基于指叉电极的 miRNA-335-5p 高灵敏检测评估腹主动脉瘤严重程度

摘要

腹主动脉瘤 (AAA) 指腹主动脉下段动脉扩张，急需早期检测工具辅助诊断。本研究利用指叉电极 (IDE) 传感表面检测反映 AAA 形成的 miRNA-335-5p。通过 3D 轮廓仪观察二氧化硅材料均匀性，化学修饰的高导电表面经 I-V 模式提升检测性能。靶标 miRNA-335-5p 以剂量依赖方式被检出，基于线性回归和 3σ 分析，生物素化探针下检测灵敏度达 1 fM。通过区分靶序列与非互补、单错配和三错配序列展示了高特异性。这些结果证明了 miRNA-335-5p 高性能检测，具良好重现性，可用于 AAA 严重程度判定。

引言

腹主动脉瘤 (AAA) 是威胁生命的疾病，定义为腹主动脉直径 >3 cm 或大于正常值。该病常伴随动脉粥样硬化或斑块堆积，削弱腹主动脉血管壁导致向外膨胀，类似气球。随时间推移动脉壁扩张，类似于花园软管老化。血液泵经主动脉的压力导致薄弱区向外膨胀形成动脉瘤。当主动脉薄弱部分导致并发症时形成 AAA。小动脉瘤破裂可导致死亡。目前体检、CT 血管造影、MRI、超声用于诊断，但缺乏 AAA 专用检测方法，常在分析其他健康问题时偶然发现，导致识别延迟引发不必要健康问题。为解决此问题，需开发早期检测方法，构建传感系统是潜在策略。

早期、快速、灵敏的定量疾病检测是临床诊断关键目标。现有生物传感平台虽满足多种需求，但需专业实验室设置和培训，多不便携，难以满足即时检测 (POC) 理想要求。为辅助医生快速准确决策，分析生物标志物水平变化极具价值。在特定区域表达的循环生物标志物应进一步研究以诊断 AAA 并跟踪治疗进展。识别此类循环生物标志物有助于疾病诊断和治疗后患者随访。为满足这些需求，本研究拟开发适用于 AAA 的生物标志物传感器。本研究提出的指叉电极 (IDE) 传感器具有高性能分析潜力，适用于广泛生物标志物。它是一种介电极系统，具有交替间隙和指状结构，在介电测量下工作。

生物标志物可以是任何生物分子，包括 DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、脂质及其修饰形式。研究者提出不同生物标志物如非编码 RNA 在细胞系统表达但不翻译成蛋白。非编码 RNA 通常不翻译成蛋白，序列较短。报告了不同类非编码 RNA，如微 RNA (miRNA)、核糖体 RNA、转运 RNA、小核仁 RNA、小核 RNA、端粒酶 RNA、snRNA、Xist RNA、vault RNA、7SL RNA 等。miRNA 主要在基因表达的转录和转录后调控中发挥作用，常导致基因沉默。近年研究描述 miRNA 对 AAA 预测的重要性，报道 AAA 患者 miRNA-335-5p 表达降低。临床因素与微 RNA 表达结合显著提高疾病预测准确性。研究者特别关注 miRNA-335-5p，其在快速生长 AAA 个体中表现出显著最小范围。miRNA-335-5p 水平下降增强了对生长 AAA 检测的信心。即 miR-335-5p 的负向输出（高水平）指示 AAA 严重程度并减少繁琐筛选。Wanhainen 等人证实 miRNA 是筛选 AAA 和消除快速生长 AAA 风险的有用生物标志物。本研究展示基于 IDE 传感器的 miRNA-335-5p 检测应用，以判定受影响个体 AAA 严重程度。

材料与方法

试剂与生物分子

链霉亲和素、1,1'-羰基二咪唑 (CDI)、磷酸缓冲液 (PBS) 购自 Sigma-Aldrich（美国）。乙醇胺购自 Fisher Scientific（英国）。所有寡核苷酸由 Apical Scientific Sdn. Bhd.（马来西亚）商业合成。

铬掩膜版图设计

初始使用 AutoCAD 软件设计介电传感器图案。目标尺寸：长 7500 μm，宽 4100 μm，20 对指隙，间隙 85 μm，电极尺寸 100 μm，电极厚度 40 nm，指长 4000 μm。图案印在空白光掩膜上并粘贴在铬玻璃表面。铬玻璃固定在 UV 曝光系统下进行图案转移。沉积铝薄膜的二氧化硅基板与铬玻璃相对放置，UV 光曝光 10 秒。经显影工艺用显影液显影后转移图案。

