CoFe2O4-量子点通过调节 PI3K/AKT 通路触发细胞凋亡，用于非小细胞肺癌的协同光热/光动力治疗

介绍

癌症是导致死亡的首要原因，给家庭和社会带来巨大负担，其中肺癌在2020年位居癌症诊断第二位、癌症相关死亡首位[1, 2]。据报道，非小细胞肺癌 (NSCLC) 约占所有肺癌的 85%，具有高发病率和死亡率 [3, 4] 的特点。最近，尽管有手术选择，但已经付出了巨大努力来开发化学疗法或免疫疗法来治疗非小细胞肺癌。例如，EGFR 突变抑制剂和 KRAS 抑制剂已被证明是有效的，并且还有更多新型 ALK 抑制剂正在开发中 [5,6,7,8,9]。抗 PDL1 和抗 CLTA4 等免疫检查点抑制剂也带来了有希望的疗效和延长生存期的益处 [10,11,12]。然而，对这些药物的反应率因患者而异，并且不应忽视副作用，尤其是耐药性 [13, 14]。因此，开发微创的新型治疗策略是NSCLC研究和临床治疗的迫切需要。

基于最近的进展，利用纳米材料进行光热疗法（PTT）和光动力疗法（PDT）作为一种抗癌策略引起了极大的关注并取得了长足的发展，可能成为临床治疗的替代选择 [15,16,17, 18]。基于纳米材料的 PTT 和 PDT 具有侵袭性小、毒性低的特点，几乎没有机会诱发耐药性 [19,20,21,22,23]。在光（主要是 NIR）的协作下，局部纳米材料可以提高肿瘤内的温度，并将氧气转化为具有细胞毒性的活性氧 (ROS)，从而导致细胞死亡以消除肿瘤 [24]。在此背景下，纳米材料在影响疗效和保证安全性方面发挥着关键作用。尽管此类纳米材料包括金属纳米结构 [25]、碳基材料 [26, 27]、聚合物纳米粒子 (PNP) [28] 或半导体化合物 [29]，但它们有其自身的局限性。例如，碳基材料价格昂贵且悬浮性能不理想，限制了其大规模应用和临床潜力。因此，应该进行更多的尝试以产生更合适的纳米材料以供进一步使用。

近年来，量子点（QDs）作为新型纳米材料，由于其良好的生物相容性、溶解性以及最重要的是其优异的光稳定性和易于表面功能化的特性，在生物医学应用中受到了极大的关注 [30,31,32, 33]。利用这些特性，一些报道已经使用 QD 作为新型 PDT 试剂，并且可以设计为与其他生物分子结合以提高 PDT 在癌症治疗中的功效。例如，Meng 及其同事报道了一种由双光激发诱导的多功能 GQD@MnO2，以提高 PDT 功效 [34]。此外，Kuo 及其同事通过用氨基分子对其进行功能化来生成掺氮 QD，这也提高了 PDT 效率 [35]。受这些有趣发现的启发，我们寻求开发与非贵金属基纳米材料相结合的新型量子点，这可能会在一个纳米系统中带来 PTT 和 PDT 协同效应。例如，钴基纳米材料是一种经过充分研究的非贵金属基纳米材料，它以用作肿瘤治​​疗或成像的 PTT 剂而闻名 [36]。因此，我们建议设计Co基量子点可能会带来增强的PTT/PDT协同效应。

在本研究中，我们合成了新型纳米材料CoFe2O4-QDs，其在体外和体内表现出增强的PTT和PDT协同杀伤NSCLC的作用，且无毒副作用，有望成为治疗NSCLC的光敏剂。

材料和方法

CoFe2O4-QDs 的合成

CoFe2O4-QDs 是通过水热法合成的。通常，将 0.238 g CoCl2·6H2O 和 0.808 g Fe(NO3)3·9H2O 溶解在 10 mL H2O 和 10 mL 丙二醇混合溶剂中，然后搅拌 10 分钟。然后将4mL二蒽酚胺逐滴加入溶液中，然后搅拌30分钟。然后将获得的浆液转化为 50 mL 不锈钢内衬聚四氟乙烯的高压釜。高压釜在烘箱中在 160°C 下保持 3 小时。通过在 8500 rpm 下离心 10 分钟收集 CoFe2O4-QD，然后依次用去离子水和乙醇冲洗。本研究所用试剂及材料见表1。

