骨髓干细胞外泌体miR-133a通过抑制MAML1减轻病毒性心肌炎纤维化与EMT

摘要

心肌炎是一种以心肌局限性或弥漫性炎症为特征且缺乏有效治疗的疾病。本研究探讨了骨髓间充质干细胞来源外泌体（BMSC-Exo）分泌的微RNA-133（miR-133）通过调节主脑样1（MAML1）对病毒性心肌炎（VMC）大鼠心肌纤维化和上皮-间质转化（EMT）的调节机制。分离培养大鼠BMSCs鉴定其免疫表型及成骨/成脂能力，提取鉴定BMSC-Exo。外泌体经超速离心获取，透射电镜和Western blot鉴定。大鼠腹腔注射柯萨奇B3病毒建立VMC模型，分离培养心肌细胞按动物实验分组（NC^Exo、Ad-miR-133a^Exo、Adas-miR-133a^Exo）。体内外实验探究外泌体miR-133a和MAML1在炎症、凋亡、EMT、纤维化、细胞活力中的作用。双荧光素酶报告基因实验验证miR-133a与MAML1靶向关系。BMSC-Exo升高VMC大鼠miR-133a表达，有效改善心功能和心肌纤维化，增加心肌细胞活力抑制EMT。外泌体miR-133a上调增强改善效果。miR-133a沉默有效逆转BMSC-Exo对VMC大鼠作用。miR-133a靶向MAML1。抑制MAML1改善VMC大鼠心功能和心肌纤维化，可逆转miR-133a沉默外泌体对VMC大鼠作用。研究提示外泌体miR-133a上调通过下调MAML1抑制VMC大鼠心肌纤维化和EMT，从而抑制心肌炎进展。

引言

心肌炎被视为心肌细胞炎症性疾病，男性发病率显著高于女性。病毒性心肌炎（VMC）是导致年轻人扩张型心肌病（DCM）和猝死的主要因素。心肌炎临床表现多样，从无症状模糊体征到病毒和免疫细胞导致严重心肌破坏、心源性休克和心律失常。心肌炎可由多种感染因素诱导：病毒、细菌、衣原体、立克次体、真菌、原虫及非感染因素，其中病毒感染最常见，尤其儿童。柯萨奇B3病毒（CVB3）是导致心肌炎最关键病毒，可引起VMC发病机制中氧化应激反应和凋亡，但VMC特异性治疗尚无报道。且VMC发病机制未充分阐明，缺乏确切临床治疗，急需新靶点改善预后。

微RNA（miRNA）是可调控蛋白编码基因表达的内源性非编码RNA。miR-133a作为心脏特异性miRNA之一，涉及心脏发育和心肌梗死（MI）等心血管疾病。此外miR-133a在慢性查加斯病心肌病中异常表达。心肌miR-133a水平与炎症、左室功能及炎症性心肌病临床预后相关。外泌体在小鼠和人类肥大细胞中发现含miRNA。外泌体是大多数细胞类型释放的纳米囊泡，存在于多种生物流体中。外泌体可将货物转运至受体细胞，改变受体细胞生化组成和信号通路。证据显示改变的外泌体miRNA与CVB3诱导心肌炎发病机制相关。有研究表明缺氧调节骨髓间充质干细胞外泌体miR-125b-5p减少心肌细胞凋亡促进缺血性心脏修复。MSC外泌体miR-25-3p通过减少心肌细胞凋亡和炎症反应减轻心肌梗死。有趣的是外泌体心脏表达miR-133a与心肌肌钙蛋白I相关。主脑样1（MAML1）为本研究交叉筛选的miR-133a下游靶基因，报道涉及心肌缺血/再灌注（I/R）损伤。近期研究提示MAML1敲低在肝纤维化中具抗纤维化功能。

受前期研究启发，推测BMSC来源外泌体miR-133a能否调节心肌炎。本研究假设BMSC-Exo穿梭的miR-133通过调节MAML1改善VMC大鼠心肌纤维化和EMT。

