靶向近红外响应PNIPAM-吡咯纳米复合物实现协同化学-光热乳腺癌治疗

摘要

基于多功能纳米复合物的联合疗法被认为是提高癌症治疗效果的有前景途径。本文报道靶向多功能聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM）基纳米复合物，用于乳腺癌细胞的协同化疗-光热治疗。合成PNIPAM时引入丙烯酸（AAc）提高相变温度，使固有低临界溶液温度（LCST）变为42 °C。为在近红外（NIR）激光照射（808 nm）下产生光热效应，聚吡咯（ppy）纳米颗粒均匀装饰在PNIPAM-AAc上。叶酸（FA）作为癌症靶向配体，成功共价连接在PNIPAM网络多余羧基上。PNIPAM-ppy-FA纳米复合物药物释放可由NIR激光照射引起的温度变化高效触发。证实PNIPAM-ppy-FA通过叶酸受体介导的内吞作用被MDA-MB-231乳腺癌细胞内化，化疗-光热联合治疗显著增强抗癌疗效。因此，该工作为探索多功能纳米载体用于不同癌症类型的协同治疗提供了动力。

引言

药物递送系统（DDS）是实现癌症治疗药效的有力方法。虽然DDS旨在将活性药物递送并富集于目标区域，但传统DDS常伴随严重副作用和治疗效率低下。为克服这些障碍，开发了多种能响应温度、光、pH、电场、氧化还原、酶活性、抗原浓度等特定内/外刺激的纳米载体，用于先进DDS实现持续可控药物释放。热响应纳米载体是改善癌症治疗的有力途径，因药物可在特定温度从纳米颗粒释放。热敏纳米颗粒优势可与其他刺激结合诱导彻底根除癌症。聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM）作为热响应纳米颗粒最受关注，因其在约32 °C呈现相变（低临界溶液温度LCST）。低于LCST时，PNIPAM聚合物网络因氢键处于膨胀态；高于LCST时转为疏水态，氢键减少，聚合物网络坍塌。相比其他纳米颗粒，PNIPAM基纳米载体具有高药物包封效率、可控药物释放能力、良好生物相容性。但因体温下自发释放药物，PNIPAM基纳米载体不足以用于先进DDS。前人研究在PNIPAM合成中添加有机酸（如乙烯基乙酸、丙烯酸、烯丙基乙酸），通过连续药物释放减少副作用。近年研究聚焦整合两种或以上刺激响应纳米颗粒以增强癌症治疗效果。例如光热治疗（PTT）具有精确光控肿瘤、无创穿透、低毒性等优势。将光热剂（金纳米棒、碳纳米管、聚吡咯ppy、氧化石墨烯等）均匀封装进PNIPAM基纳米颗粒可结合PTT。前人制备中空二氧化硅包覆金纳米棒并包覆热/pH响应PNIPAM壳层，探索体内癌症治疗。但这些PNIPAM纳米复合物需多步合成，且缺乏针对特定癌细胞的靶向基团，可能导致严重副作用。前期工作开发利用PNIPAM热/pH敏感性的双向可控释放系统。PNIPAM纳米凝胶与丙烯酸（AAc）共聚合高效控制LCST。为增强癌症靶向和治疗效果，开发基于化疗-光热效应的靶向联合治疗（方案1）。NIR激光照射升温触发热响应PNIPAM纳米复合物释放药物并激活光热效应。因共价连接叶酸（FA），PNIPAM基纳米复合物对MDA-MB-231乳腺癌细胞显示显著增强的治疗效果。