CoFe2O4-QD 的表征

制备的 CoFe2O4-QDs 的形貌和尺寸通过 TEM 和 EDS 系统确定。晶体结构通过配备 Cu Ka 辐射 (k =0.15406 纳米）。 CoFe2O4-QDs的吸收光谱由岛津UV-2600分光光度计检测。 CoFe2O4-QD 的元素价态通过 X 射线光发射光谱测量（XPS，VG ESCALAB 220I-XL，美国）确定。红外热像仪（FLIR E50，美国）记录热像。

细胞培养

NSCLC 细胞系 NCI-H460 (H460) 和 A549 以及人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 从 ATCC 获得并检测微血浆阴性。 H460 和 A549 细胞在补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素-链霉素 (Gibco) 的 RPMI-1640 中培养。 HUVEC 在内皮细胞生长培养基（Sigma，#211-500）中培养。所有细胞均置于37 ℃、5% CO2的暗湿培养箱中。

细胞毒性检测

添加各种工作浓度（0.1、0.5、1.0、2.0 mg/mL）的 CoFe2O4-QDs，并与 HUVECs 一起培养 24 小时。孵育后，更换培养基，每孔加入CCK-8试剂，孵育1小时。然后，使用 EnSpire™ 多模式读板机在 450 nm 处测量板。对照HUVECs细胞存活率取100%。

细胞凋亡分析

H460 和 A549 细胞（2 × 10 ⁵ ) 在 6 孔板中培养过夜，然后用 1.0 mg/mL CoFe2O4-QD 结合 808 nm 的 NIR 激光处理 5 分钟。然后按照制造商的说明，用 Annexin-V/PI 细胞凋亡试剂盒（BD；#556547）洗涤和染色细胞。至于 HUVECs 凋亡试验，HUVECs 与不同浓度的 CoFe2O4-QDs 一起孵育。如上所述测定细胞凋亡率。

细胞活性氧检测

H460 和 A549 细胞在 6 孔板中培养过夜。细胞在有或没有 1.0 mg/mL 的情况下孵育 1 小时，并用 808 nm 的 NIR 激光处理 5 分钟。处理后，加入 DCFH-DA 并孵育 30 分钟，然后进行 FACS 检测，激发/发射波长为 485 nm/535 nm。至于 ROS 抑制试验，根据制造商的说明添加 ROS 抑制剂 NAC（Sigma；A7250）。使用Flow-jo软件进一步量化数据。

Western Blot 分析

H460和A549细胞进行凋亡检测，用RIPA裂解缓冲液提取全细胞蛋白。如前所述进行蛋白质印迹检测[37]。本研究中使用的抗体如下：兔多克隆抗 Bcl-2（abcam；ab59348）、兔单克隆抗 Bax（abcam；ab32503）、兔多克隆抗 P -PI3K（Bio-Vision；3152-100），兔单克隆抗P -AKT-S473（CST；4060S），兔单克隆抗 β-肌动蛋白（CST；4970S），抗兔 IgG HRP 连接抗体（CST；7074S）。使用Image-J软件进行定量。

CoFe2O4 和 NIR 联合治疗的抗非小细胞肺癌作用的体内研究

为了确定 CoFe2O4-QDs 的肿瘤杀伤能力，将 H460 细胞与 50% MatriGel 皮下植入 NSG 小鼠（N =8 每组）。 4-6 周龄雄性 M-NSG 小鼠均来自上海模型生物 (#NM-NSG-001)，用于所有体内实验。当肿瘤可见且体积接近5mm × 5mm时，将所有小鼠随机分为四组，分别命名为Control、NIR only、CoFe2O4-QDs only和CoFe2O4-QDs + NIR组。然后，基于我们之前的工作 [37]，仅在 CoFe2O4-QDs 和 CoFe2O4-QDs + NIR 组中的小鼠瘤内注射 50 μL CoFe2O4 (5.0 mg/kg)，而对照组和 NIR 组注射了 50 μL PBS。注射后，NIR 808 nm 激光 (1 W/cm ² ) 在 NIR 和 CoFe2O4-QDs + NIR 组中进行 10 分钟，由红外热成像设备监测。每天记录肿瘤体积并用公式 V 计算 =长度 × 宽度 ² /2。一旦剩余小鼠中肿瘤异种移植物的直径达到近 15mm，处死小鼠并对肿瘤异种移植物拍照并储存以用于进一步检测。所有动物实验和方案均经北京大学深圳医院动物护理和使用机构委员会（IACUC）和动物福利委员会批准。

