用于化学光热癌症治疗的近红外光触发热响应聚（N-异丙基丙烯酰胺）-吡咯纳米复合材料

介绍

药物递送系统 (DDS) 是一种有效的给药方法，可在癌症治疗中使用药物化合物来达到治疗效果 [1]。尽管 DDS 的目标是递送活性药物并在所需区域积累，但常规 DDS 往往伴随着严重的副作用和低效的治疗效率 [2, 3]。为了克服这些障碍，已经开发了多种纳米载体，它们能够响应特定的内部或外部刺激，包括温度、光、pH、电场、氧化还原、酶活性和抗原浓度，用于高级 DDS 和用于诱导缓控释药物[4,5,6]。

作为各种刺激之一，热响应纳米载体是改善癌症治疗的有力方法，因为进入纳米颗粒的药物可以在特定温度下释放 [7]。此外，热敏纳米粒子的优势可以与其他刺激相结合，以诱导彻底根除癌症[8, 9]。作为一种热响应纳米粒子，poly(N -异丙基丙烯酰胺) (PNIPAM) 受到了最多的关注，因为它在 32°C 左右的较低临界溶解温度 (LCST) 下表现出相变 [10, 11]。在 LCST 以下，PNIPAM 中的整个聚合物网络由于氢键而以溶胀状态存在。另一方面，PNIPAM 转变为疏水状态，氢键减少，导致 LCST 上方的聚合物网络坍塌 [12, 13]。与其他纳米粒子相比，基于 PNIPAM 的纳米载体具有药物包封效率高、药物释放可控、生物相容性好等优点[14]。然而，由于药物在体温下自发释放，基于 PNIPAM 的纳米载体不足以用于高级 DDS。为克服这一问题，以往的研究在PNIPAM的合成过程中加入了有机酸（如醋酸乙烯、丙烯酸和烯丙醋酸），通过持续释放药物来减少副作用[15]。

最近，许多研究集中在新的治疗方法上，即整合两个或多个刺激触发纳米粒子以增强癌症治疗效果 [16,17,18]。例如，光热疗法 (PTT) 具有多种优势，例如对肿瘤的精确光控、非侵入性渗透和对正常细胞的低毒性 [19, 20]。为了将纳米粒子与 PTT 结合，光热剂（例如，金纳米棒、碳纳米管、聚吡咯 (ppy) 和氧化石墨烯）必须均匀地封装在基于 PNIPAM 的纳米粒子中 [21,22,23]。先前的研究制造了具有热响应和 pH 响应 PNIPAM 壳的介孔二氧化硅涂层金纳米棒，并进一步探索了体内癌症治疗应用 [24]。然而，这些基于 PNIPAM 的纳米复合材料需要多步合成过程。此外，由于纳米复合材料没有针对特定癌细胞的靶向部分，因此可能会对其他器官或正常组织造成严重的副作用。在我们之前的报告中，我们利用 PNIPAM 的热敏和 pH 敏感特性开发了一种双向控释系统 [15]。 PNIPAM 纳米凝胶与丙烯酸 (AAc) 共聚以有效控制 LCST。为了更好地提高癌症靶向性和治疗效果，我们开发了利用化学和光热效应的癌症靶向联合疗法（方案 1）。随着近红外激光照射温度升高，来自热响应 PNIPAM 纳米复合材料的药物被释放，随后光热效应被激活。由于共轭叶酸（FA），基于PNIPAM的纳米复合材料对MDA-MB-231乳腺癌细胞的治疗效果显着增强。

a 的示意图 NIR光和热触发Dox@PNIPAM-ppy-FA纳米复合材料和b的合成 增强化学光热联合治疗在乳腺癌细胞中的应用

材料和方法

材料

NIPAM，N，N '-亚甲基双丙烯酰胺 (MBA)、过硫酸钾 (KPS, 99%)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N '-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 和 N -羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 和吡咯 (98%) 购自 Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA)。 AAc 购自 Dae Jung Chemicals &Materials。有限公司（韩国）。 FA-PEG-胺（FA-PEG-NH2，MW：5 kDa）由 Nanocs, Inc.（纽约，纽约，美国）提供。盐酸多柔比星 (Dox) 购自东京化学工业公司。 Co. Ltd（日本东京）。所有化学品和材料均未经进一步纯化即用于商业用途。

