在叉指电极表面检测 microRNA-335-5p 以确定腹主动脉瘤的严重程度

介绍

腹主动脉瘤 (AAA) 是一种危及生命的疾病，其定义为直径> 3 厘米或大于正常值的腹主动脉 [1, 2]。这种情况发生在动脉粥样硬化或斑块积聚时，这会削弱腹主动脉壁并导致向外膨胀，类似于气球。随着时间的推移，动脉壁变宽，这种情况堪比花园软管的老化。血液通过主动脉泵送的压力导致这个薄弱区域向外凸出，这被称为动脉瘤。当主动脉的薄弱部分导致并发症时，就会形成 AAA [3,4,5,6]。 AAA 可因小动脉瘤破裂而导致死亡。目前，体格检查、计算机轴向断层扫描血管造影、磁共振成像和超声检查用于诊断这种情况 [7,8,9,10]。但是，没有检测 AAA 的方法，在分析其他健康问题时通常会发现 AAA。这种情况会导致 AAA 的识别延迟，最终导致不必要的健康问题。为了克服这个问题，研究人员需要开发早期检测方法，其中一个潜在的策略是开发传感系统。

以定量方式早期、快速和灵敏地检测疾病是临床诊断的重要目标。目前的生物传感平台已满足多种需求，需要适当的实验室设置和培训。因此，大多数方法都不是便携式的，这是理想的即时检测所必需的 [11, 12]。此外，为了以准确和快速的方式帮助医生做出决策，非常需要对生物标志物水平的变化进行分析。应进一步研究在特定区域表达的循环生物标志物，以诊断 AAA 并跟踪治疗进展。识别这些类型的循环生物标志物将有助于诊断疾病并在治疗后进行患者随访。为了满足这些需求，本研究建议为 AAA 生成合适的生物标志物传感器。本研究中提出的传感器（叉指电极）具有对多种生物标志物进行高性能分析的潜力。它是一种具有交替间隙和指状物的介电极系统，可在介电测量下运行 [13,14,15]。

生物标志物可以是任何生物分子，包括 DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、脂质及其修饰形式 [16, 17]。此外，研究人员提出不同的生物标志物，如非编码 RNA，在细胞系统中表达，但它们不会被翻译成蛋白质 [18]。非编码 RNA 通常不会翻译成蛋白质，并且通常具有短序列 [18,19,20,21]。已经报道了不同类别的非编码 RNA，例如 microRNA (miRNA)、核糖体 RNA、转移 RNA、小核仁 RNA、小核 RNA、端粒酶 RNA、snRNA、Xist RNA、vault RNA 和 7SL RNA。 miRNAs 主要在基因表达的转录和转录后调控中起作用，并且经常导致基因沉默[22]。最近，研究人员描述了 miRNA 对 AAA 预测的重要性，并报告了 AAA 患者中 miRNA-335-5p 表达的降低 [23]。已经证明，临床因素和 microRNA 表达的结合极大地改善了疾病的预测并显示出更高的准确性 [24]。研究人员特别关注 miRNA-335-5p，它在快速增长的 AAA 个体中显示出显着最小的范围 [2, 23]。此外，miRNA-335-5p 水平的降低增强了检测生长 AAA 的信心。换句话说，miR-335-5p 的负输出（更高水平）表明 AAA 的严重程度，并最大限度地减少了繁重的筛查。 Wanhainen 等人证明了这一发现。 [23] 并揭示 miRNA 是筛查 AAA 和消除快速增长的 AAA 风险的有用生物标志物。目前的研究证明了交叉电极 (IDE) 传感器检测 miRNA-335-5p 在确定受影响个体 AAA 严重程度中的应用。

材料和方法

试剂和生物分子

链霉亲和素、1,1'-羰基二咪唑 (CDI) 和磷酸盐缓冲液 (PBS) 购自美国 Sigma-Aldrich。乙醇胺购自英国 Fisher Scientific。所有寡核苷酸均由 Apical Scientific Sdn. Bhd 商业合成。 Bhd., 马来西亚。

