生物相容性5-氨基乙酰丙酸/金纳米颗粒共载乙醇体：协同光动力/光热经皮给药治疗增生性疤痕

摘要

我们报道了一种生物相容性乙醇体囊泡（A/A-ES），通过超声法无毒试剂共载 5-氨基乙酰丙酸（ALA）和金纳米颗粒（AuNPs）。A/A-ES 在 600–650 nm 显示显著等离子体吸收带，可利用 632 nm 激光同时激发光动力（PDT）和光热（PTT）治疗。体外经皮研究证实 A/A-ES 高效将 ALA 和 AuNPs 递送至增生性疤痕（HS）组织，2 h 后 ALA 保留率达 48%。增生性疤痕成纤维细胞（HSF）细胞实验显示，A/A-ES 显著升高活性氧（ROS）产生和发热，导致凋亡和坏死增强，优于单独 PDT 或 PTT。这些结果表明 A/A-ES 作为协同 PDT/PTT 治疗 HS 的有前景局部给药平台。

背景

增生性疤痕（HS）源于真皮胶原过度沉积，表现为增厚、纤维化的皮肤，损害功能和美观。常规治疗——病灶内注射、加压衣物、激光治疗——常受限于疗效有限、不适或色素减退、组织萎缩等副作用。基于 5-氨基乙酰丙酸（ALA）的光动力治疗（PDT）通过 ROS 产生选择性细胞毒性，但皮肤渗透差和低 ROS 产率限制临床应用。光热治疗（PTT），特别是利用局域表面等离子体共振（LSPR）将光转化为热的金纳米颗粒（AuNPs），可增强 ROS 产生并选择性消融疤痕组织，但高激光功率有损周围皮肤。

在单一平台结合 PDT 和 PTT 有望产生协同效益：ALA 介导的 ROS 产生可被 AuNPs 热效应放大，而光热效应升高局部温度进一步提升 ROS 产率。乙醇体（ES）作为可变形的脂质载体，增强亲水和疏水药物的经皮递送。前人工作证实 ALA 负载 ES (ALA-ES) 显著优于水溶液向 HS 组织递送 ALA。然而，在保持生物相容性和高效递送的前提下将 AuNPs 整合进 ES 仍具挑战。本文提出一种简便的超声基合成法制备 A/A-ES，无毒溶剂同时包裹 ALA 和 AuNPs，实现高 ALA 包封率（≈20%）和强 600–650 nm 吸收。

结果与讨论

A/A-ES 表征

超声双重作用：(1) 通过自由基介导还原 AuCl₄⁻ 原位生成 AuNPs，避免有毒还原剂；(2) 诱导脂质双层重组，产生尺寸均一、内核宽敞的小囊泡利于药物负载。UV-Vis 光谱确认 600–650 nm 强吸收峰（图 1a），归因于相邻 AuNPs 等离子耦合。动态光散射显示窄分布，中心粒径 166±83 nm（图 1b）；SEM/TEM 显示完整球形囊泡（~200 nm）且双层中清晰可见嵌入 AuNPs（图 1c,d）。ALA 包封效率 (EE) 达 20%，超越常规 ES 制剂（<10%）【27】。这些特性表明 A/A-ES 适合穿越 HS 致密胶原基质。

A/A-ES 体外经皮渗透研究

采用 Franz 扩散池量化新鲜切取 HS 组织中 ALA 和 AuNPs 滞留量。两者均在 2 h 峰值，ALA 组织保留量达给药剂量 48%（图 2a）。随后下降反映完全经皮渗透。TEM 成像（图 2b-d）确认真皮中完整囊泡，随后释放 AuNPs 原位聚集——有利于激光照射下发热。这些数据确立 A/A-ES 作为共递送 ALA 和 AuNPs 进入 HS 组织的有效载体。

HSF 体外 PDT/PTT

生物相容性实验

细胞活力实验显示 A/A-ES 在 ≤2.0 mM 无显著细胞毒性，12 h 后存活 >90%（图 3）。高剂量仅轻微降低活力，确认制剂安全性，指导后续实验治疗浓度为 2.0 mM（≈14% v/v）。

HSF PDT/PTT 实验

共聚焦显微镜显示：ALA-ES 和 A/A-ES 处理的 HSF 中原卟啉 IX (PpIX) 强烈积累；Au-ES 几乎无 PpIX（图 4）。632 nm 激光照射后，PpIX 荧光减弱而 ROS 信号增强，尤以 A/A-ES 处理细胞最明显——证实 AuNPs LSPR 增强 ROS 生成。形态学改变如膜起泡在 A/A-ES 处理细胞中显著，指示细胞死亡。红外热成像证实照射下 ALA-ES、Au-ES 和 A/A-ES 将局部温度升至 41.3 °C (Au-ES/A/A-ES) 和 36.5 °C (ALA-ES)，照射后快速冷却（图 5）。这些发现凸显 A/A-ES 的双重光动力和光热作用。