H&E 和免疫组织病理学染色分析

对于病理学评估，肿瘤异种移植物 (N =3) 在每组治疗后一天收获，然后固定在 10% 缓冲福尔马林中，然后嵌入石蜡进行 H&E 染色和 IHC 检测。对于体内毒性评价，提取并固定小鼠的肾、肝、肺、心脏和脾脏用于病理学评价。对于 IHC 染色，使用了抗 Ki67 抗体（Abcam；ab15580）。 IHC阳性面积的定量由Fiji软件进行。

统计分析

对于所有实验，“N ”代表重复次数或使用的小鼠数量，如图图例所示。学生的t 检验或单向方差分析用于统计比较。 P <0.05 被认为具有统计显着性，而“ns”表示不显着。 P <0.05, P <0.01 和 P <0.001 分别用“*”、“**”和“***”星号表示。使用GraphPad Prism 5进行数据分析。

结果

新型 CoFe2O4-QD 的特性

首先，我们使用低成本且易于执行的水热方法构建了 CoFe2O4-QD。 CoFe2O4-QD 的 TEM 图像如图 1a 所示，呈现出直径约为 3.4 nm 的均匀且稳定的图案（图 1b）。所制备的 CoFe2O4-QD 呈深棕色（图 1b）并且在水中具有极好的溶解性。此外，高分辨率 TEM 图像（图 1c）显示（222）的晶格间距约为 0.242 nm，这与 CoFe2O4-QD 的晶体参数一致 [38, 39]。此外，元素光谱（图 1d）进一步证实了 CoFe2O4-QDs 的元素成分为 Co 和 Fe，Co 和 Fe 的原子比约为 1:2。这些数据表明成功构建了CoFe2O4-QDs，为我们的进一步研究奠定了基础。

CoFe2O4-QD 的制备和表征。 一 所制备的 CoFe2O4-QD 的代表性 TEM 图像。比例尺，20 纳米。 b 平均直径为 3.4 nm 的 CoFe2O4-QD 尺寸的全局分析。插图是 CoFe2O4-QDs 悬浮液的代表性数码照片。 c 所制备的纳米晶体的晶格条纹对应于 CoFe2O4-QDs HRTEM 图像。比例尺，2 纳米。 d 所制备的CoFe2O4-QDs表现出均匀分布的Co、Fe和O。显示了代表性元素图

CoFe2O4-QDs 的物理性质检测

为了确定制备的 CoFe2O4-QDs 的物理性质，我们在构建后进行了多次检测。通过 NIR 吸光度测定测试，CoFe2O4-QDs 以浓度依赖的方式和温度增量 (ΔT ) 可以在 0.3 到 18.9°C 之间调整（图 2a）。此外，在浓度为 1.0 毫克/毫升的 CoFe2O4-QD 时，通过将 NIR 辐射功率从 0.5 增加到 2.0 W/cm ² ，ΔT 可以在 0.8 到 24.3°C 之间调整（图 2b）。这些数据表明 CoFe2O4-QDs 的光热转换性能取决于其浓度和照射功率。此外，CoFe2O4-QD 触发光热转换的稳定性是通过周期照射确定的（图 2c）。虽然计算出的光热转换效率为 7.18%（图 2d），但足以增强 CoFe2O4-QDs 的 PDT 效果。此外，CoFe2O4-QD 可以吸收光的最长波长约为 808 nm（图 2e、f）。综上所述，这些数据表明CoFe2O4-QDs可以发展成为一种有前景的PTT/PDT协同剂，用于替代肿瘤杀伤治疗。

CoFe2O4-QDs 的性能评估。 一 在不同浓度下测定 CoFe2O4-QDs 的光热转化率。显示了加热曲线。 b CoFe2O4-QDs 的辐照能量依赖方式显示在不同的功率密度 (0.5–2.0 W/cm ² ）。 c CoFe2O4-QD 具有稳定的光热转换，可通过 4 个加热-冷却连续照射循环 (1.0 W/cm ² ）。 d CoFe2O4-QDs 光热转换效率。 e , f CoFe2O4-QDs的波长与吸光度的关系