材料与方法

材料

NIPAM、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、过硫酸钾（KPS, 99%）、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（Sigma-Aldrich）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、吡咯（98%）（Alfa Aesar）；AAc（Dae Jung Chemicals & Materials, Korea）；FA-PEG-胺（FA-PEG-NH₂, MW: 5 kDa，Nanocs, Inc.）；盐酸多柔比星（Dox，Tokyo Chemical Industry）。所有化学品材料商购直接使用无需纯化。

ppy装饰PNIPAM-AAc纳米颗粒合成

热响应PNIPAM-AAc纳米颗粒采用自由基聚合法合成（参考文献[15]）。1.13 g NIPAM单体、0.077 g MBA、0.136 g AAc溶于100 mL去离子水，置于250 mL三口圆底烧瓶。30 min后升温至80 °C剧烈搅拌1 h。加入KPS（1.5 mg）引发聚合，搅拌4 h。对透析膜（MWCO 12–14 kDa）在去离子水中透析7天除去未反应单体、引发剂、可溶离子，冻干48 h得PNIPAM-AAc纳米颗粒。为赋予光热效应，ppy装饰于PNIPAM-AAc纳米颗粒（参考[25]）。PVP（50和100 mg）和吡咯单体（50和100 μL）快速加入10 mg/mL PNIPAM-AAc溶液，室温搅拌12 h。加入KPS（3.4 mg）继续搅拌14 h。ppy装饰PNIPAM-AAc经蒸馏水离心三次洗涤，冻干48 h得PNIPAM-ppy-5和PNIPAM-ppy-10。

癌症靶向PNIPAM-ppy纳米复合物合成

获取癌症靶向PNIPAM-ppy纳米复合物（PNIPAM-ppy-FA）：10 mg PNIPAM-ppy溶于磷酸盐缓冲液（PBS, 10 mL, pH 5.5）超声5 min。加入EDC（15 mg, 0.078 mmol）和NHS（15 mg, 0.13 mmol）。1 h后加入FA-PEG-NH₂（5 mg）过夜搅拌。透析膜（MWCO 6–8 kDa）除去未反应FA-PEG-NH₂、EDC、NHS，冻干48 h得PNIPAM-ppy-FA纳米复合物。

抗癌药物负载PNIPAM-ppy-FA纳米复合物合成

10 mg PNIPAM-ppy-FA溶于去离子水超声5 min。0.5 mg/mL Dox滴加至PNIPAM-ppy-FA溶液，室温剧烈搅拌。未负载Dox经离心（14,000 rpm, 10 min）除去并用去离子水纯化。冻干48 h得Dox负载PNIPAM-ppy-FA（Dox@PNIPAM-ppy-FA）。

NIR和热响应PNIPAM-ppy-FA纳米复合物表征

透射电镜（TEM, JEOL-2100F）表征尺寸、形貌、分布。样品制备：1 g/L去离子水溶液滴加于碳膜铜网。动态光散射（Zetasizer Nano Z）测量水溶液超声5 min后的粒径分布和表面电荷。傅里叶变换红外光谱（FT-IR，KBr压片，Nicolet iS50，400–4000 cm⁻¹，分辨率4 cm⁻¹）确认表面修饰和化学键合。UV-Vis光谱（UV 1800, Shimazu）观察光学性质和Dox负载量。

NIR和热响应PNIPAM-ppy-FA纳米复合物光热性质和光稳定性

实时检测温度变化评估Dox@PNIPAM-ppy-FA光热性质。不同浓度（0.05, 0.1, 0.2 mg/mL）水溶液经808 nm NIR激光（MDL-N-808, CNI Optoelectronics）功率密度2 W/cm²照射20 min。研究激光功率密度影响：1, 2, 3 W/cm²照射20 min。光热稳定性：0.1 mg/mL溶液暴露15 min自然冷却循环5次。照射期间每60 s用热电偶连接数字温度计（DTM-318, Tecpel）测温。

PNIPAM-ppy-FA纳米复合物NIR和热响应药物释放

研究热响应药物释放曲线：Dox@PNIPAM-ppy-FA溶液（1 mg/mL）装入5 mL小瓶，在25, 37, 50 °C搅拌。定时（0–72 h）离心取上清液并等量补充新鲜培养基。UV-Vis在480 nm测定释放Dox量。此外研究NIR激光触发释放行为：Dox@PNIPAM-ppy-FA溶液（1 mg/mL）37 °C剧烈搅拌，预设时间点（1,2,3,4,5 h）经3 W/cm² NIR激光照射10 min。对照组无NIR照射。释放Dox同上法测定。