凋亡与坏死实验

Annexin V/PI 双染流式细胞术显示：激光照射下 A/A-ES 诱导最高坏死比例 (61.8%)，高于 ALA-ES (47.7%) 和 Au-ES (24.3%)（图 6）。早期和晚期凋亡在 A/A-ES 中也升高，反映 ROS 放大和光热胁迫的协同效应。这些结果定量证明了联合 PDT/PTT 优于单一模式。

HSF 中 A/A-ES 可视化

透射电镜显示 A/A-ES 处理 HSF 细胞质内大量 AuNPs 聚集，符合高效囊泡融合和货物释放。照射后图像呈现特征性膜泡、线粒体肿胀、外膜破裂——细胞死亡标志（图 7）。这些超微结构变化确认 A/A-ES 高效递送 ALA 和 AuNPs 至 HSF，导致协同光动力/光热杀伤细胞。

结论

我们开发了一种生物相容性、超声合成的 5-ALA/AuNP 负载乙醇体囊泡（A/A-ES），展现强 600–650 nm 吸收、高 ALA 包封率（~20%）和对 HS 组织的高效经皮递送。体外研究证实 A/A-ES 增强 ROS 产生和光热加热，产生优于单独 PDT 或 PTT 的 HSF 凋亡和坏死。这些发现支持 A/A-ES 作为协同光动力/光热治疗增生性疤痕的有前景局部平台，值得未来体内评估。

实验与方法

A/A-ES 制备

磷脂酰胆碱 (180 mg) 溶于 1.8 mL 乙醇、0.6 mL 10 mM HAuCl₄ 和 3.6 mL 0.01 M ALA-柠檬酸缓冲液 (pH 4.0, 12 mg ALA)。700 rpm 搅拌 10 min，随后 200 W 超声 30 min 至酒红色出现。离心 (8000 rpm, 20 min) 除未反应试剂，沉淀重悬于 3 mL 2 mg/mL ALA 水醇溶液。应用跨膜 pH 梯度负载法将 ALA 封装入囊泡核心，得最终 A/A-ES。对照组 ALA-ES 和 Au-ES 以相同 ALA 或 AuNPs 浓度制备但缺另一组分。

A/A-ES 表征

1.5 wt% 磷钨酸负染后 TEM (JEOL, 120 kV) 观察形貌。SEM (JEOL, 10 kV) 评估表面特征。DLS (Nicomp 380ZLS) 测粒径分布。荧胺衍生化定量 ALA 含量，超滤计算 EE。UV-Vis 光谱用 Varian Cary 50 记录。

Franz 扩散池体外渗透研究

HS 组织（切取 ≤24 h）安装于 Franz 池，角质层朝向给药室。施加 1 mL A/A-ES，受体室维持 37 °C。设定间隔后取组织，洗涤、匀浆，ALA 经透析 24 h 提取。AuNPs 经 ICP-MS 定量。2 h 暴露后组织超薄切片 TEM 成像。

HSF 体外 PDT/PTT

细胞培养

HSF 经胶原酶 I 消化患者 HS 活检组织分离，DMEM+10% FBS，37 °C、5% CO₂ 培养，传代 2–3 代使用。

生物相容性实验

HSF (2×10³ cells/well) 接触 ALA-ES、Au-ES 或 A/A-ES 系列稀释液（无 FBS 培养基）12 h。CCK-8 法测细胞活力。

PDT/PTT 过程

HSF (4×10⁴ cells/well) 孵育 14% v/v A/A-ES 或对照 6 h，洗涤后用 632 nm、40 mW/cm² He-Ne 激光照射 20 min。照射后 DMEM+10% FBS 培养 24 h 再行下游实验。

细胞内 PpIX 和 ROS 生成实验

CLSM (Leica TCS SP5) 可视化 PpIX 和 ROS。DCFH-DA 染料定量 ROS，PpIX 荧光在 405 nm 激发/635 nm 发射捕获。

凋亡与坏死实验

Annexin V-FITC/PI 双染后 BD FACSCalibur 流式细胞术测定凋亡坏死率。FlowJo 7.6 分析数据。

统计分析

数据以均值±SD 表示。Student t 检验判定显著性 (P<0.05)。

缩写

A/A-ES:

5-氨基乙酰丙酸/金纳米颗粒负载乙醇体囊泡

ALA:

5-氨基乙酰丙酸

ALA-ES:

ALA 负载 ES

ALA-PDT:

基于 ALA 的 PDT

Au-ES:

AuNPs 负载 ES

AuNPs:

金纳米颗粒

CLSM:

共聚焦激光扫描显微镜

DLS:

动态光散射

DMEM:

Dulbecco 改良鹰培养基

EE:

包封效率

ES:

乙醇体囊泡

FBS:

胎牛血清

HS:

增生性疤痕

HSF:

增生性疤痕成纤维细胞

ICP-MS:

电感耦合等离子体质谱

LSPR:

局域表面等离子体共振

PDT:

光动力治疗

PDT/PTT:

光动力/光热治疗

PpIX:

原卟啉 IX

PTT:

光热治疗

ROS:

活性氧

SEM:

扫描电子显微镜

TEM:

透射电子显微镜