CoFe2O4-QDs 对正常细胞的细胞毒性评估

由于纳米颗粒被广泛用作肿瘤治​​疗的药物递送或介质，因此应确认 CoFe2O4-QDs 对正常细胞，尤其是人类血管上皮细胞的细胞毒性，以供进一步使用。因此，根据之前的结果，我们测试了不同浓度（0.1、0.5、1.0 和 2.0 mg/mL）的 CoFe2O4-QD。与HUVECs（正常人上皮细胞系）共培养后，加入CCK-8试剂检测细胞活力。与对照组相比，没有观察到明显的细胞毒性（图 3a）。在这种情况下，在相同条件下进行了进一步的细胞凋亡测定以获得一致的结果（图 3b）。细胞凋亡率的量化表明与对照组相比没有显着差异（图 3c）。这些数据表明CoFe2O4-QDs对正常细胞没有明显的毒性作用，表明CoFe2O4-QDs具有作为药物传递介质的潜力。

CoFe2O4-QDs 对正常细胞的细胞毒性的体外评估。 一 在不同浓度的 CoFe2O4-QD 下进行 HUVEC 中的 CCK-8 细胞活力测定。对照组的存活率取为100%。数据显示为平均值 ± SD，N =3.b 通过FACS检测确定HUVECs凋亡。显示了指定浓度的代表性图像，N =3.c 细胞凋亡率的量化。与对照组相比，它们显示出不显着性。数据显示为平均值 ± SD

NIR 和 CoFe2O4-QD 的组合诱导 NSCLC 细胞凋亡

为了确定 CoFe2O4-QD 的潜在 NSCLC 癌症杀伤能力，进行了 NIR 激光（808 nm）照射并在体外孵育 CoFe2O4-QD。然后，在处理后进行细胞凋亡测定，H460 和 A549 细胞均显示出与 CoFe2O4-QD 和 NIR 激光组合的侵袭性细胞凋亡率（图 4a，b）。定量显示与对照组相比有显着差异，而仅 CoFe2O4-QDs 或仅 NIR 组没有显示差异，这表明 CoFe2O4-QDs 加 NIR 可以诱导抗 NSCLC 作用（图 4a、b）。众所周知，Bcl-2/Bax 蛋白水平的改变对于确定细胞是否会发生凋亡很重要[40]。与该想法一致，在处理后在 H460 和 A549 细胞中测定 Bcl-2 和 Bax 的蛋白质水平（图 4c、d）。值得一提的是，数据还显示 Bcl-2/Bax 的比率降低，这被认为是线粒体介导的细胞凋亡的标志物。因此，我们提出CoFe2O4-QDs加NIR通过激活线粒体介导的细胞凋亡途径产生抗NSCLC作用。

CoFe2O4-QDs 和 NIR 的体外组合诱导 NSCLC 细胞凋亡。 一 , b H460 和 A549 NSCLC 用 CoFe2O4-QD 和 NIR 激光的组合治疗 5 分钟。通过Annexin-V染色评估凋亡细胞并通过FACS检测。也分别显示了量化。数据显示为平均值 ± SD，N =3.**P <0.01 对比对照、NIR、CoFe2O4 组。 c , d 治疗后NCI-H460和A549 NSCLC中Bcl-2和Bax的蛋白质水平通过蛋白质印迹分析确定。显示了代表性图像。在校准到内部对照 β-肌动蛋白的表达后显示量化。数据显示为平均值 ± SD，N =3.*P <0.05 vs Control, NIR, CoFe2O4 group