Chrome Mask 上的图案设计

最初，介电传感器的图案是使用 AutoCAD 软件设计的。所需的尺寸是长度为 7500 μm，宽度为 4100 μm，20 对手指间隙，间隙尺寸为 85 μm，电极尺寸为 100 μm，电极厚度为 40 nm，手指长度为 4000 μm。将图案印刷在空白光掩模上并粘贴在铬玻璃表面。这种铬玻璃固定在紫外线曝光系统下用于图案转移程序。将沉积有铝薄膜的二氧化硅基材以相反方向放置在铬玻璃上，并暴露于紫外线下 10 s。图案被转移，然后使用抗蚀剂显影剂进行显影。

叉指电极的制作

表面电极是通过常规的微电子制造工艺制成的，用于制造表面如下： (i) 制备具有现有天然氧化物的 4 英寸晶片。 (ii) 使用缓冲氧化物蚀刻 (BOE) 和食人鱼溶液清洁晶片以去除天然氧化物和无机污染物。 (iii) 在 1000 °C 的温度下，通过一小时的湿热氧化生长 2800 埃厚的氧化物层。 (iv) 为了更好的处理，带有氧化层的晶片被分成四份。 (v) 金属层沉积有 l 作为导电层的粘附层。铝层（40 nm）通过基于热蒸发器的物理沉积方法制备为 3 cm 长和 0.5 mm 直径，（vi）一层正性光刻胶是在基板上的旋涂，（vii）晶片是在 90 °C 下软烤 60 秒。 (viii) 将晶片与铬掩模对齐并暴露于紫外线下 10 s。 (ix) 在 15 秒内用 RD6 显影液冲洗晶片以去除未曝光区域，从而形成带有氧化物的叉指电极 (IDE) 图案。 (x) 晶片在 90 °C 下硬烘烤 120 秒。 (xi) 使用王水蚀刻晶片以去除两层的暴露区域。 (xii)制作表面图案，用丙酮洗掉剩余的光刻胶。然后，进行 3D 纳米轮廓测量法（Hawk 3D 轮廓测量法，美国）分析以观察电极之间间隙的清晰图像。电流测量 (A) 使用 Keithley 6487 进行，线性扫描范围为 0 到 2 V，步长为 0.1 V（20 s）。

表面化学功能化：四价链霉亲和素-生物素策略

对于表面化学功能化，二氧化硅表面最初用 1 M 氢氧化钾（pH 9.0）彻底清洗以活化表面。该表面通过 CDI (0.5 M) 进一步修饰，孵育时间为 1 小时，以与 100 nM 链霉亲和素反应（1 小时），在 10 mM 磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）中从原始储备中稀释。在此步骤之后，未反应的空间用 1 M 乙醇胺封闭（1 小时）。然后，四价链霉亲和素在室温下与 1 μM 的生物素化探针 miRNA-335-5p 反应（10 分钟）。每次修改完成后，除非另有说明，否则用PBS彻底清洗表面。

设计来自 miRNA-335-5p 的探针和目标序列

全长 miRNA-335-5p（5'-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3'）已从数据库中收集，登录号为 MIMAT0000765。本研究所需的目标区域是 5'-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3'。为了捕获目标 miRNA-335-5p 区域，探针被设计为 5'-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3'。在 3' 端，生物素被标记为与固定在传感表面上的链霉亲和素相互作用。全长miRNA-335-5p的二级结构由在线mfold软件(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)预测。

探针-目标相互作用：miRNA-335-5p 序列

如上所述，生物素化探针与链霉亲和素表面结合后，目标 miRNA-335-5p 序列在环境室温下相互作用（10 分钟），从低飞摩尔浓度到低纳摩尔浓度。这些浓度范围从 1 fM 到 1 nM，在 PBS 中连续稀释 10 倍。从低浓度到高浓度独立测试附着物，形成双链体后，用 5 倍体积的 PBS 清洗表面，并进行测量。

I-V 测量

使用具有电压/电流电源的 Keithley 6487 皮安表通过 I-V 测量来执行电气特性。在裸露表面上的上述伏特下记录测量值，然后在每个表面上进行化学改性。类似地，对于每个浓度下探针和目标 miRNA-335-5p 之间的交互分析，测量是在洗涤步骤后用 10 个反应体积进行的。除非另有说明，否则所有修改、相互作用和测量均在潮湿条件下进行。

