CoFe₂O₄量子点：通过PI3K/AKT通路调控诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的双重光热/光动力疗法

摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）已成为全球第二大常见恶性肿瘤。基于长期致力于开发纳米材料抗癌策略的研究兴趣，本研究构建了具有卓越协同光热/光动力特性的新型CoFe₂O₄量子点（QDs），在无明显毒性的情况下高效抑制NSCLC。研究证实，CoFe₂O₄-QDs联合近红外（NIR）照射可诱导NSCLC细胞凋亡；同时促进活性氧（ROS）生成，通过调控PI3K/AKT信号通路触发细胞死亡；体内实验显示该联合疗法成功消除肿瘤移植瘤且无显性毒副作用。综上，新型CoFe₂O₄-QDs展现出增强的协同光热疗法（PTT）和光动力疗法（PDT）抗NSCLC效果，是极具前景的NSCLC光敏剂。

引言

癌症是主要死因，给家庭和社会带来巨大负担，肺癌2020年发病率居第二、癌症相关死亡率居首。非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌85%，发病率和死亡率均高。尽管有手术选择，仍大力发展化疗、免疫疗法等。EGFR突变抑制剂、KRAS抑制剂疗效确切，新型ALK抑制剂研发中；抗PD-L1、抗CTLA-4免疫检查点抑制剂亦带来生存获益。但患者响应率差异大，副作用（特别是耐药性）不容忽视。因此，开发创伤小的新型治疗策略是NSCLC研究和临床的迫切需求。

纳米材料介导的PTT和PDT因创伤小、毒性低、不易耐药，成为抗癌新策略并可能成临床替代方案。在光（多为NIR）作用下，定位于肿瘤的纳米材料可升温并将氧转化为细胞毒性ROS，导致细胞死亡消除肿瘤。纳米材料是影响疗效和安全性的关键。现有纳米材料包括金属纳米结构、碳基材料、聚合物纳米颗粒、半导体化合物等，但各有局限：如碳基材料成本高、悬浮性差，限制大规模和临床应用。亟需开发更适用的纳米材料。

近年来，量子点（QDs）因生物相容性好、溶解性佳、光稳定性优、表面易修饰，在生物医学受关注。利用这些特性，多项研究将QDs作为新型PDT试剂，并可设计结合其他生物分子增强疗效。如Meng等报道双光子激发GQD@MnO₂提升PDT效率；Kuo等用氨基修饰氮掺杂QDs增强PDT。受此启发，本研究旨在开发结合非贵金属纳米材料的新型QDs，实现单一纳米系统中的PTT/PDT协同效应。钴基纳米材料是研究充分的非贵金属材料，常用作PTT剂。因此推测设计钴基QDs可带来增强的PTT/PDT协同效应。

本研究合成新型CoFe₂O₄-QDs，体内外实验证实其无毒性条件下展现增强的PTT/PDT协同杀灭NSCLC效果，可作为极具前景的NSCLC光敏剂。

材料与方法

CoFe₂O₄-QDs合成

采用水热法合成。典型过程：0.238 g CoCl₂·6H₂O和0.808 g Fe(NO₃)₃·9H₂O溶于10 mL水和10 mL丙二醇混合溶剂，搅拌10 min；滴加4 mL二氢蒽胺，继续搅拌30 min；转入50 mL不锈钢特氟龙内衬高压釜，160°C反应3 h；8500 rpm离心10 min收集，依次用去离子水和乙醇洗涤。试剂详见表1。

CoFe₂O₄-QDs表征

形貌尺寸用TEM和EDS测定；晶体结构用X射线衍射仪（Bruker，Cu Kα，λ=0.15406 nm）分析；吸收光谱用SHIMADZU UV-2600分光光度计；元素价态用XPS（VG ESCALAB 220I-XL）测定；热成像用红外热像仪（FLIR E50）。

细胞培养

NSCLC细胞系NCI-H460（H460）、A549和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自ATCC，支原体阴性。H460和A549用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养；HUVECs用内皮细胞生长培养基（Sigma #211-500）。均置于37°C、5% CO₂、避光湿润培养箱。

细胞毒性检测

不同浓度（0.1、0.5、1.0、2.0 mg/mL）CoFe₂O₄-QDs与HUVECs共培养24 h，换液加CCK-8试剂再孵育1 h，EnSpire多模式酶标仪测450 nm吸光度，对照组HUVECs活性设为100%。

凋亡分析

H460和A549细胞（2×10⁵/孔）6孔板过夜贴壁，用1.0 mg/mL CoFe₂O₄-QDs联合808 nm NIR激光照射5 min。洗涤后用Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒（BD #556547）按说明染色。HUVECs凋亡实验同法，不同浓度QDs孵育后检测。