PNIPAM-ppy-FA纳米复合物细胞毒性分析

MTT法验证PNIPAM-ppy-FA纳米复合物（含PNIPAM-ppy-FA和Dox@PNIPAM-ppy-FA）细胞毒性。A549和MDA-MB-231细胞接种于96孔板（1×10⁴ cells/well，200 µL RPMI 1640含10% FBS、1%青霉素-链霉素），37 °C、5% CO₂、湿润培养。24 h后加入不同浓度（20–100 µL）纳米复合物孵育24 h。DPBS洗涤，换新鲜培养基含MTT试剂（0.5 mg/mL）再孵育4 h。移除培养基，加200 µL DMSO溶解紫色甲臜晶体。iMark微孔板读数仪（Bio-rad）595 nm测吸光度。

PNIPAM-ppy-FA纳米复合物细胞摄取分析

评估PNIPAM-ppy-FA靶向特异癌细胞能力：A549和MDA-MB-231细胞接种于8孔板（ibidi，2×10⁴ cells/mL）培养24 h。孵育PNIPAM-ppy-FA纳米复合物（60 µg/mL）6 h。DPBS洗两次除去残留纳米复合物，4%多聚甲醛固定15 min。0.1% Triton-X室温15 min处理，Alexa Fluor 488鬼笔环肽（1:200, Invitrogen）4 °C染色1天，DAPI（Thermo Fisher）染色10 min。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM, LSM 710, Carl Zeiss）观察细胞摄取图像。

NIR激光照射下PNIPAM-ppy-FA纳米复合物增强抗癌效果

MTT法研究NIR和热响应PNIPAM-ppy-FA对乳腺癌细胞增强治疗效果。MDA-MB-231（1×10⁴ cells/mL）接种96孔板培养24 h。DPBS洗涤，依浓度梯度加入PNIPAM-ppy-FA和Dox@PNIPAM-ppy-FA（20, 40, 60, 80, 100 μg/mL）。过夜孵育后移除培养基换新鲜培养基。NIR激光照射组：5 W/cm²照射5 min。洗涤加含MTT培养基4 h。移除培养基加200 µL DMSO。iMark微孔板读数仪595 nm测吸光度确定细胞活力。另行活/死细胞实验：PNIPAM-ppy-FA和Dox@PNIPAM-ppy-FA（60 μg/mL）处理MDA-MB-231。24 h后经5 W/cm²、5 min NIR照射或不照射，钙黄绿素AM和乙idium同二聚体-1染色30 min。DPBS多次洗涤，倒置荧光显微镜（Olympus Ix73）获取活/死图像。

结果与讨论

NIR和热响应癌症靶向PNIPAM-ppy纳米复合物合成与表征

制备热响应PNIPAM基纳米复合物，PNIPAM-AAc纳米颗粒经自由基聚合法制备（参考[15]）。为通过NIR激光控制LCST，聚合反应在制备的PNIPAM-AAc中包覆ppy。癌症靶向PNIPAM-ppy-FA通过化学共价连接FA-PEG-NH₂至PNIPAM-AAc羧基合成。TEM图像（图1a）观察PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA形貌、尺寸、分散性。PNIPAM-AAc均匀，平均直径274.32±11.62 nm。ppy装饰后PNIPAM-ppy和PNIPAM-ppy-FA尺寸相近，分别为275.99±11.41和285.77±17.92 nm。Dox负载后尺寸略增至290.73±12.28 nm，表明药物负载于纳米复合物内。有趣的是，与PNIPAM-AAc相比，PNIPAM-ppy-FA中ppy存在清晰表现为小黑点。因PEG链，PNIPAM-ppy-FA水溶液中分散良好无聚集。DLS分析平均流体动力学直径（附件Fig.S1）：PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、Dox@PNIPAM-ppy-FA分别为432, 450.7, 468.6, 486.7 nm。虽不同分析法直径大于TEM，但粒径分布趋势相似。