指叉电极制备

表面电极通过常规微电子制造工艺生产：(i) 准备带天然氧化层的 4 英寸晶圆。(ii) 用缓冲氧化物刻蚀 (BOE) 和piranha 溶液清洗去除天然氧化层和无机污染物。(iii) 1000°C 湿法热氧化 1 小时生长 2800 Å 厚氧化层。(iv) 晶圆分四等份便于操作。(v) 沉积金属层作为导电层粘附层。热蒸发物理沉积法制备 3 cm 长、0.5 mm 直径的铝层 (40 nm)。(vi) 基板旋涂正性光刻胶。(vii) 90°C 软烘 60 秒。(viii) 晶圆与铬掩膜对齐，UV 曝光 10 秒。(ix) RD6 显影液冲洗 15 秒去除未曝光区，形成带氧化层的 IDE 图案。(x) 90°C 硬烘 120 秒。(xi) 用王水刻蚀去除两层暴露区域。(xii) 形成表面图案，丙酮洗去残余光刻胶。随后用 3D 纳米轮廓仪 (Hawk 3D-profilometry，美国) 分析观察电极间隙清晰图像。用 Keithley 6487 进行电流测量 (A)，线性扫描 0-2 V，步长 0.1 V（20 秒）。

表面化学功能化：四价链霉亲和素-生物素策略

表面化学功能化：二氧化硅表面先用 1 M 氢氧化钾 (pH 9.0) 彻底清洗激活。再用 CDI (0.5 M) 孵育 1 小时反应，随后加入 100 nM 链霉亲和素（1 小时），从原液用 10 mM 磷酸缓冲液 (PBS，pH 7.4) 稀释。未反应位点用 1 M 乙醇胺封闭 (1 小时)。然后四价链霉亲和素与 1 μM 生物素化探针 miRNA-335-5p 反应 (10 分钟)，室温下进行。每步修饰完成后除非特别说明均用 PBS 彻底清洗表面。

基于 miRNA-335-5p 设计探针与靶序列

从数据库获取全长 miRNA-335-5p (5'-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3')，登录号 MIMAT0000765。本研究目标区域为 5'-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3'。为捕获靶 miRNA-335-5p 区域，探针设计为 5'-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3'。3' 端标记生物素以与传感表面固定的链霉亲和素相互作用。全长 miRNA-335-5p 二级结构用在线 mfold 软件 (https://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold) 预测。

探针-靶相互作用：miRNA-335-5p 序列

生物素化探针按上述固定在链霉亲和素表面后，靶 miRNA-335-5p 序列在室温下孵育 10 分钟，浓度从低飞摩尔到低纳摩尔范围 (1 fM 至 1 nM，10 倍系列稀释于 PBS)。各浓度独立测试，从低到高，双链形成后用 5 倍体积 PBS 清洗，进行测量。

I-V 测量

电化学表征用 Keithley 6487 皮安计进行 I-V 测量，电压/电流供应。在上述电压下记录裸表面及各表面化学修饰后的测量值。同样，探针与靶 miRNA-335-5p 各浓度交互分析后，经 10 个反应体积清洗步骤进行测量。所有修饰、相互作用和测量均保持湿润条件，除非特别说明。

结果与讨论

IDE 传感器制备与表面分析

本研究用 miRNA-335-5p 作为工具，通过 IDE 传感器上的交互分析阐明 AAA 严重程度 (图 1)。为进行全长 miRNA-335-5p 设计的探针与靶标交互分析，采用常规光刻技术设计制造 IDE 表面。分步表面修饰并用电流计测量 (图 2b、c)。掩膜对齐设计用于 IDE 制造，均匀性经高分辨率 3D 纳米轮廓分析确认，制造及指间距离对齐良好 (图 2d)。IDE 电极尺寸 ~100 μm，间距 ~85 μm，形成数百万生物标志物串并联的大型交叉网络。为确保 IDE 制备成功，用不同裸器件在介电系统下测定重现性。该系统测量介电极间由偶极矩引起的分子振动 (图 2c)。介电 IDE 是广泛接受的系统，用于不同生物分子和化学分析。本研究所有表面化学修饰和交互分析均用 I-V 电流模式测量。