ppy 装饰的 PNIPAM-AAc 纳米粒子的合成

根据先前的报道[15]合成了与 AAc 纳米颗粒共聚的热响应 PNIPAM。将 1.13 克 NIPAM 单体、0.077 克 MBA 和 0.136 克 AAc 溶解在 100 毫升去离子水中并加入到 250 毫升三颈圆底烧瓶中。 30 分钟后，将反应温度升至 80°C 并剧烈搅拌 1 小时。为了诱导聚合，向混合物中加入 KPS (1.5 mg)，然后搅拌 4 小时。混合物在去离子水中对截留分子量 (MWCO) 12-14 kDa 透析膜透析 7 天，以去除未反应的单体、引发剂、可分配离子，并通过冷冻干燥 48 小时获得 PNIPAM-AAc 纳米颗粒。为了使光热效应功能化，ppy 被装饰成 PNIPAM-AAc 纳米粒子 [25]。将 PVP（50 和 100 毫克）和吡咯单体（50 和 100 微升）快速添加到 10 毫克/毫升的 PNIPAM-AAc 溶液中，并在室温下搅拌 12 小时。然后，将 KPS (3.4 mg) 插入到 PNIPAM-AAc 溶液中并另外搅拌 14 小时。将 ppy 修饰的 PNIPAM-AAc 用蒸馏水离心 3 次。 PNIPAM-ppy-5和PNIPAM-ppy-10是通过冷冻干燥48小时获得的。

癌症靶向 PNIPAM-ppy 纳米复合材料的合成

为了获得靶向癌症的 PNIPAM-ppy 纳米复合材料 (PNIPAM-ppy-FA)，将 10 mg PNIPAM-ppy 溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS，10 mL，pH 5.5）中并超声处理 5 分钟。将 EDC（15 毫克，0.078 毫摩尔）和 NHS（15 毫克，0.13 毫摩尔）加入到 PNIPAM-ppy 溶液中。 1小时后，加入FA-PEG-NH 2 (5mg)并另外搅拌过夜。 PNIPAM-ppy 溶液中未反应的 FA-PEG-NH2、EDC 和 NHS 通过透析膜（MWCO 6-8 kDa）去除，PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料冻干 48 小时。

载有抗癌药物的 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的合成

将 10 mg PNIPAM-ppy-FA 溶解在去离子水中并超声处理 5 分钟。将 0.5 mg/mL Dox 滴加到 PNIPAM-ppy-FA 溶液中，在室温下剧烈搅拌。通过离心（14,000 rpm，10 分钟）去除未加载的 Dox，并用去离子水纯化。冷冻干燥 48 h 得到载有 Dox 的 PNIPAM-ppy-FA (Dox@PNIPAM-ppy-FA)。

NIR 和热响应 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的表征

透射电子显微镜（TEM，JEOL-2100F，JEOL，日本）用于表征 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的尺寸、形态和分布。对于 TEM 测量，通过将一滴样品溶液在去离子水中（浓度：1 g/L）置于涂有碳的 200 目铜网上来制备样品。通过使用 Zetasizer Nano Z（Malvern Instruments，UK）测量 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的尺寸分布和表面电荷，将其溶解在去离子水中并超声处理 5 分钟。 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的表面改性和化学键合通过傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 得到证实。使用 Nicolet iS50 仪器（Thermo Fisher Scientific, Inc., USA）在 400–4000 cm ^-1 范围内记录 KBr 颗粒上的 FT-IR 光谱 分辨率为 4 cm ⁻¹ .通过紫外-可见光谱（UV 1800，Shimazu，Japan）观察PNIPAM-ppy-FA纳米复合材料的光学性质和Dox负载能力。