CoFe2O4-QD 和 NIR 的组合通过 PI3K/AKT 途径诱导 ROS 生成

线粒体功能障碍总是导致 ROS 生成水平上调，从而导致 NSCLC 中的细胞死亡。在这种情况下，我们在 H460 和 A549 细胞中进行了 CoFe2O4-QD 加上 NIR 处理后的 ROS 检测。结果表明，组合组中 ROS 的大量释放，这表明 CoFe2O4-QDs 可以诱导增强的 PDT 效应，即使光热传输效率较低（附加文件 1：图 S1A，B）。此外，PI3K/AKT信号通路相关蛋白水平也降低，说明ROS的改变受PI3K/AKT通路调控，导致Bcl-2/Bax蛋白表达水平发生改变（图4c， d，附加文件 1：图 S1C，D）。为了证实这一想法，添加了 ROS 抑制剂 NAC 以扭转这种现象（图 5a、b）。然后，确定 PI3K/AKT 的表达在 NAC 处理后被挽救，这进一步证实了 CoFe2O4-QDs 加 NIR 处理后 ROS 的释放受 PI3K/AKT 途径的调节（图 5c，d）。这些发现有力地支持了CoFe2O4-QDs和NIR的组合可以通过诱导线粒体功能障碍（ROS）依赖性细胞凋亡导致协同PTT和PDT杀死NSCLC细胞的作用的观点。

CoFe2O4-QDs 和 NIR 的组合通过调节 PI3K/AKT 途径诱导 ROS 的产生。 一 , b NCI-H460 和 A549 NSCLC 用 CoFe2O4-QD 和 NIR 激光在有或没有 NAC 的情况下治疗 5 分钟。通过 FACS 检测 ROS 水平并分别量化平均荧光强度。数据显示为平均值 ± SD，N =3.**P <0.01。 c , d P的蛋白质水平 -PI3K 和 P -AKT 通过蛋白质印迹分析确定。显示了代表性图像，N =3

CoFe2O4-QDs和NIR组合的体内抗NSCLC评估

基于体外结果，我们接下来研究了 CoFe2O4-QDs 和 NIR 联合治疗对 NSCLC 荷瘤小鼠模型的抗 NSCLC 效果。 M-NSG 小鼠皮下植入 H460 细胞。在肿瘤内注射 CoFe2O4-QD 后，在热检测设备的监测下，近红外激光照射导致温度迅速升高至 56°C 左右（图 6a、b）。此外，组织病理学染色显示在组合组中观察到广泛的坏死区域，表明 CoFe2O4-QDs 加上 NIR 治疗导致肿瘤细胞死亡，这是肿瘤消除的结果（图 6c、d）。进一步的 IHC 染色还显示，与其他组相比，联合治疗后 Ki-67 阳性区域显着缩小，表明处理过的肿瘤异种移植物不再增殖（附加文件 2：图 S2A、B）。接下来，我们在 CoFe2O4-QD 和 NIR 处理后随访了 12 天。正如我们预期的那样，其他组中肿瘤异种移植物的大小和重量显着增长，但在 CoFe2O4-QDs 和 NIR 治疗组中没有（图 6e，f），支持 CoFe2O4-QDs 和 NIR 联合治疗可以完全消除体内肿瘤异种移植物。至于CoFe2O4-QDs的细胞毒作用，至少在我们的观察期内，从小鼠重要器官的组织病理学分析结果中没有发现明显的不良反应（附加文件2：图S2C）。上述数据有力地证明了CoFe2O4-QDs可以开发为一种新型的用于NSCLC治疗的PTT/PDT试剂。

CoFe2O4-QDs 和 NIR 治疗组合的体内肿瘤杀伤评估。 一 显示了带有 NCI-H460 肿瘤异种移植物的 M-NSG 小鼠的代表性红外热图像。 b 温度曲线显示在 NIR 照射下肿瘤异种移植物内的温度升高。 c 治疗后 1 天对每组的 H&E 病理染色进行拍照。联合组可见明显坏死。显示了代表性图像，N =3.d 处死小鼠后各组移植瘤照片，N =5.e , f 记录各组肿瘤异种移植物的生长曲线和重量。数据显示为平均值 ± SD，N =5.***P <0.001

讨论

近年来，开发抗NSCLC策略的研究取得了巨大进展。针对特定突变癌基因成瘾性非小细胞肺癌的精准医学和免疫检查点阻断疗法都为临床治疗带来了广阔的前景 [41, 42]。然而，考虑到肿瘤微环境的复杂性和异质性以及丢失肿瘤抗原的潜在风险，免疫逃避状态后降低耐药率仍然是一个瓶颈，导致肿瘤在短时间内复发。因此，寻求NSCLC治疗的新疗法或中间体迫在眉睫。在新兴的方法中，纳米材料已被重视并列为有效的癌症杀灭剂。近年来，一些纳米材料凭借其体积小、生物相容性好、传热能力强等优点，发挥了优异的抗癌能力[43]。

