磁性聚（N-异丙基丙烯酰胺）纳米复合材料：制备方法对抗菌性能的影响

背景

磁性热敏聚合物纳米复合材料已被用于广泛的应用，包括水处理和纳米医学 [1,2,3,4]。每种纳米复合材料都经过专门设计，可受益于两种成分（即磁性粒子和温度响应聚合物）固有特征的组合，从而创造出更加具体和可控的纳米复合材料。磁铁矿 (Fe3O4) 纳米颗粒赋予磁性，允许在施加外部磁场后快速轻松地分离 [5]。聚 (N-异丙基丙烯酰胺) (PNIPAAm) 形成一种三维水凝胶，当在 10 ℃加热时，该凝胶经历可逆的低临界溶解温度 (LCST) 相变，从具有膨胀水合状态的单个线圈到塌陷和收缩的脱水状态 [6]。高于 32°C 的水。用 PNIPAAm 层覆盖磁性纳米粒子不仅提供了在水中的胶体稳定性，而且还允许通过与其他分子（如药物、蛋白质或酶）结合来实现表面功能 [7]。双响应纳米复合材料的构建是通过结合同时响应温度和磁性组合的两种特性来实现的。用于合成 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料的最常用方法是物理加成、原位沉淀和乳液聚合。物理添加是最简单的方法，需要将先前合成的磁性纳米粒子和 PNIPAAm 粒子进行物理混合。第二种方法，原位沉淀，涉及在 PNIPAAm 纳米聚合物存在下沉淀磁性纳米粒子 [8]。第三个（也是最常见的）途径，乳液聚合，需要在磁性纳米粒子的存在下聚合（N-异丙基丙烯酰胺）单体 [9,10,11]。 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料已广泛用于生物医学和生物技术应用。需要高度稳定、可控且分散良好的磁性纳米粒子，以提高此类纳米复合材料在未来应用中的适用性。最近的一项创新涉及外部磁场，该磁场为自热粒子产生局部热源，导致 PNIPAAm 收缩，进而允许释放封装的药物 [12]。这种现象，再加上针对肿瘤的磁珠，开辟了其他潜在的癌症疗法，如热疗。热疗可以通过在振荡磁场中以千赫兹到兆赫兹的频率振荡纳米粒子来启动。最近合成了其他 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料，以控制生物活性分子（如肌红蛋白或维生素 B12）的释放，并用于药物递送 [13]。最近使用 PNIPAAm 涂层的超顺磁性 Fe3O4 纳米粒子的一项研究能够表明，氧化铁纳米粒子的热诱导聚集大大增加了磁共振成像过程中的 T2 对比度 [14]。显然，Fe3O4-PNIPAAm 在生物医学和生物技术应用的未来发展中显示出巨大的前景。因此，进一步研究该材料的生物相容性及其抗菌作用具有重要意义。

在本研究中，我们研究了三种制备方法对 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料物理化学性质的影响。在此过程中，我们的目标是评估生产纳米复合材料的最方便的制备方法，该纳米复合材料具有增强的生物应用特性。我们还首次使用多端点方法描述了三种 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料的抗菌作用、细菌生长速率、活力、细胞形态和 DNA 损伤水平。

方法

化学品

氯化铁 (III) 六水合物 (FeCl3.6H2O, ≥ 98%)、氯化铁 (II) 四水合物 (FeCl2.4H2O, ≥ 99%)、氢氧化铵（26% NH3 in H2O）、N-异丙基丙烯酰胺 (NiPAM, ≥ 99%）、N,N-亚甲基双（丙烯酰胺）（BIS，≥ 99%）、十二烷基硫酸钠（SDS，≥ 99%）和过硫酸铵（APS，≥ 98.5%）均新鲜购自 Sigma-Aldrich，德国。

通过乳液聚合制备 PNIPAAm

将 NiPAM (4 g)、BIS (0.2 g) 和 SDS (0.3 g) 在 70°C 下在大气氮气中溶解在 350 ml 的去离子水 (DI) 中。将 APS (0.0035 g) 溶解在 1 ml DI 中并加入到反应容器中以开始反应。 4小时后，停止反应并用去离子水洗涤制备的颗粒。最后，PNIPAAm 纳米颗粒通过离心（12,000 rpm 30 分钟）分离并用于进一步的反应。