NIR 和热响应 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的光热性能和光稳定性

通过实时检测温度变化来评估负载 Dox 的 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料（Dox@PNIPAM-ppy-FA）的光热性能。将 Dox@PNIPAM-ppy-FA 溶解在不同浓度 0.05、0.1 和 0.2 mg/mL 的水溶液中，并使用 808 nm NIR 激光器（MDL-N-808，CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., China) 的功率密度为 2 W/cm ² .通过用功率密度为 1、2 和 3 W/cm ² 照射 NIR 激光 20 min 来研究 NIR 激光功率密度的影响 ， 分别。此外，为了研究对 NIR 激光的光热稳定性，将 Dox@PNIPAM-ppy-FA 溶液（0.1 mg/mL）暴露 15 分钟，然后自然冷却 5 次。在近红外激光照射过程中，Dox@PNIPAM-ppy-FA 溶液的温度通过与数字温度计（DTM-318，Tecpel Co.，Taiwan）相连的热电偶每 60 秒测量 15 分钟。

PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的 NIR 和热响应药物释放

为了通过热响应研究 Dox 的释放曲线，将 Dox@PNIPAM-ppy-FA 溶液 (1 mg/mL) 制备成 5 mL 小瓶，然后在 25、37 和 50 °C 下搅拌。在规定的释放时间（0-72 小时），通过离心收集每个样品的上清液，并更换为等体积的新鲜培养基。从 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料中释放的 Dox 量是通过在 480 nm 处测量 UV-Vis 光谱来估计的。此外，通过 NIR 激光刺激响应的 Dox@PNIPAM-ppy-FA 溶液（1 毫克/毫升）的 Dox 释放行为在 37°C 下剧烈搅拌，并在预定时间点（1、2、3 、4 和 5 小时）。作为对照，使用没有 NIR 激光照射的 Dox@PNIPAM-ppy-FA 溶液。释放的Dox采用上述方法测定。

PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的细胞毒性分析

包括PNIPAM-ppy-FA和Dox@PNIPAM-ppy-FA在内的PNIPAM-ppy-FA纳米复合材料的细胞毒性通过MTT法进行了验证。 A549和MDA-MB-231细胞以1 × 10 ⁴ 的密度接种于96孔板中 在含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 200 µL RPMI 1640 培养基中，每孔每孔 1 个细胞，并在 37°C 下在含有 5% CO2 的湿润气氛中培养。 1 天后，将 200 µL 不同浓度 (20–100 µL) 的 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料处理到每个细胞中，并将板温育 24 小时。用DPBS洗涤细胞，然后用含有MTT剂(0.5mg/mL)的新鲜培养基替换培养基。再孵育 4 小时后，小心地去除培养基并向每个孔中加入 200 µL DMSO 以溶解内化的紫色甲臜晶体。使用 iMark™ 酶标仪（Bio-rad, Hercules, CA, USA）在 595 nm 处测量吸收。

PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的细胞摄取分析

为了评估PNIPAM-ppy-FA纳米复合材料对特定癌细胞的靶向能力，将A549和MDA-MB-231细胞以2 × 10 ^{的密度接种在8孔板（ibidi，Munich，Germany）中4} 细胞/mL，并孵育 24 小时。然后将细胞与 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料 (60 µg/mL) 孵育 6 小时。随后，将细胞用 DPBS 洗涤两次以去除剩余的纳米复合材料，并用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。在室温下用 0.1% Triton-X 处理 15 分钟后，细胞最终用 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽（1:200，Invitrogen，美国）在 4°C 和 4,6-二脒基-2-染色 1 天。苯基吲哚（DAPI，Thermo Fisher Scientific，USA）分别放置 10 分钟。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，LSM 710，Carl Zeiss，Germany）观察细胞摄取图像。