高密度表面分子组装：链霉亲和素-生物素策略

高密度分子在传感表面或生物芯片上的附着至关重要，高度依赖表面功能化。本研究旨在确定适合大量分子容纳的适当表面，这对基因表达、发现和分子分析是强制性的。为这些潜在应用，分析系统表面生成需要适当耦合分子以适当格式固定。研究这些材料表面以调查表面交互机制，因其廉价且提供多种堆积密度、形态和厚度。这将促进分子适当附着并防止生物分子活性丧失。此外，适当的二级结构确认保持生物分子固定的正确取向。

为实现表面高密度分子，最初用碱溶液彻底清洗二氧化硅表面并用 CDI 修饰。为在 CDI 表面捕获高水平生物素化探针，我们用链霉亲和素固定探针。链霉亲和素是四价蛋白，有四个结合生物素位点，被视为生物科学中高亲和力分子。IDE 表面电流水平 2.08E-10 A，CDI 修饰后增至 9.2E-06 A，明确表明 CDI 修饰的 IDE 表面适合分析。加入链霉亲和素后电流进一步增至 2.36E-05 A。利用此策略，将设计自全长 miRNA-335-5p 的更多生物素化探针固定在 IDE 表面 (图 3a)。生物素相互作用在 IDE 表面封闭步骤后进行，以掩蔽未反应区域。每次表面修饰后测定电流变化 (图 3b)。如图 3c 所示，加入乙醇胺后电流变化 2.53E-05 A，加入 1 nM 生物素化捕获序列后电流降至 1.29E-08 A。电流变化确认捕获探针固定在 IDE 传感表面。通常单链寡核苷酸带更多负电荷（暴露 5-碳酸磷酸骨架），而乙醇胺净电荷中性（供应商说明）。电荷巨大差异导致测量电流明显变化 (图 3c)。进一步靶链双链形成后该参数恢复，因磷酸骨架暴露减少，miRNA 链中核碱基额外正电荷所致 (图 4a)。

IDE 上剂量依赖交互分析

生物素化探针固定在传感表面后，进行不同剂量靶标交互分析。验证范围从低飞摩尔到低纳摩尔。为确保范围，先用 1 nM 靶 miRNA-335-5p 序列进行初步分析。捕获探针修饰表面加入 1 nM 靶序列后，电流从 1.29E-08 A 变为 1.29E-07 A (图 4a)，表明捕获探针与靶序列发生杂交。确认后，为确定检测限，将靶序列从 1 fM 滴定至 1 nM，独立滴加在捕获探针修饰表面。检测固定化前后电流变化。1 fM、10 fM、100 fM、1 pM、10 pM、100 pM、1 nM 杂交电流差分别为 2.87、3.87、5.04、6.88、8.59、11.21、11.61E-08 A。基于结果，所有测试浓度均检测到清晰剂量依赖电流变化 (图 4b)。

高分析性能：灵敏度、特异性与重现性

基于上述浓度依赖增量结果进行线性回归分析。用 3σ 计算估算检测灵敏度，达 1 fM (图 5a、b)。浓度低于 1 fM 显示背景信号和较低值。进一步进行特异性分析，区分靶序列与非互补、单错配、三错配序列。设计探针对完美互补 miRNA-335-5p 序列反应更强 (图 6a)。单错配序列因部分双链形成导致电流响应高于非互补和三错配序列。重现性分析在 IDE 表面对所有化学和生物修饰进行三次重复实验并取平均。平均数据显示不同实验无显著变化 (图 6b)。为支持 IDE 性能，对比现有方法特性 (表 1)。

结论

利用生物标志物开发分析方法有助于体检中诊断 AAA。本研究开发了基于 miRNA-335-5p 的检测预测 AAA 严重程度，因 miRNA-335-5p 在 AAA 中表达。生成的 IDE 检测输出显示从低到高检测水平，便于预测 AAA 严重程度。最低检测水平 1 fM，具高特异性和重现性，实现高性能分析。本研究使用的四价链霉亲和素-生物素方法产出良好，可用于其他生物标志物分析。

数据与材料可用性

所有数据无限制公开。

缩略语

AAA:

腹主动脉瘤

CDI:

1,1'-羰基二咪唑

PBS:

磷酸缓冲液

IDE:

指叉电极

UV:

紫外线