研究聚合ppy对PNIPAM-AAc影响，测量PNIPAM-AAc和Dox@PNIPAM-ppy-FA LCST值（图1b）。与前期工作[15]相比，Dox@PNIPAM-ppy-FA LCST略低于PNIPAM-AAc（42 °C），差异可能因ppy聚合和靶向配体共价连接减少PNIPAM-AAc羧基。图1c监测温度依赖粒径变化：25–50 °C测量PNIPAM-AAc和Dox@PNIPAM-ppy-FA直径。随温度升高，PNIPAM-AAc从436 nm降至177 nm；Dox@PNIPAM-ppy-FA从630 nm大幅降至420 nm，表明ppy装饰不影响热响应可控DDS应用。

Zeta电位（图2a）显示修饰前后表面电荷变化。PNIPAM-AAc为-37.1±1.61 mV（AAc羧基）。PNIPAM-ppy和PNIPAM-ppy-FA分别升至-29.6±0.96和-15.6±0.26 mV，表明正电荷ppy和FA-PEG-NH₂成功引入。负电荷Dox负载后Dox@PNIPAM-ppy-FA电位变为-28.6±0.23 mV。FT-IR（图2b）确认合成成功。PNIPAM-AAc显示1100–1200 cm⁻¹ C-N和CH₂伸缩振动峰，1545, 1645, 1750 cm⁻¹处C=O、N-H、COOH峰属PNIPAM-AAc。PNIPAM-ppy和PNIPAM-ppy-FA中ppy显示额外峰935和1050 cm⁻¹。PNIPAM-ppy-FA新峰1107和2880 cm⁻¹归因于PEG链C-O-C，证实FA-PEG-NH₂共价连接成功。FA靶向配体因结构似PEG未被FT-IR检出。UV-Vis（图2c）确认FA存在：PNIPAM-AAc和PNIPAM-ppy（无FA）无吸收峰，PNIPAM-ppy-FA在280 nm显示FA特征吸收峰，支持FA分子接枝于PNIPAM基纳米复合物。

NIR激光照射下PNIPAM-ppy-FA纳米复合物光热性质

UV-Vis光谱（图2c）考察光学性质：PNIPAM-AAc在NIR区（λ=700–1000 nm）无吸收；PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、Dox@PNIPAM-ppy-FA因聚合ppy纳米颗粒在同一范围显示强吸收，证明可将NIR光转化为热。NIR激光照射评估光热性质（图3）。优化光热效应：PNIPAM-FA（无吡咯）、PNIPAM-ppy-5-FA（ppy 50 μL）、PNIPAM-ppy-10-FA（ppy 100 μL）同浓度（0.1 mg/mL）经808 nm NIR激光2 W/cm²照射20 min（图3a）。PNIPAM-ppy-10-FA温升14.5 °C，为PNIPAM-ppy-5-FA两倍。对照PNIPAM-FA无ppy温升可忽略（2.4 °C）。故选PNIPAM-ppy-10-FA进一步实验。不同浓度（0.05, 0.1, 0.2 mg/mL）NIR照射温升分别为10, 14.5, 18 °C（图3b）。不同激光功率密度（1–3 W/cm²）照射0.1 mg/mL溶液（图3c），温升高度依赖激光功率。光热稳定性（图3d）：NIR激光重复照射至少5次，温度稳定升至33 °C，表明PNIPAM-ppy-FA适合作为光热治疗纳米载体。

PNIPAM-ppy-FA纳米复合物NIR和热响应药物释放

评估NIR和热响应药物释放曲线，分析Dox@PNIPAM-ppy-FA包封和释放性质。UV-Vis吸收光谱（图2c）在480 nm附近观察到强吸收峰，表明Dox成功负载。Dox负载效率经标准曲线计算为15%（数据未示）。图4a研究不同温度下Dox释放曲线：25, 37, 50 °C下72 h累积释放分别为15%, 42%, 67%。因PNIPAM-ppy-FA LCST略降至42 °C，体温下累积释放高于室温。大量Dox释放但不影响治疗效率，因Dox@PNIPAM-ppy-FA仅内化于叶酸受体阳性细胞（参考[26,32]）。高于LCST（50 °C）时释放量为室温4倍，表明可通过热响应实现可控药物释放。图4b研究NIR光触发释放：Dox@PNIPAM-ppy-FA溶液（1 mg/mL）经3 W/cm² NIR激光照射10 min，每1 h重复一次。6 h内NIR触发总释放达35%，对照无NIR照射在25 °C和37 °C分别仅约5%和15%。结果表明NIR照射使温度升高超过纳米复合物LCST，诱导Dox从PNIPAM-ppy-FA释放。