材料与方法

伦理批准

经浙江大学医学院第四附属医院机构动物护理使用委员会批准。动物人道处理。

BMSCs分离

实验动物为成熟特定病原体自由（SPF）级Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（浙江大学医学院实验动物中心）。戊巴比妥钠腹腔注射安乐死，75%酒精消毒。超净台取出股骨和胫骨，去除肌肉结缔组织，低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）反复冲洗骨髓腔。液体离心收集沉淀，重悬培养24小时（每2-3天换液）。生长至对数期，0.25%胰蛋白酶（Gibco）消化，离心重悬于MSC培养液（Cyagen Biosciences，广州）。1:2比例传代，重复上述操作，第4代BMSCs用于后续实验。

BMSCs鉴定

第4代对数生长期BMSCs表面抗原经流式细胞术鉴定。0.25%胰蛋白酶（1 mL）含EDTA消化，离心，PBS重悬离心（151 g）。PBS含2%新鲜胎牛血清（FBS，Gibco）重悬制单细胞悬液。FITC-CD34、PE-CD29、PE-CD44单克隆抗体（各5 μL，BD Biosciences）孵育细胞悬液（100 μL），离心（151 g），PBS含1%多聚甲醛重悬固定30分钟。同型对照单克隆抗体鉴定背景标记。流式细胞术：单细胞悬液固定离心（151 g），PBS含1%多聚甲醛重悬，MACS Quart流式细胞仪检测，配套软件分析。

BMSCs成骨与成脂诱导

第4代BMSCs接种6孔板（200 cells/mL）。60-70%融合度加入成骨诱导液和成脂诱导液（Cyagen Biosciences）。另外两孔不加诱导液作对照。诱导14天，4%多聚甲醛固定。阿利新红染色和油红O染色（武汉普兰德生物技术）分别染色成骨细胞和成脂细胞，显微镜观察。

外泌体分离与鉴定

第4代BMSCs培养48小时收集上清，离心（800 g和2000 g），0.22 µm和100,000 MW滤膜过滤，超速离心（100,000 g）收集沉淀。PBS重悬沉淀，再超速离心（100,000 g）获外泌体沉淀。BCA法测定BMSC-Exo悬液浓度，Western blot检测外泌体标志蛋白（CD63、CD81、CD9）。

重组腺病毒感染介导BMSCs miR-133a基因修饰

BMSCs过夜传代。正常对照（等量PBS）、miR-133a阴性对照（NC）、miR-133a过表达（Ad-miR-133a）、miR-133a低表达（Adas-miR-133a）（汉生生物科技，上海）按100 MOI转染BMSCs。培养BMSCs，超速离心获相应外泌体（NC^Exo、NC^Exo、Ad-miR-133a^Exo、Adas-miR-133a^Exo）。

大鼠VMC模型建立与分组

成熟雄性SPF级SD大鼠分10组，每组8只。柯萨奇病毒B3（CVB3）由中国医学科学院医学生物技术研究所（北京）提供。腹腔注射CVB3（10 mg/kg），尾静脉注射PBS或BMSC-Exo（100 µg）。正常对照大鼠注射CVB3培养液和PBS。注射10 mg/kg CVB3大鼠进一步注射PBS、MSC^Exo、NC^Exo、Adas-miR-133a^Exo、Ad-miR-133a^Exo、si-NC或si-MAML1（瑞博生物，广州）。连续注射7天取眼球血，离心收集血清分装-20℃保存。大鼠安乐死取心脏标本，10%甲醛固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋切片组织学观察。部分切片-80℃保存分子生物学实验。

超声心动图检测

病毒注射第7天腹腔注射戊巴比妥钠25 mg/kg麻醉。肢体导联心电图机电极针皮下插入肢端记录肢体导联心电图。大鼠固定左侧卧位，胸部去毛，II导联心电图获取胸骨旁四腔心切面主动脉血流脉冲多普勒谱。指标含左室后壁厚度（LVPW）、左室收缩期内径（LVIDs）、左室短缩分数（FS）、左室射血分数（LVEF）。

苏木精-伊红（HE）染色

组织4%多聚甲醛固定、脱水、透明、石蜡包埋。4 µm切片脱蜡，苏木精（Servicebio，武汉）染色，1%盐酸酒精分化，复蓝，伊红染色，脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，光学显微镜（奥林巴斯，东京）观察。