通过近红外激光照射增强 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的抗癌作用

通过 MTT 测定研究了使用 NIR 和热响应性 PNIPA-ppy-FA 对乳腺癌细胞的增强治疗效果。 MDA-MB-231 (1 × 10 ⁴ 细胞/mL）接种到 96 孔板上并孵育 24 小时。然后用 DPBS 洗涤细胞，并以浓度依赖性方式将不同浓度（20、40、60、80 和 100 μg/mL）的 PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料加入每个孔中.孵育过夜后，除去培养基，然后加入新鲜培养基。对于 NIR 激光照射组，用 5 W/cm ² 处理细胞 5 分钟。然后，用 DPBS 洗涤 MDA-MB-231，并加入包括 MTT 溶液的新鲜培养基。 4 小时后，小心去除培养基，并在每孔中加入 200 μL DMSO。最后，通过 iMark™ 酶标仪测量 595 nm 处的吸光度以确定细胞活力。作为观察癌症治疗效果的另一种方法，进行了活体和死体测定。 PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 μg/mL) 被处理成 MDA-MB-231。 24 小时后，MDA-MB-231 在有或没有 NIR 激光照射（5 W/cm ² , 5 分钟）并用钙黄绿素 AM 和乙锭同二聚体-1 染色。 30 分钟后，将细胞用 DPBS 洗涤数次。活体/死体图像采用倒置荧光显微镜（Olympus Ix73，日本）获得。

结果与讨论

NIR 和热响应癌症靶向 PNIPAM-ppy 纳米复合材料的合成和表征

为了产生热响应的基于 PNIPAM 的纳米复合材料，PNIPAM-AAc 纳米颗粒是通过自由基聚合方法制造的 [15]。为了通过 NIR 激光照射控制 LCST，ppy 在制备的 PNIAPM-AAc 中被聚合反应覆盖。靶向癌症的 PNIPAM-ppy-FA 是通过将 FA-PEG-NH2 与 PNIPAM-AAc 中的羧基化学结合来合成的。根据图 1a 中的 TEM 图像，观察到 PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy 和 PNIPAM-ppy-FA 的形态、尺寸和分散性。制备的 PNIPAM-AAc 表现出平均直径为 274.32 ± 11.62 nm 的均质形式。 ppy 修饰后，PNIPAM-ppy 和 PNIPAM-ppy-FA 显示出相似的尺寸，分别为 275.99 ± 11.41 和 285.77 ± 17.92 nm。负载 Dox 的 PNIPAM-ppy-FA 的大小从 285.77 ± 17.92 略微增加到 290.73 ± 12.28 nm，表明抗癌药物负载在 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料中 [26]。有趣的是，与 PNIPAM-AAc 相比，PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料中 ppy 的存在由小黑点清楚地显示出来。此外，由于 PEG 链，PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料可以很好地分散在水溶液中而不会聚集 [27]。 PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 的平均流体力学直径通过 DLS 分析测量（附加文件 1：图 S1）。PNIPAM-AAc、PNIPAM 的直径-ppy、PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 分别为 432、450.7、468.6 和 486.7 nm。由于分析方法不同，各纳米复合材料的粒径均大于TEM，但PNIPAM-ppy-FA纳米复合材料的粒径和分布趋势相似。

一 PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的 TEM 图像。 b DLS 对 Dox@PNIPAM-ppy-FA 的 LCST 分析。 c PNIPAM-AAc 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 的平均直径取决于不同温度条件（25°C、37.5°C 和 50°C）

为了研究聚合 ppy 对 PNIPAM-AAc 的影响，PNIPAM-AAc 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 的 LCST 值通过不同温度测量（图 1b）。与我们之前的工作 [15] 相比，Dox@PNIPAM-ppy-FA 的 LCST 比 PNIPAM-AAc (42°C) 略有降低。这种差异可能是由于聚合 ppy 和共轭癌症靶向配体导致 PNIPAM-AAc 中的羧基减少所致 [28]。随后，我们监测了图 1c 中颗粒大小随温度的变化。为此，PNIPAM-AAc 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 的直径是在 25 到 50°C 的温度范围内测量的。随着温度升高，PNIPAM-AAc 从 436 nm 降低到 177 nm。此外，Dox@PNIPAM-ppy-FA 的尺寸从 630 nm 大大减小到 420 nm，表明 PNIPAM 纳米复合材料中的 ppy 修饰对受控和热响应 DDS 的应用没有很大影响 [27]。

PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 的 zeta 电位值显示了改性前后纳米复合材料的表面变化（图 2a）。由于 AAc 中的羧基，PNIPAM-AAc 的 zeta 电位为 - 37.1 ± 1.61 mV [29]。 PNIPAM-ppy 和 PNIPAM-ppy-FA 的值增加到 - 29.6 ± 0.96 和 - 15.6 ± 0.26 mV，表明带正电荷的聚吡咯和 FA-PEG-NH2 成功引入到 PNIPAM-ppy-27 纳米复合材料中。由于带负电荷的 Dox，Dox@PNIPAM-ppy-FA 的 zeta 电位变为更多的负电荷（- 28.6 ± 0.23 mV）。如图 2b 所示，通过 FT-IR 光谱证实了 PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy 和 PNIPAM-ppy-FA 的成功合成。 PNIPAM-AAc 的光谱显示 C-N 和 CH2 的伸缩振动峰在 1100 到 1200 cm ^-1 在 1545、1645 和 1750 cm ^-1 处观察到 C=O、N-H 和 COOH 的峰 ，属于 PNIPAM-AAc [15]。 PNIPAM-ppy 和 PNIPAM-ppy-FA 中的聚吡咯在 935 和 1050 cm ^-1 处显示出额外的峰 观察到 [30]。在 PNIPAM-ppy-FA 的光谱中，新的振动峰出现在 1107 和 2880 cm ^-1 ，这归因于 PEG 链的 C-O-C。该结果表明 FA-PEG-NH2 的化学偶联成功 [31]。然而，FT-IR 没有检测到 FA 的靶向配体，因为它的结构与 PEG 相似。为了确认 PNIPAM 纳米复合材料中 FA 的存在，PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy 和 PNIPAM-ppy-FA 是通过 UV-Vis 光谱进行的（图 2c）。虽然 PNIPAM-AAc 和 PNIPAM-ppy（不含 FA）的光谱没有显示任何吸收峰，但 PNIPAM-ppy-FA 在 280 nm 处显示出额外的峰，这在 FA 中是独特的 [32]。该结果支持FA分子接枝在PNIPAM基纳米复合材料上。

一 PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 的 Zeta 电位分析。 b PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy 和 PNIPAM-ppy-FA 的 FT-IR 光谱。 c PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA和Dox@PNIPAM-ppy-FA的紫外-可见光谱

近红外激光辐照PNIPAM-ppy-FA纳米复合材料的光热性能

为了使用基于 PNIPAM 的纳米复合材料进行光热治疗，通过紫外-可见光谱检查了 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的光学性能。如图 2c 所示，PNIPAM-AAc 在 NIR 区域（λ =700-1000 nm）没有显示任何吸光度。然而，PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 的光谱明显显示出由于聚合 ppy 纳米粒子而在相同范围内的强吸光度。这些吸光度结果表明 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料可以将 NIR 光转化为热量 [26]。接下来，我们通过 NIR 激光照射评估了 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的光热性能（图 3）。为了优化光热效应，制备了相同浓度 (0.1 mg/mL) 的 PNIPAM-FA（不含吡咯）、PNIPAM-ppy-5-FA（ppy 50 μL）和 PNIPAM-ppy-10-FA（ppy 100 μL） )，然后以 2 W/cm ² 的密度暴露于 808 nm NIR 激光照射 20 分钟（图 3a）。 PNIPAM-ppy-10-FA 的温度升高到 14.5°C，是 PNIPAM-ppy-5-FA 的 2 倍。作为对照，辐照不含 ppy 的 PNIPAM-FA，但温度升高可忽略不计（2.4°C）。因此，我们选择 PNIPAM-ppy-10-FA 来研究额外的光热实验。为了观察浓度随温度的变化，将 NIR 激光照射到不同浓度（0.05、0.1 和 0.2 mg/mL）的 PNIPAM-ppy-FA。在图 3b 中，根据浓度，温度分别增加到 10、14.5 和 18°C。此外，PNIPAM-ppy-FA 溶液（0.1 毫克/毫升）用不同的激光功率密度（1-3 瓦/厘米 ² ) 在图 3c 中。正如预期的那样，纳米复合材料的温升高度依赖于激光功率。随后，我们在图 3d 中观察了 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的光热稳定性。尽管 NIR 激光照射至少重复进行 5 次，但温度稳步上升至 33°C，表明 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料是一种适合作为光热疗法的纳米载体。