结果与讨论

IDE 传感器的制造和表面分析

目前的研究使用 miRNA-335-5p 作为工具，通过对叉指电极 (IDE) 传感器的交互式分析来阐明 AAA 的严重程度（图 1）。为了与探针和从全长 miRNA-335-5p 设计的目标进行交互分析，使用传统的光刻技术设计和制造了 IDE 表面。逐步进行表面改性并通过电流表进行测量（图 2b、c）。为制造 IDE 设计的掩模对准和均匀性通过高分辨率 3D 纳米轮廓分析得到证实。这一观察证实了每个手指之间的制造和距离很好地对齐（图 2d）。 IDE 的电极尺寸为~100 μm，间距为~85 μm，并形成了一个大的嵌入网络，其中包含数百万个串联/并联的生物标志物。为了确保制造的 IDE 的成功，我们使用了不同的裸设备来确定介电系统下的再现性。该系统测量由偶极矩引起的介电极之间的分子振动（图 2c）。这种电介质 IDE 是一种广为接受的系统，已广泛用于不同的生物分子和化学分析 [15, 25,26,27,28]。本研究中所有的表面化学修饰和交互分析均采用I-V电流模式进行测量。

在 IDE 上检测 miRNA-335-5p 的表示。设计的探针和目标与IDE表面上的双链形成一起显示

IDE 上的表面测量。 一 测量步骤。 b 测量模式。显示了 IDE 模式和连接系统。还会显示介电测量值。 c 测量过程中的表面机制。显示了偶极矩。 d 制作的IDE的3D轮廓分析

高密度表面分子组装：链霉亲和素-生物素策略

传感表面或生物芯片上的高密度分子附着已被证明是至关重要的，并且高度依赖于表面功能化 [29, 30]。这项研究旨在确定大量分子调节所需的适当表面，这对于基因表达、发现和分子分析是必不可少的。对于这些潜在的应用，分析系统表面的生成需要分子的适当耦合以将它们固定在适当的形式。研究这些材料表面是为了研究表面相互作用机制，因为它们便宜并且提供不同程度的堆积密度、形态和厚度。这一发现将促进分子的正确附着并防止生物分子活性的丧失。此外，通过适当的二级结构确认，保留了生物分子固定的正确方向。

为了在表面实现高密度分子，我们最初用碱溶液彻底清洗二氧化硅表面，并通过 CDI 对其进行改性。为了在 CDI 表面捕获高水平的生物素化探针，我们用链霉亲和素固定探针。链霉亲和素是一种四价蛋白质，具有四个结合生物素的位点，被认为是生物科学中的高亲和力分子 [31, 32]。 IDE 表面的电流水平为 2.08E- 10 A，在 CDI 附着后，它增加到 9.2E- 06 A。这一发现清楚地表明经 CDI 修饰的 IDE 表面适合我们的分析。添加链霉亲和素后，电流水平进一步增加到 2.36E- 05 A。使用这种策略，我们在 IDE 表面固定了更多数量的由全长 miRNA-335-5p 设计的生物素化探针（图 3a）。在 IDE 表面的封闭步骤之后进行生物素相互作用以掩盖未反应的区域。通过每次表面修改，确定电流的变化（图 3b）。如图3c所示，加入乙醇胺后，电流变化为2.53E- 05 A，当加入1 nM生物素化捕获序列后，电流水平下降到1.29E- 08 A。这种变化在电流证实了捕获探针在 IDE 传感表面上的固定。通常，单链寡核苷酸在暴露的 5-碳酸磷酸骨架（探针）上带有更多的负电荷，而乙醇胺的净电荷是中性的，如供应商所述。这种巨大的电荷差异导致测量电流的明显变化，如图 3c 所示。此外，当与目标链形成双链体时，该参数再次恢复。这一发现是由于磷酸骨架暴露的减少，额外的正电荷来自miRNA链中的核碱基（图4a）。