在我们的研究中，我们开发了一种新型 CoFe2O4-QD，可通过协同 PTT 和 PDT 效应诱导肿瘤细胞凋亡，用作非小细胞肺癌治疗的中间体。与其他纳米材料一样，CoFe2O4-QDs 在我们的研究中表现出优异的生物相容性，对正常细胞和主要器官没有明显的毒性。虽然我们发现传热率不如其他纳米材料高，但 CoFe2O4-QDs 足以在 NIR 激光激活下诱导癌细胞凋亡。 CoFe2O4-QDs 在本研究中与光吸收率显示出良好的线性关系，并可能与 NIR 激光组合产生 ROS，进一步证明 CoFe2O4-QDs 可以作为有利的光敏剂。我们接下来可以进一步优化结构或将热敏元素添加到 CoFe2O4-QD 中，这样可以达到更高的热传输率，以获得更好的协同 PTT 和 PDT 效果 [44, 45]。此外，在 CoFe2O4-QDs 表面应用化学药物或抗体也是可行的，这可能会带来更高的杀伤效率。例如，将抗 PDL1 或抗 CTLA4 抗体与 CoFe2O4-QDs 联系起来的方法可能是打破肿瘤内免疫抑制微环境的一种有前景的组合疗法，这是我们下一个兴趣充分利用 CoFe2O4-QDs。

此外，本研究还阐明了 CoFe2O4-QDs 杀死 NSCLC 的机制。我们证实，在 NIR 激光激活协同 PDT 和 PTT 效应后，CoFe2O4-QDs 主要通过 ROS 分泌诱导 NSCLC 细胞凋亡。过量的ROS产生引起肿瘤细胞氧化应激，直接引起DNA损伤，进而激活下游信号通路，进而诱导肿瘤细胞死亡[46, 47]。其中，越来越多的证据表明 PI3K/AKT 通路可能受细胞 ROS 调节并导致线粒体功能障碍 [48, 49]。众所周知，AKT 在激活后会被 PI3K 磷酸化，从而使促凋亡蛋白 Bax 失活并保护细胞免于凋亡。此外，磷酸化的 AKT 还能够稳定 MDM2/p53 复合物，从而调节细胞存活 [50]。在这种情况下，研究了这种途径在 CoFe2O4-QDs 诱导的 ROS 分泌中的作用。正如预期的那样，我们发现 CoFe2O4-QDs 引起的过量 ROS 显着下调 PI3K/AKT 通路的表达，因此通过激活 Bax 而灭活 Bcl-2 蛋白导致肿瘤细胞凋亡。通过添加 ROS 抑制剂进一步证实了这一发现，该抑制剂逆转了 PI3K/AKT 表达并减少了 ROS 的产生。由于已知 PI3K/AKT 通路调节细胞的存活和死亡，尤其是在癌细胞中，了解 CoFe2O4-QDs 杀死 NSCLC 的机制将有助于我们开发更多的联合疗法选择。

总之，为了开发用于替代肿瘤杀伤疗法的新型光敏剂，我们在本研究中通过使用水热方法以低成本和简单的方式成功构建了 CoFe2O4-QD。 CoFe2O4-QDs具有广泛的近红外吸收、良好的生物相容性和光热转换能力。此外，与之前报道的 QD 相比，CoFe2O4-QD 在杀死 NSCLC 肿瘤方面表现出协同的 PTT/PDT 作用，这代表了在 NSCLC 的进一步光疗中具有前景的多功能药物。此外，在 NIR 照射下，CoFe2O4-QDs 主要通过通过上游 PI3K/AKT 信号通路调节 Bcl-2/Bax 表达诱导 ROS 产生来杀死 NSCLC。在体内肿瘤杀伤能力方面，CoFe2O4-QDs联合NIR可以完全消除NSCLC肿瘤异种移植物，无明显毒性作用。这些发现证明CoFe2O4-QDs作为一种新型NSCLC杀伤剂具有广阔的应用前景。

结论

总之，我们合成的CoFe2O4-QDs通过调节PI3K/AKT通路诱导ROS产生，在抑制NSCLC中表现出优异的PTT/PDT协同作用，为新型光敏剂的机制研究和应用提供了启示。

数据和材料的可用性

支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。