PNIPAM-ppy-FA纳米复合材料的光热性能。 一 Dox@PNIPAM-ppy-5-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-10-FA 在 808 nm NIR 激光照射下的温度分析 (2 W/cm ² ）。 b 不同浓度 Dox@PNIPAM-ppy-FA 在 808 nm NIR 照射下的温度分析 (2 W/cm ² ）。 c Dox@PNIPAM-ppy-FA 在不同功率密度（1、2 和 3 W/cm ² ）下的光热效应 ）。 (D) Dox@PNIPAM-ppy-FA 在使用 NIR 激光照射 (2 W/cm ² ) 的五个开/关周期内的温度曲线 )

PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的 NIR 和热响应药物释放

为了通过 NIR 和热响应评估药物释放曲线，我们分析了 Dox@PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的封装和释放特性。最初，我们测量了载药 PNIPAM-ppy-FA 的 UV-Vis 吸收光谱，在 480 nm 附近观察到一个强吸收峰（图 2c）。该结果表明 Dox 成功加载到 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料中。使用 Dox 校准曲线计算出 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的 Dox 负载效率为 15%（数据未显示）。在图 4a 中，研究了 PNIPAM-ppy-FA 在不同温度下的 Dox 释放曲线。我们在 25°C、37°C​​ 和 50°C 下观察了 72 小时的 Dox 释放行为，并且从 PNIPAM-ppy-FA 中累积释放的 Dox 分别为 15%、42% 和 67%。由于 PNIPAM-ppy-FA 的 LCST 略微降低至 42°C，因此发现体温下的累积释放量相对高于室温。大量的 Dox 被释放，然而，释放的 Dox 并不影响治疗效率，因为 Dox@PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料只能在叶酸受体阳性细胞中被内化，如前所述 [26, 32]。在高于 LCST（50°C）时，PNIAPM-ppy-FA 纳米复合材料中 Dox 的释放量是室温的四倍，这表明 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料可用于通过热响应控制药物释放系统。此外，我们研究了图 4b 中 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的 NIR 光触发释放行为。 Dox@PNIAPM-ppy-FA 溶液 (1 mg/mL) 暴露于 NIR 激光 (3 W/cm ² ) 照射 10 分钟，此操作每 1 小时重复一次。在 6 小时内，通过 NIR 激光照射的 Dox 总量达到 35%，而没有 NIR 激光照射的 Dox 释放曲线显示约 5% 和 15%（25°C 和 37°C）。该结果表明，NIR 激光照射导致纳米复合材料的温度高于 LCST，并诱导 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料释放 Dox。

一 Dox@PNIPAM-ppy-FA 通过热响应和 b 的累积 Dox 释放曲线 808 nm近红外激光照射

PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的细胞毒性和细胞摄取分析

根据文献，研究了 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料对肺癌和乳腺癌细胞的细胞毒性（附加文件 1：图 S2）[33, 34]。无论样品浓度如何，在与 PNIPAM-ppy-FA 孵育 24 小时后，均观察到两种细胞活力 (> 85%)。因此，我们的 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料作为用于药物递送应用的纳米载体没有表现出细胞毒性 [35, 36]。为了研究 PNIPAM-ppy-FA 是否可以选择性地传递给癌细胞，我们使用共聚焦激光扫描显微镜检查了细胞内 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的荧光信号（附加文件 1：图 S3）。在叶酸受体阴性 (A549) 和阳性 (MDA-MB-231) 细胞系中评估了 PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 的细胞摄取行为 [37]。 MDA-MB-231 乳腺癌细胞与 Dox@PNIPAM-ppy-FA 孵育后，观察到强烈的红色荧光，表明 Dox@PNIAPM-ppy-FA 被内化到 MDA-MB-231 细胞的溶酶体中。通常，当 PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 用 A549 细胞处理时，未观察到 Dox 信号。这些共聚焦图像表明PNIAPM-ppy-FA纳米复合材料可以通过受体介导的内吞途径选择性地内化到叶酸受体过表达的癌细胞中，如前所述[38, 39]。