细胞ROS检测

H460和A549过夜贴壁，有无1.0 mg/mL QDs孵育1 h后808 nm NIR照射5 min，加DCFH-DA孵育30 min，流式细胞仪（激发/发射485/535 nm）检测。ROS抑制实验按说明加NAC（Sigma A7250），FlowJo软件量化分析。

Western Blot分析

按凋亡实验处理细胞，RIPA裂解提取总蛋白，Western blot按文献[37]进行。抗体：抗Bcl-2（abcam ab59348）、抗Bax（abcam ab32503）、抗P-PI3K（Bio-Vision 3152-100）、抗P-AKT-S473（CST 4060S）、抗β-Actin（CST 4970S）、抗兔IgG-HRP（CST 7074S）。Image-J软件定量。

体内抗NSCLC效果研究

H460细胞混合50% MatriGel皮下接种NSG小鼠（N=8/组）。4-6周龄雄性M-NSG小鼠（上海模式生物 #NM-NSG-001）。肿瘤显现且体积达约5×5 mm时随机分四组：对照、仅NIR、仅CoFe₂O₄-QDs、CoFe₂O₄-QDs+NIR。后两组瘤内注射50 μL CoFe₂O₄-QDs（5.0 mg/kg，基于前期工作[37]），前两组注射等体积PBS。注射后NIR组和联合组接受808 nm激光（1 W/cm²）照射10 min，红外热成像监测。肿瘤体积每日记录，公式V=长×宽²/2。肿瘤直径近15 mm时处死小鼠，取瘤拍照保存。所有动物实验经北京大学深圳医院IACUC和动物福利委员会批准。

H&E与免疫组化染色

治疗后第1天取瘤（N=3），10%缓冲福尔马林固定、石蜡包埋，H&E染色及IHC检测。主要器官（肾、肝、肺、心、脾）取材做病理评估体内毒性。IHC用抗Ki67抗体（Abcam ab15580），Fiji软件量化阳性面积。

统计分析

“N”表示重复次数或小鼠数。Student's t检验或单因素ANOVA比较。P<0.05为显著差异，“ns”不显著。P<0.05、*P<0.01、**P<0.001分别标*，**、***。GraphPad Prism 5分析数据。

结果

新型CoFe₂O₄-QDs特性

水热法制备CoFe₂O₄-QDs，成本低、操作简便。TEM（图1a）显示均匀稳定，直径约3.4 nm（图1b）；深褐色悬浮液（图1b插图），水溶性极佳。HR-TEM（图1c）晶格间距0.242 nm对应(222)晶面，符合CoFe₂O₄晶体参数[38,39]。EDS元素谱（图1d）确认Co、Fe元素组成，原子比约1:2。数据证实成功构建CoFe₂O₄-QDs。

CoFe₂O₄-QDs物理性质检测

NIR吸收测试显示光热转化呈浓度依赖性，温升（ΔT）可调0.3-18.9°C（图2a）；1.0 mg/mL时增大NIR功率密度（0.5-2.0 W/cm²），ΔT可调0.8-24.3°C（图2b）。光热转化性能依赖浓度和照射功率。周期照射验证稳定性（图2c）。光热转化效率计算为7.18%（图2d），虽不高但足以协同增强PDT效果。最长吸收波长约808 nm（图2e,f）。综上，CoFe₂O₄-QDs可开发为有前景的PTT/PDT协同剂。

CoFe₂O₄-QDs对正常细胞细胞毒性评价

纳米材料作药物载体或治疗介质，须确认对正常细胞（特别是人血管内皮细胞）无毒。CCK-8检测不同浓度QDs共培养HUVECs后活性（图3a），无明显细胞毒性。同条件下凋亡实验（图3b）及定量（图3c）亦无显著差异。说明CoFe₂O₄-QDs对正常细胞无显性毒性，有潜力作为药物递送介质。

NIR联合CoFe₂O₄-QDs诱导NSCLC凋亡

体外实验：NIR（808 nm）照射联合QDs孵育后行凋亡检测，H460和A549均显示侵略性凋亡率（图4a,b）。定量差异显著，而单独QDs或NIR组无差异，证实联合疗法抗NSCLC效果。Bcl-2/Bax蛋白水平变化是判断线粒体介导凋亡的关键[40]。Western blot检测两细胞系处理后Bcl-2和Bax蛋白（图4c,d），Bcl-2/Bax比值下降，确证线粒体介导凋亡途径激活。因此，CoFe₂O₄-QDs联合NIR通过激活线粒体介导凋亡途径发挥抗NSCLC作用。