一 miRNA-335-5p 的预测二级结构。全长 miRNA-335-5p 与茎和环区域一起显示。指示了交互式分析的选定目标区域。 b IDE 上表面化学和生物修饰的 I-V 测量值（黑圈，裸；红圈，CDI；深蓝圈，链霉亲和素；绿圈，乙醇胺）。图插图以图解方式显示。 c IDE 上探头附件的 I-V 测量。 （绿色圆圈，乙醇胺；深红色圆圈，探针）。 AAA并发症的图像如图插图所示

探针和目标的交互式分析。 一 探针和 miRNA-335-5p（目标）的高剂量相互作用。 （深红色圆圈，探头；黑色圆圈，目标）。 b miRNA-335-5p 的剂量依赖性分析。从较低的飞摩尔到较低的纳摩尔范围进行测试。 （深红色圆圈，探针；橙色圆圈，1 fM；蓝色圆圈，10 fM；绿色圆圈，100 fM；紫色圆圈，1 pM；粉红色圆圈，10 pM；浅蓝色圆圈，100 pM；黑色圆圈，1 nM）

IDE 上的剂量相关交互式分析

在将生物素化探针附着在传感表面后，以不同的剂量进行目标交互分析。该验证是从低飞摩尔到低纳摩尔范围进行的。为了确保这个范围，我们用 1 nM 的目标 miRNA-335-5p 序列进行了初步分析。在捕获探针修饰的表面上添加1 nM的目标miRNA-335-5p序列后，电流水平从1.29 E- 08 A变为1.29E- 07 A（图4a）；该结果表明捕获探针和目标序列之间发生了杂交。在确认之后，为了确定检测限，我们将目标序列从 1 fM 滴定到 1 nM，它独立地落在捕获探针修饰的表面上。在固定之前和之后检测到当前的变化。 1 fM、10 fM、100 fM、1 pM、10 pM、100 pM和1 nM杂交的电流差异分别为2.87、3.87、5.04、6.591、10 16、10 pM和1 nM的电流差异。基于获得的结果，在所有测试浓度的靶序列中都检测到明显的剂量依赖性电流变化（图4b）。

高分析性能：灵敏度、特异性和重现性

基于上述具有浓度依赖性增量的结果，进行线性回归分析。使用 3σ 计算估计检测的灵敏度，它下降到 1 fM（图 5a，b）。浓度小于 1 fM，显示了背景信号和较低的值。此外，还进行了特异性分析以将目标序列与非互补和单错配和三重错配序列区分开来。很明显，与其他序列相比，设计的探针与完美的 miRNA-335-5p 互补序列显示出更强的反应（图 6a）。由于探针序列上的单错配序列形成部分双链体，因此单错配序列导致比非互补和三重错配序列更高的电流响应。对 IDE 表面的所有化学和生物修饰进行了重复性分析，一式三份，并对数据取平均值。平均数据表明进行不同实验时没有显着变化（图 6b）。此外，为了支持 IDE 的性能，对当前可用方法的特性进行了比较（表 1）。

剂量依赖性。 一 miRNA-335-5p 与探针的剂量依赖性相互作用。 b 不同浓度 miRNA-335-5p 的线性回归分析。 LOD 被认为是分析物相对于背景信号的最低浓度 (S/N =3:1)

高性能分析。 一 特异性分析。靶序列与非互补序列和单错配和三重错配序列区分开来。 b 再现性测试。以一式三份实验显示平均值

结论

开发使用生物生物标志物的分析方法有助于在体检期间诊断 AAA。在目前的研究中，由于发现 miRNA-335-5p 与 AAA 一起表达，因此开发了用于预测 AAA 严重程度的 miRNA-335-5p 介导的检测。生成的 IDE 检测的输出显示从低到高的检测级别，以方便预测 AAA 的严重程度。较低的检测水平为 1 fM，对高性能分析具有高特异性和重现性。本研究中使用的四价链霉亲和素-生物素方法产生了良好的结果，可用于其他生物标志物分析。

数据和材料的可用性

所有数据完全可用，不受限制。

缩写

AAA：

腹主动脉瘤

CDI ：

1,1'-羰基二咪唑

PBS：

磷酸盐缓冲液

IDE：

叉指电极

紫外线：

紫外线