磁铁矿 (Fe3O4) 纳米颗粒的制备

将 FeCl2·4H2O（1.9 克）和 FeCl3·6H2O（5.4 克）（摩尔比 1:2）溶解在 DI（100 毫升）中并加热至 70°C。将氢氧化铵（NH4OH；6ml）快速加入溶液中，立即产生深黑色磁性沉淀。最后，将 Fe3O4 纳米颗粒悬浮液在 70°C 下搅拌 30 分钟。产物用 DI 洗涤数次，然后将 Fe3O4 纳米颗粒在旋转蒸发器（25 毫巴，40°C）中干燥，直至形成细粉。这用于所有进一步的反应。

通过乳液聚合制备磁性 PNIPAAm 纳米复合材料 (Fe3O4-PNIPAAm-1)

NiPAM (0.4 g)、新鲜制备的 Fe3O4 纳米粒子 (0.2 g)、BIS (0.2 g) 和 SDS (0.3 g) 溶解在 350 ml DI 中并在氮气气氛下加热至 70°C。然后将 APS (0.0035 g) 溶解在 1 ml DI 中并加入到反应容器中以开始反应。 4 小时后，停止反应并用去离子清洗制备的纳米复合材料。最后，通过离心（12,000 rpm 30 分钟）分离出 Fe3O4-PNIPAAm-1，然后使用旋转蒸发器（25 毫巴，40°C）干燥。粉状物料室温避光保存。

通过原位沉淀法制备磁性 PNIPAAm 纳米复合材料 (Fe3O4-PNIPAAm-2)

将 FeCl2 (0.148 g)、FeCl3 (0.4 g) 和 10 ml DI 充分混合并添加到 1 g PNIPAAm 中。然后将 NH4OH (3ml) 快速加入溶液中，立即产生深黑色磁性沉淀。然后将悬浮液在 70°C 搅拌 30 分钟。制备的纳米复合材料用 DI 洗涤，然后通过离心（12,000 rpm 30 分钟）分离出 Fe3O4-PNIPAAm-2，并使用旋转蒸发器（25 毫巴，40°C）干燥。所得粉末室温避光保存。

通过物理添加制备磁性 PNIPAAm 纳米复合材料 (Fe3O4-PNIPAAm-3)

将新鲜制备的 PNIPAAm (1 g)、新鲜制备的 Fe3O4 纳米粒子 (0.5 g) 和 DI (5 ml) 充分混合，并将所得悬浮液在 70°C 下搅拌 30 分钟。如此制备的纳米复合材料用 DI 洗涤，然后通过离心（12,000 rpm 30 分钟）分离出 Fe3O4-PNIPAAm-3，并使用旋转蒸发器（25 毫巴，40 ℃）干燥。粉状物料室温避光保存。

纳米复合材料表征

Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料的尺寸和 zeta 电位在纳米颗粒完全溶解在 DI 中后进行测量（分散在 DI 中，然后在室温下超声处理 2 分钟）。 Zeta 电位测量使用 Zetasizer Nano 分析仪（Malvern Instruments，美国）在 pH 7 下进行。Zetasizer Nano 动态光散射 (DLS) 装置用于测量 DI 中颗粒聚集体的流体动力学直径。进行热重分析 (TGA) 以量化涂层量并确定纳米复合材料的热稳定性。在 25 至 900°C 的温度范围内，使用 TGA Q500（TA Instruments，美国）在氮气氛（加热速率 10°C/分钟）下对 3-4 毫克干样品进行热研究。使用 MicroMag™ 2900 振动样品磁力计（美国普林斯顿测量公司）测量材料的磁性。使用扫描电子显微镜 (SEM) 获得显微图像，首先将颗粒完全溶解在 DI 中，然后将一滴溶液置于配备肖特基阴极的 Zeiss ULTRA Plus 场发射 SEM 的铜栅上。使用 Smart SEM 软件 v 5.05（Zeiss，德国）对所有图像进行分析，以在 1.5 kV 下进行成像。