马松胶原染色

石蜡切片脱蜡，苏木精染色<2分钟，丽春红染液染色，0.5%冰醋酸快速冲洗。1%磷酸铝水溶液染色，从深红至亮红至粉红，显微镜观察。茜素蓝（普兰德）染色，常规二甲苯脱水封片。Image-Pro Plus 6.0医学图像分析软件测量胶原纤维阳性染色面积，胶原容积分数（CVF）=胶原面积/总视野面积。区分染色位置颜色：心肌细胞红色，胶原纤维为细胞间隙蓝色条带或均质结构。

TUNEL染色

石蜡切片脱蜡，柠檬酸缓冲液中350 W烘烤10分钟。加50 µL TUNEL溶液，接50 µL转化酶-过氧化物酶，DAB显色，显微镜观察。苏木精复染，95%乙醇I-II、无水乙醇I-II、二甲苯I-II、封片。光学显微镜分析结果。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

ELISA试剂盒（博斯特生物技术，武汉）检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6。眼球血604 g离心取上清血清。细胞实验用培养上清离心上清。稀释标准品七个浓度梯度。空白孔加样品稀释液，另一孔加四甲基联苯胺（TMB），每浓度设两复孔。样品孔加50 µL样品稀释液和样品。各孔（除TMB孔）加100 µL一抗孵育1小时，加300 µL 0.01 M三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBS）和100 µL亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液（除TMB孔）。各孔加300 µL 0.01 M TBS孵育100 µL TMB。即时测量各孔光密度（OD）值和浓度，绘制标准曲线。

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

检测心肌组织和心肌细胞中miR-133a、胶原I、胶原III、α-SMA、TGF-β1、CTGF、E-cadherin、FSP-1表达。心肌细胞或组织总RNA用提取试剂盒（Takara，大连）提取，逆转录成cDNA。RT-PCR引物经Invitrogen（广州）合成，序列见表1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）或U6为内参，2^(-ΔΔCt)法分析相对基因表达量。

Western Blot分析

大鼠麻醉安乐死。心肌组织液氮冷冻研磨。蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟储备液按1:100混入细胞裂解液（贝时生物技术，上海）。混合液裂解样品提取细胞蛋白。BCA试剂盒测总蛋白浓度。5×上样缓冲液4:1混合，沸水浴10分钟，冰浴，离心。电泳分离，电转印至聚偏二氟乙烯（Servicebio）膜。5%脱脂奶粉封闭，加入一抗：CD63、CD81、CD9（兔抗大鼠多克隆抗体，Proteintech，1:100）、MAML1（ab65090，Abcam，美国，1:1000）、GAPDH（Santa Cruz，美国，1:1000）。加二抗辣根过氧化物酶标记IgG（Cell Signaling Technology，美国，1:1000），增强化学发光反应液（Pierce，美国）显影。以GAPDH为内参，ImageJ2x软件分析蛋白印迹图像。

心肌细胞培养与传代

取3-5日龄SD大鼠（浙江大学医学院实验动物中心）。预冷Hank平衡盐液冲洗心室部分，剪碎，0.25%胰蛋白酶消化。加适量10%完全培养基终止消化，151 g离心。含20% FBS的DMEM重悬细胞。差速贴壁法纯化心肌细胞，台盼蓝染色观察存活率，存活心肌细胞培养。24小时贴壁搏动，72小时伪足扩展。

心肌细胞VMC模型构建

选对数生长期第4代心肌细胞，感染MSC^Exo、NC^Exo、Adas-miR-133a^Exo、Ad-miR-133a^Exo。加100 Tcid50 CVB3病毒液（100 µL）诱导细胞VMC模型。同时等量维持液加对照组，感染1小时后加相应外泌体共培养47小时。

CCK-8细胞活力检测

CCK-8检测试剂盒（贝时）检测心肌细胞存活率。对数期细胞0.25%胰蛋白酶消化，96孔板接种2.5×10⁴ cells/孔。加CCK-8溶液（10 µL/孔），继续培养1-4小时，酶标仪测OD₄₅₀ nm值。

流式细胞术检测凋亡

Annexin V-APC/碘化丙啶（PI）双染法检测细胞凋亡。细胞离心，250 µL结合缓冲液（4 mL结合缓冲液+12 mL去离子水）重悬，调整至1×10⁶ cells/mL。100 µL细胞悬液加5 µL Annexin V-APC（BD Biosciences）和5 µL PI溶液（BD Biosciences），上机流式细胞仪，计算机自动分析。

