5a,b）。SCC-Ag浓度从10 fM至1 nM稀释，分别滴加于两表面记录电流变化。图5a显示不同浓度SCC-Ag在抗体修饰表面结合。乙醇胺后10 fM SCC-Ag相互作用，无电流变化。浓度增至100 fM时电流从4.65E-12微变至6.54E-11。进一步增至1 pM、10 pM、100 pM和1 nM，电流分别增至4.69E-10、7.91E-10、8.78E-10和1.33E-9。结果清晰显示浓度增加结合增加。基于3σ计算检测限为100 fM（图6a）。
相同浓度SCC-Ag独立在GNS抗体修饰表面相互作用。10 fM SCC-Ag滴加时电流从1.33E-11清晰变至3.74E-11。结果显示即使10 fM SCC-Ag也能清晰与GNS抗体固定表面相互作用，而仅抗体表面无法检测。浓度增至100 fM、1 pM、10 pM、100 pM和1 nM时电流进一步增至4.69E-10、9.23E-10、1.41E-9、1.48E-9和1.62E-9（图5b）。统计计算标准差在±0.1-0.15×10−9 A范围。比较两表面传感，GNS抗体修饰表面在所有测试SCC-Ag浓度下显示更高电流变化（图6b）。基于3σ检测限为10 fM（图6a），比仅抗体修饰表面低10倍（更好）。统计计算标准差在±0.1-0.15×10−9 A范围。此前SCC-Ag在不同纳米材料如锶纳米颗粒和石墨烯上评估，但这些表面显示比本研究低~1000倍灵敏度[35]。
抗体/GNS抗体修饰表面SCC-Ag选择性检测
SCC-Ag选择性检测与两种对照蛋白丝氨酸蛋白酶抑制蛋白和白蛋白对比，两者在血液中丰度高。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白执行不同人体生理功能和生物过程，白蛋白占血清45 mg mL−1，贡献50-70%。如图所示，1 nM浓度两种对照蛋白和SCC-Ag分别滴加于抗体或GNS抗体表面（图7a），明显仅SCC-Ag在两情况下产生电流变化，表明抗体仅识别SCC-Ag。对照蛋白相互作用无显著电流变化。此实验确认当前实验装置可特异性检测/诊断SCC-Ag。其他对照实验进一步支持：SCC-Ag与单独GNS相互作用、SCC-Ag与非免疫抗体标记GNS涂覆TiO2-IDE表面相互作用。与特异性相互作用相比无显著电流变化（图7b）。
结论
头颈癌是影响口腔、咽喉和唾液腺区域的常见癌症。用合适生物标志物诊断头颈癌对给患者必要治疗、改善生活方式至关重要。SCC-Ag被发现是重要癌症生物标志物之一；本研究在二氧化钛涂覆的指互锁电极传感表面（IDE-TiO2)检测SCC-Ag。SCC-Ag抗体固定于IDE-TiO2表面检测SCC-Ag。检测限为100 fM，通过将抗体与金纳米星（GNS抗体）偶联进一步提高检测限。检测限提高10倍（至10 fM），可能因更多抗体通过GNS结合在胺基修饰TiO2表面。此外，用两种不同蛋白对照实验未被抗SCC-Ag识别，表明SCC-Ag选择性检测。所展示的IDE-TiO2传感表面有助于诊断头颈癌，可遵循该策略实现早期检测。
纳米材料