细菌菌株和培养基

革兰氏阴性大肠杆菌 CCM3954 和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌 CCM 3953（布尔诺，捷克共和国）用于所有实验。 “捷克微生物保藏中心”(http://www.sci.muni.cz/ccm/) 的网页上提供了有关菌株的详细信息。在进行生物实验之前，每种细菌培养物都是新鲜制备的，并在大豆营养肉汤（Sigma-Aldrich）中过夜。

DNA 损伤

彗星试验是按照 Singh 等人的方法进行的。 [15] 和 Solanky 等人。 [16]。除非另有说明，所有化学品均购自 PENTA（捷克共和国）。新鲜细菌培养（调整为 10 ⁷ 细胞/毫升）培养过夜，然后与两种浓度（0.1 和 1 克/升）的 PNIPAAm 和每种 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料在 37°C 下孵育 30 分钟。

通过将 100 毫升琼脂糖放在载玻片的磨砂表面上并用 24 × 50 毫米盖玻片 (ThermoFisher Scientific, USA) 覆盖来制备微凝胶。将载玻片在室温下放置 5 分钟，然后移除盖玻片并使载玻片干燥。该干燥的琼脂糖层（第一层）为后续层提供了坚实的基础。将细菌暴露于 PNIPAAm 和 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料 30 分钟后，取出 2 μl（包含大约 10,000 个暴露的细胞）并与 100 μl 新鲜制备的 0.5% 琼脂糖混合。将该混合物移液到磨砂载玻片上并立即用盖玻片覆盖（第二层）。然后将载玻片在冰上的钢托盘中冷却。 1 分钟后取下盖玻片，加入第三层 100 μl 裂解琼脂糖（包括 0.5% 琼脂糖和 5 μg/ml RNAse A [Ameresco, USA]、0.25% N-月桂酰肌氨酸钠和 0.5 mg/ml 溶菌酶）再次使用盖玻片生产。然后将载玻片置于冰上 10 分钟，然后放入 37°C 的潮湿室中 30 分钟。取下盖玻片后，将载玻片浸入含有 2.5 M NaCl、100 mM EDTA 四钠盐、10 mM tris 缓冲液（pH 10）、1% 月桂酰肌氨酸钠和 1% Triton X-100 的裂解溶液中。在室温下裂解 1 小时后，将载玻片转移到含有 2.5 M NaCl、10 mM EDTA 和 10 mM tris pH 7 的酶消化溶液中。含有 1 mg/ml 蛋白酶 K 的四种缓冲液。然后将载玻片转移到在 37°C 下孵育 2 小时，然后将它们放置在电泳装置（Scie-plas，UK）的水平板上并用 300 mM 醋酸钠和 100 mM pH 9 tris 缓冲液平衡 20 分钟，然后在12 V（0.4 V/cm，大约 100 mA）持续 30 分钟。电泳后，将载玻片浸入乙醇中的 1 M 乙酸铵（5 ml 10 M 乙酸铵和 45 ml 无水乙醇）20 分钟，无水乙醇 0.5 小时和 70% 乙醇 10 分钟，然后将载玻片浸入在室温下风干。为实现均匀染色，用 50 毫升新鲜制备的 5% TE 缓冲液和 10 mM NaH2PO4 溶液预处理载玻片。然后将载玻片用 50 μl 新制备的 1 mM SYBR 染料（Sigma-Aldrich，美国）在 TE 缓冲液中的溶液染色 30 分钟。 DNA 链断裂（彗星）的迁移使用 AxioImager 荧光显微镜在 × 400 放大倍数和 AxioVision v 4 软件（Zeiss，德国）进行可视化。通常，每个样品都单独测量了 50 颗彗星的尾长。

细菌生长率、细胞活力和形态

实验方案遵循 Darwish 等人描述的方案。 [17]。简而言之，将 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料悬浮液 (10 g/l) 添加到新鲜细菌培养物中，以获得 0.01、0.05、0.5 和 1 g/l 的最终浓度。每个浓度在 24 孔板中一式三份产生。平行运行阴性对照，仅由生长培养基中的细菌细胞和仅生长培养基中的 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料组成。然后将板在 37°C 下孵育，然后使用 Synergy™ HTX 读板器（Biotek，美国）每 2 小时在 600 nm (OD600) 处测量样品的光密度，持续 6 小时。细菌生长速率定义为 OD600 测量值（吸光度单位，AU）与孵育时间（小时）的 R 线性回归。对不含细胞的纳米复合材料样品的初步测量（600 nm 下 6 小时）显示出恒定的吸光度值，不会干扰用细菌细胞测量的纳米复合材料的吸光度值。