双荧光素酶报告基因实验

MAML1 3'-非翻译区（UTR）野生型（wt）或突变型（mut）序列克隆入pGL3-M载体（Promega，美国），构建MAML1-3'-UTR-wt或MAML1-3'-UTR-mut。载体与miR-133a模拟物或NC共转染心肌细胞（Lipofectamine 2000）。48小时后双荧光素酶报告基因系统（Promega）检测荧光素酶活性。

RNA免疫共沉淀（RIP）实验

RIP试剂盒（Millipore，美国）检测MAML1与miR-133a结合。细胞用放射免疫沉淀分析缓冲液（P0013B，贝时，上海）裂解，1400 g离心，抗体孵育共沉淀。磁珠（50 µL）100 µL RIP洗涤缓冲液重悬，孵育5 µg抗MAML1抗体（1 µg/mL，ab155786）或IgG（1:100，ab172730）。磁珠-抗体复合物900 µL RIP洗涤缓冲液重悬，与100 µL细胞提取物相互作用，蛋白酶K消化，RT-qPCR检测。

统计分析

SPSS 21.0（IBM，美国）统计分析。测量数据表达为均值±标准差。两组比较用t检验。组间比较用单因素方差分析（ANOVA），Tukey事后检验两两比较。P<0.05为显著性标准。

结果

BMSCs和BMSC-Exo鉴定

显微镜下BMSCs呈纺锤形和圆形，漩涡或放射状贴壁生长（图1A）。油红O染色成脂诱导后第4代BMSCs脂滴红色，不同大小圆形脂滴（图1B）。成骨诱导后表达钙化结节细胞阿利新红染色红色，钙化结节分布不均、细胞重叠（图1C）。流式细胞术显示MSC标志CD29和CD44（>95%）表达，造干细胞表面抗原CD34（<95%）未表达（图1D）。表明BMSCs高纯度，符合国际细胞治疗学会MSC标准。

透射电镜观察BMSC-Exo为椭圆囊泡，外周膜结构清晰，大小不一，直径40-100 nm（图1E）。Western blot显示提取产物表达外泌体特征蛋白CD9、CD63、CD81（图1F）。

上调外泌体miR-133a改善心肌炎症状

BMSCs转染miR-133a重组腺病毒观察（图2A）。倒置荧光显微镜下观察到NC、Ad-miR-133a、Adas-miR-133a大量绿色荧光表达，表明重组腺病毒载体有效转染BMSCs。RT-qPCR检测BMSCs及其外泌体miR-133a表达测转染效率。miR-133a上调增加表达，下调减少表达（图2B）。随后注射含miR-133a外泌体于大鼠。倒置荧光显微镜观察NC^Exo、Ad-miR-133a^Exo、Adas-miR-133a^Exo处理VMC大鼠心肌组织有绿色荧光，表明重组腺病毒载体感染大鼠心肌组织（图2C）。RT-qPCR发现VMC大鼠miR-133a表达明显下降；注射Ad-miR-133a^Exo组miR-133a表达明显升高，注射Adas-miR-133a^Exo组下降（图2D）。大鼠整体状况：正常对照组正常；VMC组及Adas-miR-133a^Exo组明显表现VMC特征：毛发粗乱、呼吸困难、进食少。MSC^Exo、NC^Exo、Ad-miR-133a^Exo处理组症状不同程度改善。VMC大鼠感染后第1天起体重持续下降，注射MSC^Exo、NC^Exo、Ad-miR-133a^Exo组体重增加。Ad-miR-133a^Exo组体重明显增加，Adas-miR-133a^Exo组明显下降（图2E）。

心功能观察（图2F）：VMC大鼠LVPW和LVIDs增加，FS和LVEF下降。外泌体注射后VMC大鼠LVPW和LVIDs下降，FS和LVEF显著升高。Adas-miR-133a^Exo损害，Ad-miR-133a^Exo改善VMC大鼠心功能。