CoFe₂O₄-QDs联合NIR通过PI3K/AKT通路诱导ROS生成

线粒体功能障碍导致ROS上调引起NSCLC细胞死亡。ROS检测显示联合处理组ROS大量释放（图5a,b，补充图S1A,B），提示即使光热转化效率不高，CoFe₂O₄-QDs仍能诱导增强PDT效应。PI3K/AKT信号通路相关蛋白水平下调（图4c,d，补充图S1C,D），提示ROS变化受PI3K/AKT调控，进而影响Bcl-2/Bax表达。ROS抑制剂NAC可逆转现象（图5a,b），NAC处理后PI3K/AKT表达恢复（图5c,d），进一步证实ROS释放受PI3K/AKT通路调控。这些发现有力支持：CoFe₂O₄-QDs联合NIR通过诱导线粒体功能障碍（ROS）依赖性凋亡，实现协同PTT/PDT杀灭NSCLC细胞。

CoFe₂O₄-QDs联合NIR体内抗NSCLC评价

基于体外结果，建立NSCLC荷瘤小鼠模型评价体内疗效。瘤内注射QDs后NIR照射致肿瘤区温度快速升至约56°C（图6a,b，红外热成像监测）。病理染色显示联合组大面积坏死（图6c,d），提示肿瘤细胞死亡导致肿瘤消融。IHC显示Ki-67阳性区显著缩小（补充图S2A,B），表明处理后瘤组织不再增殖。12天随访显示，除联合组外其他组瘤体积和重量显著增长，联合组瘤移植瘤被完全消除（图6e,f）。观察期内主要器官病理未见明显不良反应（补充图S2C）。上述证据有力证明CoFe₂O₄-QDs可开发为新型NSCLC PT/PDT试剂。

讨论

近年来抗NSCLC策略研究取得巨大进展。精准医疗针对特定致癌基因成瘾型NSCLC和免疫检查点阻断疗法为临床带来希望。但鉴于肿瘤微环境复杂异质性及肿瘤抗原丢失风险，降低免疫逃逸导致的耐药率和短期复发仍是瓶颈。因此寻找新型治疗或介质迫在眉睫。纳米材料因尺寸小、生物相容性好、热传导能力强，被视为高效杀癌剂。

本研究开发新型CoFe₂O₄-QDs，作为NSCLC治疗介质，通过协同PTT/PDT诱导肿瘤细胞凋亡。与其他纳米材料一样，CoFe₂O₄-QDs展现优异生物相容性，对正常细胞和主要器官无显性毒性。虽光热转化率不如其他纳米材料高，但在NIR激活下足以诱导癌细胞凋亡。CoFe₂O₄-QDs光吸收呈良好线性关系，联合NIR可产生ROS，进一步证明其作为优势光敏剂的潜力。后续可优化结构或引入热敏元素提高光热转化率，增强协同效应[44,45]；也可表面修饰化学药物或抗体（如抗PD-L1、抗CTLA-4），打破肿瘤免疫抑制微环境，实现更优联合疗法，这是下一步研究方向。

本研究还阐明了CoFe₂O₄-QDs杀灭NSCLC机制。证实其在NIR激活下主要通过ROS分泌诱导NSCLC凋亡，实现协同PTT/PDT。过量ROS导致氧化应激、DNA损伤，激活下游信号通路致癌细胞死亡[46,47]。越来越多证据显示PI3K/AKT通路可被细胞ROS调控导致线粒体功能障碍[48,49]。公认机制：AKT被PI3K磷酸化后失活促凋亡蛋白Bax、保护细胞免于凋亡；磷酸化AKT还能稳定MDM2/p53复合物调控细胞存活[50]。本研究探讨该通路在CoFe₂O₄-QDs诱导ROS中的作用。结果显示，过量ROS显著下调PI3K/AKT通路表达，从而激活Bax、失活Bcl-2诱导肿瘤细胞凋亡。ROS抑制剂逆转PI3K/AKT表达并降低ROS产生，进一步确证。由于PI3K/AKT通路调控癌细胞生死，理解该机制有助于开发更多联合疗法选择。

总之，为开发新型光敏剂用于替代性肿瘤杀灭疗法，本研究以低成本、简便的水热法成功构建CoFe₂O₄-QDs。其具有宽NIR吸收、良好生物相容性和光热转化能力。与前人报道QDs相比，CoFe₂O₄-QDs展现协同PTT/PDT杀灭NSCLC肿瘤效果，代表未来NSCLC光疗的多功能前景药物。此外，NIR照射下CoFe₂O₄-QDs主要通过调控上游PI3K/AKT信号通路诱导ROS生成、进而调节Bcl-2/Bax表达杀灭NSCLC。体内实验证实联合疗法可完全消除NSCLC移植瘤且无明显毒性。这些发现证明CoFe₂O₄-QDs具有开发作为新型NSCLC杀灭试剂的广阔应用前景。

结论

综上所述，本研究合成的CoFe₂O₄-QDs通过调控PI3K/AKT通路诱导ROS生成，展现出优异的PTT/PDT协同效应抑制NSCLC，为新型光敏剂建立的机制研究和应用提供了启示。