纳米复合材料在 10% 抑制 (EC10) 对细菌生长速率 (µ) 的有效浓度 ) 是根据以下等式计算每种形式的 Fe3O4-PNIPAAm：I (%) =(µ C -μ T )/μ C ×100，其中 I 是抑制，µ C 是平均对照增长率值和μ T 是纳米复合材料对培养物的生长速率的影响[18]。

孵育 24 小时后，使用 L7007 细菌活力试剂盒（Molecular Probes，Invitrogen，美国）在黑暗中对每个样品的 100 μl 等分试样染色 15 分钟。活细胞 (Ex/Em 485/528 nm) 和死细胞 (Ex/Em 485/645 nm) 的比例使用 Synergy™ HTX 读板器（Biotek，美国）进行测定。死细胞的百分比计算为死细胞与活细胞的比率。与此同时，E.大肠杆菌 和S。金黄色葡萄球菌 使用具有 Ex/Em 470/490-700 nm 的 AxioImager 荧光显微镜（Zeiss，德国）获得。 E 的长度。大肠杆菌 S 的细胞和面积。金黄色葡萄球菌 使用AxioVision v 4软件（Zeiss，Germany）在× 600放大倍数下确定细胞簇。

统计分析

使用方差分析和 Dunnett 检验（GraphPad PRISM，美国）测试了在 PNIPAAm、不同 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料和不含纳米复合材料的对照样品中培养的细菌菌株之间的差异。

结果

在这项研究中，我们采用三种不同的方案合成了 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料：乳液聚合 (Fe3O4-PNIPAAm-1)、原位沉淀 (Fe3O4-PNIPAAm-2) 和物理添加 (Fe3O4-PNIPAAm-3)。 SEM 成像表明，所使用的协议类型对样品形态和粒径有明显影响，Fe3O4-PNIPAAm-1、Fe3O4-PNIPAAm-2 和 Fe3O4-PNIPAAm-3 显示出较宽的尺寸分布，由于高表面能导致团聚纳米粒子之间存在磁偶极相互作用( 图 1 ) .

PNIPAAm (a ), Fe3O4-PNIPAAm-1 (b ), Fe3O4-PNIPAAm-2 (c ) 和 Fe3O4-PNIPAAm-3 (d ）。比例尺 =200 nm

TGA 表明 Fe3O4-PNIPAAm 样品在高于 400°C 的温度下变得相对稳定（图 2）。总体而言，PNIPAAm 纳米颗粒的残留含量低于 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料。表面电荷的 Zeta 电位值对于 PNIPAAm 为 - 1.58 mV，对于 Fe3O4-PNIPAAm-1 为 - 15.6 mV，对于 Fe3O4-PNIPAAm-2 为 - 16.4 mV，对于 Fe3O4-PNIPAAm-3 为 - 1.8 mV。 Fe3O4-PNIPAAm-1 的振动样品磁强计值为 50.4emu/g，Fe3O4-PNIPAAm-2 为 53.7emu/g，Fe3O4-PNIPAAm-3 为 21.0emu/g。高于 (45°C) 和低于 (25°C) LCST 的动态光散射表明 PNIPAAm 在 25°C 下为 50 nm，在 45°C 下为 27 nm； Fe3O4-PNIPAAm-1 在 25°C 下为 412 nm，在 45°C 下为 197 nm； Fe3O4-PNIPAAm-2 在 25°C 下为 212 nm，在 45°C 下为 130 nm，Fe3O4-PNIPAAm-2 在 25°C 下为 122 nm，而 Fe3O4-PNIPAAm-3 在 45°C 下为 60 nm（图 3）。

PNIPAAm(a)、Fe3O4-PNIPAAm-1(b)、Fe3O4-PNIPAAm-2(c)和Fe3O4-PNIPAAm-3(d)的热重分析

动态光散射低于 (25 °C) 和高于 (45 °C) PNIPAAm (a) 的下临界溶解温度相变 ), Fe3O4-PNIPAAm-1 (b ), Fe3O4-PNIPAAm-2 (c ) 和 Fe3O4-PNIPAAm-3 (d )

Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料对细菌 DNA 的影响

在 30 分钟的短时间暴露后，确定了两种 E. 的 DNA 链断裂。大肠杆菌 和S。金黄色葡萄球菌 在用 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料、40% EtOH（阳性对照）和未处理细胞（阴性对照）处理的细胞中。所有 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料都表现出类似的显着效果 (P <0.001) 平均 E。大肠杆菌 和S。金黄色葡萄球菌 与没有纳米复合材料孵育的对照细胞相比，所有浓度下的彗尾长度（图 4）。

大肠杆菌的一个例子 彗尾, 用 Fe3O4-PNIPAAm-3 (a ）。 大肠杆菌的DNA链断裂结果（彗尾长度） (b ) 和金黄色葡萄球菌 (c ) 与 40% EtOH（阳性对照）、无纳米复合材料（阴性对照）、PNIPAAm（0.1 和 1 g/l）和 (1) Fe3O4-PNIPAAm-1、(2) Fe3O4-PNIPAAm-2 和(3) Fe3O4-PNIPAAm-3（误差棒代表50个单元彗星长度的SD）。显着性水平***P <0.001

Fe3O4-PNIPAAm纳米复合抗菌效果

生长率表明革兰氏阳性 S。金黄色葡萄球菌 抵抗力低于革兰氏阴性 E。大肠杆菌 暴露 6 小时后的所有纳米复合材料。与 PNIPAAm 和 Fe3O4-PNIPAAm-3 相比，Fe3O4-PNIPAAm-1 和 Fe3O4-PNIPAAm-2 均能强烈抑制细菌生长，同时具有E。大肠杆菌 增长率从 0.08 显着降低到 0.028 (P <0.001) 与 Fe3O4-PNIPAAm-2 和 0.005 (P <0.001) 与 Fe3O4-PNIPAAm-1 (1 g/l)。未观察到对E的影响。大肠杆菌 PNIPAAm 或 Fe3O4-PNIPAAm-3 的增长率（图 5a）。相比之下，S 的增长率。金黄色葡萄球菌 受所有 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料和 PNIPAAm 纳米颗粒的影响。在较低浓度（0.01 克/升和 0.05 克/升）下，生长率仅从 0.07 略微降低至 0.06 (P <0.05）。然而，在较高浓度（0.5 和 1 g/l）下，PNIPAAm 从 0.07 显着降低到 0.001，Fe3O4-PNIPAAm-1 从 0.0 显着降低，Fe3O4-PNIPAAm-2 从 0.01 显着降低，Fe3O4-PNIPAAm-3 从 0.009（所有 P <0.001；图 5b)。此外，对于S，所有Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料和PNIPAAm 纳米颗粒对照的EC10 较低。金黄色葡萄球菌 比 E 的那个。大肠杆菌 （表 1）。

大肠杆菌的相对生长率 (a ) 和金黄色葡萄球菌 (b ) 在不同浓度 (0.01、0.05、0.5 和 1 g/l) 的 PNIPAAm（红色圆圈）、Fe3O4-PNIPAAm-1（橙色菱形 [1]）、Fe3O4-PNIPAAm-2（绿色三角形 [ 2]) 和 Fe3O4-PNIPAAm-3（蓝色三角形 [3]）。误差条显示从 n 计算的 SD =3. 显着性水平 ***P <0.001

死亡E的百分比。大肠杆菌 24 小时后，细胞随着 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料浓度的增加而增加。例如，PNIPAAm（0.5 和 1 克/升）会导致 E 显着增加。大肠杆菌 与没有 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料的培养物 (12%) 相比，死细胞 (20%)。 Fe3O4-PNIPAAm-1 (0.5 g/l) 导致高达 28% 的死E。大肠杆菌 细胞和 32% 在 1 g/l (P <0.001)。 Fe3O4-PNIPAAm-2 的作用低于 Fe3O4-PNIPAAm-1 和 Fe3O4-PNIPAAm-3，当暴露于 0.01 和 1 g/l 的浓度时，死细胞的百分比分别从 13% 增加到 25% (P <0.001)。在 0.5 和 1 g/l 时，Fe3O4-PNIPAAm-3 导致大约 25% 的死细胞（P <0.001；图 6a)。死亡S的百分比。金黄色葡萄球菌 细胞仅受到 1 g/l Fe3O4-PNIPAAm-1 和 Fe3O4-PNIPAAm-3 的显着影响，死细胞分别达到 50% 和 48% (P <0.001)。没有纳米复合材料的对照含有大约 18% 的死细胞，而在较低浓度的 PNIPAAm、Fe3O4-PNIPAAm-1 和 Fe3O4-PNIPAAm-3 中，死细胞的比例甚至更低。浓度为 0.5 和 1 g/l 的 PNIPAAm 产生 25% 和 30% (P <0.005) 死细胞，分别。 Fe3O4-PNIPAAm-2 对S 没有影响。金黄色葡萄球菌 培养（图 6b）。