PNIPAM-ppy-FA纳米复合物细胞毒性和细胞摄取分析

文献[33,34]中对肺癌和乳腺癌细胞细胞毒性测试（附件Fig.S2）。无论样品浓度，与PNIPAM-ppy-FA孵育24 h后两种细胞活性均>85%。因此PNIPAM-ppy-FA作为药物递送纳米载体无细胞毒性（参考[35,36]）。共聚焦激光扫描显微镜检测细胞内荧光信号评估靶向递送能力（附件Fig.S3）。叶酸受体阴性（A549）和阳性（MDA-MB-231）细胞系中评估PNIPAM-ppy-FA和Dox@PNIPAM-ppy-FA细胞摄取行为（参考[37]）。MDA-MB-231孵育Dox@PNIPAM-ppy-FA后观察到强红色荧光，表明内化于溶酶体。对比A549处理未观察到Dox信号。共聚焦图像证明PNIPAM-ppy-FA可选择性通过受体介导内吞途径内化于叶酸受体高表达癌细胞（参考[38,39]）。

NIR和热响应PNIPAM-ppy-FA纳米复合物化疗-光热抗癌效果

MTT法评估联合治疗效果（图5a）。光热治疗：MDA-MB-231与PNIPAM-ppy-FA孵育12 h后经NIR激光（5 W/cm², 5 min）照射。细胞活力随PNIPAM-ppy-FA浓度降至70–90%。单纯化疗效果：Dox负载纳米复合物处理，活力降至50%，对应释放曲线（图4）。有趣的是，Dox@PNIPAM-ppy-FA经NIR照射后MDA-MB-231活力骤降至24%，显著优于对照组（PNIPAM-ppy-FA+NIR，Dox@PNIPAM-ppy-FA无NIR）。表明NIR介导的化疗-光热联合治疗存在最佳协同效应。活/死实验直观观察治疗效果（图5b）。对照组：仅MDA-MB-231经NIR照射或不照射（5 W/cm², 5 min），多为绿色荧光（活细胞），证明NIR照射不显著影响活力。PNIPAM-ppy-FA+NIR显示少量红色荧光（死细胞），表明光热效应。Dox@PNIPAM-ppy-FA无NIR显示零星红色荧光，表明化疗效应。纳米复合物+NIR处理组最多癌细胞呈红色荧光。支持NIR照射和热响应Dox@PNIPAM-ppy-FA的化疗-光热协同治疗效果。

结论

成功构建癌症靶向NIR和热响应PNIPAM-ppy-FA纳米复合物用于化疗-光热联合治疗。通过聚合法在PNIPAM-AAc上均匀装饰ppy纳米颗粒，实现808 nm NIR激光照射下的可控释放和光热效应。Dox负载PNIPAM-ppy-FA显示显著光热效应和光稳定性。Dox@PNIPAM-ppy-FA在不同条件下表现良好热敏相变性质，药物释放可由NIR光和热响应控制。体外研究验证PNIPAM-ppy-FA纳米复合物优异生物相容性和对乳腺癌细胞增强治疗效果。增强抗癌效果归因于：(1)叶酸受体介导内吞的特异性细胞摄取；(2)NIR和热响应下PNIPAM-ppy-FA累积Dox释放；(3)化疗-光热联合协同治疗效应。因此，PNIPAM-ppy-FA纳米复合物可作为多功能纳米载体用于不同癌症类型的协同治疗方法，减少副作用。

数据与材料可用性

本工作数据和分析可向通讯作者合理请求获取。

缩略语

PTT:

光热治疗

NIR:

近红外

FA:

叶酸

FA-PEG-NH₂:

FA-PEG胺

LCST:

低临界溶液温度

PNIPAM:

聚(N-异丙基丙烯酰胺)

ppy:

聚吡咯

TEM:

透射电镜

UV-Vis:

紫外-可见光谱