上调外泌体miR-133a抑制VMC大鼠心肌组织炎症

HE染色显示（图3A）：正常对照组心肌纤维紧密排列，间质无炎性细胞浸润。VMC组心肌细胞紊乱，间质大量炎性细胞浸润。MSC^Exo或NC^Exo组心肌细胞有序排列，间质少量炎性细胞浸润。Adas-miR-133a^Exo组心肌细胞紊乱，间质炎性细胞浸润。Ad-miR-133a^Exo组心肌细胞有序排列，无明显炎性细胞浸润。ELISA显示（图3B、C）：VMC组炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）明显升高。Ad-miR-133a^Exo组炎性因子水平降低。Adas-miR-133a^Exo组炎性因子升高。

上调外泌体miR-133a降低VMC大鼠心肌组织CVF

马松染色显示（图4A、B）：正常大鼠心肌纤维紧密排列，几乎无蓝色胶原纤维。CVB3注射后心肌细胞肥大、结缔组织增生、大量蓝色胶原纤维，CVF显著升高。外泌体处理后心肌细胞有序排列，细胞间结缔组织增生减少，蓝色胶原纤维和CVF明显降低。Adas-miR-133a^Exo组细胞间隙增宽、细胞明显增大、蓝色胶原纤维和CVF明显增加；Ad-miR-133a^Exo组细胞间隙减小、蓝色胶原纤维分布和CVF减少。

上调外泌体miR-133a降低VMC大鼠心肌组织胶原I、胶原III、TGF-β1、CTGF表达

胶原I和胶原III是胶原主要成分，主要分布于细胞连接、细胞膜、细胞间质、细胞质。TGF-β1和CTGF是纤维化标志蛋白。RT-qPCR结果显示（图5A-C）：VMC组胶原I、胶原III、TGF-β1、CTGF mRNA表达升高，外泌体处理后下降。Ad-miR-133a^Exo组上述指标mRNA表达下降，Adas-miR-133a^Exo组相反。

上调外泌体miR-133a抑制VMC大鼠心肌组织心肌细胞凋亡

TUNEL染色显示（图6A、B）：凋亡心肌细胞核浓缩呈褐黑或褐黄色。VMC组凋亡细胞数增加，外泌体处理减弱。Ad-miR-133a^Exo组凋亡细胞减少，Adas-miR-133a^Exo组增加。

上调外泌体miR-133a抑制VMC大鼠心肌组织EMT

E-cadherin、α-SMA、FSP-1为EMT关键指标。RT-qPCR结果显示（图7A、B）：VMC组α-SMA和FSP-1 mRNA表达升高，E-cadherin下降。外泌体处理后α-SMA和FSP-1下降，E-cadherin升高。Adas-miR-133a^Exo组α-SMA和FSP-1升高、E-cadherin下降；Ad-miR-133a^Exo组相反。

上调外泌体miR-133a抑制VMC心肌细胞炎症

荧光显微镜捕获NC^Exo、Ad-miR-133a^Exo、Adas-miR-133a^Exo处理VMC大鼠心肌细胞绿色荧光（图8A），表明重组腺病毒载体感染心肌细胞。RT-qPCR和ELISA发现（图8B、D）：VMC组miR-133a表达下降、炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）升高，外泌体处理可逆转。Ad-miR-133a^Exo组miR-133a上调、炎性因子下降；Adas-miR-133a^Exo组miR-133a下降、炎性因子升高。

上调外泌体miR-133a促进VMC心肌细胞活力、抑制凋亡

Annexin V-APC/PI双染和CCK-8检测凋亡和活力（图9A-C）。结果显示：VMC组心肌细胞凋亡率明显增加、活力下降。外泌体处理降低凋亡率、增强活力。Adas-miR-133a^Exo增强凋亡率、破坏活力；Ad-miR-133a^Exo作用相反。

miR-133a靶向MAML1

报道上调miR-193b通过靶向MAML1减轻心肌I/R损伤。基于此，通过生物信息学网站PITA、miRanda、PicTar、microT、miRmap交叉筛选miR-133a下游基因，选定MAML1为靶基因（图10A）。构建MAML1-wt或MAML1-mut，与miR-133a模拟物或NC共转染心肌细胞。结果显示miR-133a模拟物降低MAML1-wt荧光素酶活性（图10B）。RIP实验进一步验证miR-133a与MAML1靶向关系（图10C）。RT-qPCR和Western blot检测MAML1表达显示miR-133a模拟物转染心肌细胞后MAML1表达下降（图10D、E）。