死亡大肠杆菌的百分比 (a ) 和金黄色葡萄球菌 (b ) 暴露于 PNIPAAm 和 (1) Fe3O4-PNIPAAm-1、(2) Fe3O4-PNIPAAm-2 和 (3) Fe3O4-PNIPAAm-3 24 小时后的细胞。误差线显示 n 的 SD =3. 显着性水平 *P <0.05, **P <0.005, ***P <0.001

平均E 没有差异。大肠杆菌 细胞长度 (5 μm) 和平均 S。金黄色葡萄球菌 细胞簇面积 (200 μm ² ）对于任何纳米复合材料或最低浓度的 PNIPAAm 对照（0.1 g/l；图 7）。在较高浓度下，E.大肠杆菌 在 Fe3O4-PNIPAAm-2 存在下，长度没有变化，S 也没有变化。金黄色葡萄球菌 Fe3O4-PNIPAAm-1 存在下的细胞群面积。然而，E。大肠杆菌 在 1 g/l PNIPAAm (5.4 μm, P <0.005), Fe3O4-PNIPAAm-1 (6 μm, P <0.001) 和 Fe3O4-PNIPAAm-3（10 μm，P <0.001)（图 7a），而 S。金黄色葡萄球菌 当暴露于 PNIPAAm (1937 μm ² , P <0.001), Fe3O4-PNIPAAm-2 (924 μm ² , P <0.001) 和 Fe3O4-PNIPAAm-3 (1722 μm ² , P <0.001)（图 7b）。

大肠杆菌的长度 单元格 (a )和金黄色葡萄球菌簇的面积 单元格 (b ) 与 PNIPAAm 和 (1) Fe3O4-PNIPAAm-1、(2) Fe3O4-PNIPAAm-2 和 (3) Fe3O4-PNIPAAm-3 孵育 24 小时后。误差条显示从 n 确定的 SD =50. 显着性水平 **P <0.05 和 ***P <0.001

讨论

合成方法和将磁性纳米粒子添加到聚合物基质中的方法对磁性 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料的内在物理化学性质都有明显的影响。逐步合成对纳米复合材料的性能有很大影响，导致颗粒形状、尺寸分布、尺寸和表面化学的变化，以及随后磁性能的变化 [19, 20]。乳液聚合 (Fe3O4-PNIPAAm-1) 是一种简单而精确的方法，可生产出具有窄粒径分布和最低聚集趋势的稳定纳米复合材料，这些特性在生物医学应用中尤为重要 [17]。由于空间和库仑排斥的结果，颗粒尺寸足够小，可以避免沉淀[21]。最不有效的方法是物理添加 (Fe3O4-PNIPAAm-3)。它不仅是通过三个不同的步骤生产的，因此需要更长的时间来制备，所得纳米复合材料比其他两种生产方法中的任何一种都表现出更高的聚集度。此外，我们的结果表明，以这种方式生产的 Fe3O4-PNIPAAm-3 可能含有不良的 PNIPAAm 和 Fe3O4 纳米颗粒残留物。

聚合物可以通过物理（非共价）键或共价键连接到磁性纳米粒子上，根据所采用的合成途径，所得杂化材料会显示出特定的特性。当在发生混合纳米颗粒形成的溶剂中进行制备时，磁性纳米颗粒会发生显着的再悬浮，因此聚集和分离可能成为问题。在这种情况下，在许多情况下，磁性纳米颗粒的原位形成可能是更好的选择。此外，如果表面活性剂浓度太低，聚结会改变液滴的大小，而如果浓度太高，则会形成胶束，导致胶束成核。在这方面，重要的是根据表面性质和颗粒改性程度的精确表征仔细选择表面活性剂浓度，以确保无机颗粒表面与聚合物基体相容。

