黑磷纳米颗粒通过上调TG2促进外胚层间充质干细胞成骨分化

摘要

生物安全浓度的黑磷纳米颗粒（BPs）激活转谷氨酰胺酶2（TG2）并上调细胞外基质（ECM）成分，从而加速外胚层间充质干细胞（EMSCs）成骨分化。BPs表现出优异生物相容性和可降解性，是骨组织工程支架的有前景添加剂。体外实验中，BPs（2-4 µg/mL）显著增强成骨标志物（RUNX2、ALP、COL-I、OCN、OPN、BMP-2）而不影响增殖。TG2抑制消除这些效应，证实TG2依赖机制。这些发现支持BPs在骨再生策略中的临床潜力。

引言

有效骨修复需要具备骨传导、骨诱导和骨整合特性的材料。传统自体移植和异体移植来源有限且有感染风险。生物材料近期进展——特别是离子释放陶瓷和生物活性聚合物——改善了预后，但能天然提供磷酸盐并促进矿化的材料仍难觅。

黑磷（BP）作为层状二维同素异形体，因可调带隙、高载流子迁移率、快速降解为良性磷酸盐离子而受关注。前人工作显示BP纳米片通过提供磷酸盐供体增强矿化，但细胞机制理解不足。外胚层间充质干细胞（EMSCs）取自成年鼻黏膜，提供易获取、无创的多能细胞来源，可成骨分化。

我们研究BPs能否作为EMSCs成骨诱导线索，并阐明潜在通路，聚焦TG2——一种交联ECM蛋白并调节成骨细胞分化的关键酶。

材料与方法

黑磷纳米颗粒制备

块状BP（20 mg）分散于饱和NaOH/NMP，机械研磨，冰浴超声（6 h）。经100 µm过滤和高速离心（13000 rpm，10 min，4°C）得稳定BP悬液。动态光散射（DLS）确认粒径132 nm，Zeta电位-23.7 mV；扫描电镜（SEM）确认100-150 nm片层形貌。拉曼和XRD光谱验证BP相纯度。

EMSC分离与培养

麻醉成年Sprague-Dawley大鼠，收获鼻中隔黏膜。组织消化（0.25%胰蛋白酶，37°C，25 min）过100 µm筛。细胞在DMEM/F12+10% FBS、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素中扩增。第3代细胞用于所有实验；免疫荧光确认>95% nestin和vimentin表达。

成骨分化诱导

EMSCs以3000 cells/cm²接种，成骨培养基（10% FBS、0.1 mM地塞米松、0.2 mM抗坏血酸）诱导14天（不含β-甘油磷酸钠避免干扰）。碱性磷酸酶（ALP）和茜素红S（ARS）染色分别评估早期和晚期分化。RT-qPCR于第7、14天测定RUNX2、ALP、COL-I、OCN、OPN、BMP-2。

细胞活力与增殖

CCK-8实验评估BPs毒性（0-512 µg/mL）24 h后。Ki-67免疫染色定量增殖。≤32 µg/mL无细胞毒性；选2和4 µg/mL进行功能研究。

机制研究

Western blot定量TG2、纤连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）、OCN、OPN、COL-I。TG2中和抗体（10 µg/mL）确认通路参与。统计采用Student's t检验和ANOVA（p<0.05）。所有实验三重复。

结果

BPs表征

DLS显示窄粒径分布（100-200 nm，峰值132 nm）。Zeta电位-23.7 mV确认胶体稳定性。SEM图像与DLS一致。拉曼峰362.3、438.5、466.9 cm⁻¹确认BP结构；XRD显示平均晶粒尺寸102.7 nm。

EMSC表型

鼻黏膜免疫荧光显示固有层nestin⁺细胞。第3代EMSCs呈成纤维细胞形态，>95% nestin/vimentin阳性。成骨诱导下第28天ARS染色显示矿物沉积；脂肪诱导第21天油红O染色阳性。

生物相容性

CCK-8显示32 µg/mL以下无显著活力损失。Ki-67染色确认2和4 µg/mL增殖无变化。

BPs增强成骨分化

ARS染色显示2和4 µg/mL组钙结节更大、规则，较对照组显著（p<0.05）。第7天BP处理组ALP活性增加（2 vs 4 µg/mL间p>0.05）。RT-qPCR显示第14天BP组RUNX2、ALP、COL-I、OCN、OPN、BMP-2显著上调（p<0.01）。

TG2依赖机制

Western blot显示BP处理组细胞内和细胞外TG2约2倍增加。FN和LN水平也升高。TG2中和消除了BP诱导的ARS沉积、ALP活性及OCN、OPN、COL-I表达。这些数据确认BPs通过上调TG2和ECM重塑促进成骨。

讨论

本研究证实BPs在32 µg/mL以下安全融入EMSCs成骨微环境。纳米颗粒提供快速磷酸盐源促进矿化，同时激活TG2——一种交联ECM蛋白、调节整合素信号的多功能酶。由此产生的ECM富集（FN、LN、COL-I）可能增强细胞-基质相互作用，进一步驱动成骨承诺。这些发现与前人报道BP纳米材料通过递送磷酸盐离子和刺激成骨细胞活性加速骨修复一致。

尽管BP易氧化限制稳定性，但其快速降解为无害磷酸盐降低长期积累风险。仍需体内研究确认动物模型安全性和有效性，并优化支架设计以推进临床转化。

结论

通过可扩展研磨-超声工艺制备的黑磷纳米颗粒，在体外安全增强TG2介导的EMSCs成骨分化。结果支持其掺入组织工程骨支架。未来临床前工作应解决药代动力学、生物分布及骨缺损模型治疗效果。

数据与材料可用性

数据集可经通讯作者合理请求获取。