抑制MAML1对心肌炎大鼠有保护作用并逆转miR-133a抑制外泌体对VMC大鼠作用

进一步研究miR-133a调节MAML1对VMC大鼠影响，向VMC大鼠或经miR-133a沉默外泌体处理的VMC大鼠注射si-MAML1或si-NC腺病毒。RT-qPCR和Western blot验证注射成功（图11A、B）。结果显示（图11C-G、图12A-E、图13A-G）：注射si-MAML1后VMC大鼠体重增加、心功能改善、心肌组织病理和纤维化减轻、血清炎症和心肌细胞凋亡抑制。且miR-133a沉默外泌体对VMC大鼠有害作用被si-MAML1注射逆转。

讨论

心肌炎是导致DCM和心衰的炎症性心脏疾病，最常由CVB3等病毒感染诱导。研究显示miR-133缓解VMC小鼠心肌细胞凋亡和电重构。改变的外泌体miRNA也与CVB3诱导心肌炎发病机制相关。心脏祖细胞外泌体通过抑制CVB3增殖缓解VMC心肌细胞凋亡。本研究探讨BMSC外泌体miR-133调节VMC大鼠心肌纤维化和EMT机制（附件1：图1）。

研究发现VMC中miR-133a表达下降。前证实MI中miR-133a表达下降。研究也提示VMC小鼠心脏miR-133相对表达显著低于对照。miRNA与外泌体有联系。疾病中外泌体和外泌体miRNA差异表达被视为无创临床诊断生物标志物及治疗潜力。Lin等发现miR-133特异性分选入缺氧/再氧合（H/R）诱导人内皮祖细胞外泌体促进成纤维细胞血管生成和EMT。另研究揭示MSC通过外泌体转运miR-133b与脑实质细胞通讯调节神经突生长。

本工作主要发现：上调外泌体miR-133a促进细胞活力，抑制VMC大鼠炎症、凋亡、EMT、纤维化。符合前研究：miR-133a沉默逆转黄芪多糖诱导骨肉瘤MG63细胞增殖抑制和凋亡促进。另研究显示过表达miR-133a抑制血管生成、凋亡、纤维化、炎症，加速缺血性心脏病治疗性心脏重构。类似本研究，Li等称miR-133通过调节VMC小鼠心脏凋亡相关基因表达抑制心肌细胞凋亡。过表达miR-133a抑制缺氧诱导凋亡、增强心肌细胞存活。上调血清外泌体miR-30a和miR-181d有潜力作为VMC诊断生物标志物。

另一发现：上调外泌体miR-133a降低VMC大鼠CVF、减少胶原I和胶原III表达。文章阐释胶原膜释放成纤维细胞生长因子-18参与下调miR-133a的成骨活性。体外miR-133a过表达抑制心肌细胞肥大、减少胶原表达。CVF=胶原面积/(心肌面积+胶原面积)，平均值反映切片CVF。Wang等也报道CVB3感染成功构建VMC小鼠模型，CVF表达显著高于对照。该发现与Ferreira等一致：miR-133a在慢性查加斯病心肌病发病机制基因表达调节中起主要作用，潜在诊断预后工具。证据显示敲低MAML1可减轻预处理心肌细胞肥大。本研究发现MAML1为miR-133a靶基因，抑制MAML1逆转miR-133a沉默外泌体对VMC大鼠作用。心肌缺血-再灌注损伤中，miR-193b介导MAML1下调部分减少梗死和心肌酶、减轻心肌细胞凋亡。也有报道提示MAML1缺陷可缓解肝纤维化生成。

结论

综上，本研究证实VMC大鼠miR-133a下调，上调外泌体miR-133a通过靶向MAML1改善心功能、抑制心肌纤维化和EMT，增强心肌细胞活力、抑制凋亡。抑制MAML1对心肌炎大鼠有保护作用，逆转miR-133a抑制外泌体对VMC大鼠作用。外泌体miR-133a在心肌纤维化和EMT中的鉴定可拓宽对心肌炎机制理解，并作为新型分子靶点具有临床价值。需更多研究深入治疗该疾病。