NIR 和热响应 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的化学光热抗癌作用

为了证实 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的体外联合治疗效果，在有或没有 NIR 激光照射的 MDA-MB-231 细胞上评估了 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料，并通过图 5a 中的 MTT 测定评估了细胞活力。 .对于光热疗法，将含有 PNIPAM-ppy-FA 的 MDA-MB-231 乳腺癌细胞培养 12 小时，然后暴露于近红外激光 (5 W/cm ² ， 5分钟）。根据 PNIPAM-ppy-FA 的浓度，MDA-MB-231 乳腺癌细胞的细胞活力降低至 70-90%。为了确认唯一的化疗效果，处理了负载 Dox 的 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料。我们观察到，由于 Dox 从纳米复合材料中释放，存活率降低至 50%，对应于图 4 中的释放曲线。有趣的是，在 MDA-MB-231 细胞中用 Dox@PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料进行 NIR 激光照射后，细胞活力显着下降高达 24%，高于对照组（PNIPAM-ppy-FA 有 NIR 激光照射，Dox@PNIPAM-ppy-FA 没有 NIR 激光照射）。该结果表明近红外激光照射介导的化学光热联合治疗具有最佳协同效应。此外，为了直接观察癌细胞的治疗效率，在图 5b 中进行了活/死测定。作为对照组，我们仅观察了 MDA-MB-231 细胞在有或没有 NIR 激光照射 (5 W/cm ² , 5 分钟）并且大多数细胞显示绿色荧光（活细胞）。这表明近红外激光照射对细胞活力没有明显影响。此外，在 NIR 激光照射下，带有 PNIPAM-ppy-FA 的 MDA-MB-231 细胞显示出少量红色荧光（死细胞），表明 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料引起的光热治疗效果。尽管没有用 Dox@PNIPAM-ppy-FA 在 MDA-MB-231 细胞中进行 NIR 激光照射，但观察到一些零星的红色荧光，表明正在接受化疗。此外，当 MDA-MB-231 细胞用纳米复合材料和 NIR 激光照射处理时，大多数癌细胞表现出少量红色荧光 [39, 40]。这些结果支持了通过近红外激光照射和热响应性Dox@PNIPAM-ppy-FA纳米复合材料进行化学光热疗法的协同治疗作用。

一 用不同浓度的 PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 和有或没有 808 nm NIR 激光照射处理的 MDA-MB-231 乳腺癌细胞活力的定量分析。 b 在有或没有 NIR 激光照射的情况下处理 PNIPAM-ppy-FA 和 Dox@PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料（60 μg/mL）后，MDA-MB-231 细胞中活/死检测的荧光图像。活细胞和死细胞用 Calcein AM（绿色）和 Ethidium homodimer-1（红色）染色。比例尺为 200 μm

结论

我们已经成功构建了用于化学光热联合治疗的癌症靶向 NIR 和热响应 PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料。为了通过 808 nm NIR 激光照射诱导控释和光热效应，ppy 纳米粒子通过聚合方法均匀地装饰在 PNIPAM-AAc 上。负载 Dox 的 PNIPAM-ppy-FA 显示出显着的光热效应和光稳定性。此外，Dox@PNIPAM-ppy-FA 在不同条件下表现出良好的热敏转变特性，PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料的药物释放可以通过 NIR 光和热响应来控制。体外研究证实，PNIPAM-ppy-FA 纳米复合材料显示出优异的生物相容性并增强了对乳腺癌细胞的治疗效果。这种通过纳米复合材料增强抗癌功​​效的原因如下：（1）在叶酸受体介导的内吞作用中纳米复合材料的特异性细胞摄取，（2）通过 NIR 和热反应从 PNIPAM-ppy-FA 中积累的 Dox 释放，以及（3 ) 化学光热联合的协同治疗效果。因此，我们的PNIPAM-ppy-FA纳米复合材料有可能作为多功能纳米载体用于不同类型癌症的协同治疗，同时降低副作用。

数据和材料的可用性

当前工作中的数据和分析可在合理要求下向相应作者索取。

缩写

PTT：

光热疗法

近红外：

近红外

FA：

叶酸

FA-PEG-NH2：

FA-PEG胺

LCST：

降低临界溶解温度

PNIPAM：

Poly(N -异丙基丙烯酰胺)

ppy：

聚吡咯

TEM：

透射显微镜

UV-Vis：

紫外可见光谱