为了评估 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料的磁性能，了解纳米复合材料中 MNP 的含量非常重要。 TGA 用于量化 MNP 的量并研究 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料与单独的 PNIPAAm 纳米颗粒相比的热稳定性。所有三种 Fe3O4-PNIPAAm 纳米复合材料都显示出比 PNIPAAm 纳米颗粒更高的热稳定性，这可能是由于基体中存在 Fe3O4 颗粒（图 2）。磁性纳米复合材料中较高的残留可能归因于样品中无机 Fe3O4 化合物的存在，即使在更高的温度下也能持续存在。

Fe3O4-PNIPAAm-1 表现出最高的热纳米复合材料稳定性，以及最低的重量损失。高达 200°C，重量损失的主要来源是水分流失和聚合物层的物理吸附 [22]；然而，在 200°C 以上，损失主要是由于与 PNIPAAm 结合的化学层的分解。样品残留物在 400°C 以上变得稳定，占原始重量的 87%，这与纳米复合材料中磁性纳米粒子的量相对应。该制备过程的一个目的是生产一种具有磁性的纳米复合材料，可防止聚集并使其在磁场关闭后立即重新分散。这些特性将使其可用于一系列不同领域，包括肿瘤的热疗、作为磁共振成像中的造影剂、组织修复、生物医学设备涂层、免疫测定、细胞分离和生物分子的生物磁性分离 [18, 23,24] ,25,26]。我们通过磁化饱和度测试了我们的纳米材料，该方法评估了物质的最大可能磁化强度，超过该磁化强度时，尽管磁场增加，但不会发生进一步的变化。我们的结果表明 Fe3O4-PNIPAAm-2 在测试的三种纳米复合材料中具有最高的磁化饱和水平。我们的值 (53.7 emu/g) 低于先前报道的未涂覆 Fe3O4 纳米粒子 (92 emu/g) [27]，然而，大概是由于磁自旋矩中的表面有序/无序相互作用以及纳米复合材料重量和由于PNIPAAm聚合物层的存在而体积变大。

Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe3O4-PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe3O4-PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe3O4 magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe3O4-PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].

SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe3O4-PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe3O4-PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe3O4 nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].

All Fe3O4-PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E.大肠杆菌 growth rate in the order Fe3O4-PNIPAAm-1 > Fe3O4-PNIPAAm-2 > Fe3O4-PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S. aureus growth rate as Fe3O4-PNIPAAm-1 > Fe3O4-PNIPAAm-2 > Fe3O4-PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].

In comparison with the modified Fe3O4 nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E.大肠杆菌 and S. aureus , with S. aureus EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe3O4 (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe3O4-PNIPAAm-1 and Fe3O4-PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S. aureus was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E.大肠杆菌 and S. aureus corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.

Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E.大肠杆菌 cell length caused by Fe3O4-PNIPAAm-3 > Fe3O4-PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe3O4-PNIPAAm-2, and Fe3O4-PNIPAAm-3 > Fe3O4-PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe3O4-PNIPAAm-1 for S. aureus 聚类。 This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E.大肠杆菌 cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S. aureus , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe3O4-PNIPAAm-2 and Fe3O4-PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S. aureus biofilm was produced when in contact with Fe3O4-PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S。 aureus usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].

S。 aureus cell culture without nanocomposites (a ) and the cells embedded in biofilm after incubation with nanocomposites for 24 h (b ）。 The scale bar is 10 μm

Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe3O4-PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E.大肠杆菌 and S. aureus DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe3O4) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.

Conclusions

Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe3O4-PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe3O4-PNIPAAm-2) and physical addition (Fe3O4-PNIPAAm-3). Both Fe3O4-PNIPAAm-1 and Fe3O4-PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe3O4-PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe3O4-PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E.大肠杆菌 and S. aureus DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe3O4-PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E.大肠杆菌 and Gram-positive S. aureus .

缩写

Fe3O4-PNIPAAm:

Magnetic poly(N-isopropylacrylamide)

MNPs:

Magnetite nanoparticles