基于叶酸和 gH625 肽的 Fe3O4 磁性纳米颗粒功能化增强细胞内化的比较

背景

血脑屏障 (BBB) 是血液和大脑之间的动态界面，在维持中枢神经系统 (CNS) 稳态方面起着至关重要的作用。 BBB 的主要成分是内皮细胞（即星形胶质细胞和周细胞），它们形成覆盖大脑微血管内表面的连续片。它们通过紧密连接相互连接，这对于控制 BBB 血管通透性 [1] 和保护大脑免受各种循环毒素和其他有害分子的侵害至关重要 [2, 3]。神经元和小胶质细胞是其他神经血管单位成分，在 BBB 中发挥着不同的作用 [4, 5]。

由于内皮细胞连续片状，98%的小分子药物和100%的大分子药物不能通过血脑屏障，从而无法将药物输送到脑组织[6]。因此，为了开发治疗多种脑部疾病的有效递送系统，研究携带者通过血脑屏障的能力至关重要[7]。

在过去的十年中，基于纳米颗粒的系统作为有效的癌症靶向和治疗药物被广泛研究。在这种情况下，有机功能化磁性铁纳米粒子 (MNP) 吸引了很多兴趣，因为它们将表面功能化的多功能性与其核心的磁性和无毒生物相容性相结合。 MNP 被广泛用于治疗诊断应用（诊断和治疗），例如蛋白质和细胞分选和操作 [8、9]、细胞标记 [10、11]、磁控药物递送 [12、13]、磁共振成像 (MRI) [14, 15] 和热疗 [16,17,18,19]。为了有效地用于生物医学应用，MNP 应该能够穿过细胞膜，尤其是能够穿过各种生物屏障。用功能分子修饰MNPs表面经常被用来改善它们的细胞内化，但在许多情况下，BBB的穿越仍然是一个问题。

在这种情况下，可以看到使用细胞穿透肽 (CPP)，这是一组相对较短的肽（5-40 个氨基酸），来源于天然来源或合成设计的结构，可以很容易地穿过膜双层。作为一种有前途的方法。在众多可用的 CPP 中，源自单纯疱疹病毒 1 的糖蛋白 H (gH) 的 20 个残基肽 gH625 最近已被开发并用于穿过 BBB 以增强各种货物的摄取 [20, 21]进入细胞质。

在本研究中，MNP 已使用基于 3-氨基丙基膦酸 (NH2-PA) 耦合层的两种不同类型的靶向涂层进行功能化。这两种涂层是通过将 gH625 (gH625@MNPs) 细胞穿透肽或 PEG 和叶酸 (PEG,FA@MNPs) 分子连接到 NH2-PA 修饰的 MNPs (NH2@MNPs) 上获得的。特别是，将叶酸 (FA) 引入聚乙二醇化纳米粒子旨在通过 FA 受体介导的内化提高肿瘤细胞的细胞摄取 [22] 和整个纳米系统的生物相容性 [23]。通过共聚焦激光扫描显微镜评估了两种表面涂层对人脑 (HBMEC) 原代微血管内皮细胞 MNP 细胞内摄取的影响。为此，发光探针被纳入两个系统。特别是，gH625 用 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD) 探针标记，而羧基-X 将-罗丹明（rhod）探针加入到PEG,FA@MNPs的外壳中。

内皮细胞中gH625修饰的MNPs的细胞内摄取研究及其与FA修饰的MNPs的比较，据我们所知，以前从未报道过。

除了穿越 BBB 的能力外，靶向脑肿瘤细胞是脑肿瘤治疗药物的另一个重要要求。因此，还评估了最常见的人类恶性胶质瘤之一 A-172 胶质母细胞瘤中两种不同包被的 MNP 的细胞内化。

请注意，虽然 Perillo 等人最近制备了 gH625 功能化的铁纳米粒子。 [24]，在目前的工作中，我们报告了一种基于高度通用的膦酸平台的不同合成策略。特别是，膦酸化学允许在 MNP 和膦酸单层之间形成强键，其稳定性与硅烷化 MNP 相当。此外，由于 P-O-P 自缩合可以忽略不计，因此使用膦酸接头克服了使用硅烷时经常遇到的低聚物形成缺陷[25]。

方法

材料

用于MNP合成和功能化的所有试剂，FeCl2·4H2O，FeCl3·6H2O，3-氨基丙基膦酸，甲氧基聚乙二醇乙酸N -琥珀酰亚胺酯 (PEG-NHS)，分子量为 5000 Da，叶酸，N -羟基琥珀酰亚胺（NHS）和羧基-X -罗丹明 N -琥珀酰亚胺酯 (Rhod-NHS) 购自 Sigma-Aldrich，无需进一步纯化即可使用。用于肽合成的 9-芴基甲氧基羰基 (Fmoc) 保护的氨基酸由 Romil Del Chimica, Chemicals 购买，无需进一步纯化即可使用。水为 Milli-Q 级 (18.2 MO cm)，并通过 0.22-μm 过滤器过滤。

MNPs 的合成

Fe ³⁺ 的碱性共沉淀法合成了裸氧化铁MNPs 和 Fe ²⁺ ，根据文献 [26] 中描述的协议。简而言之，将 FeCl2·4H2O 和 FeCl3·6H2O（摩尔比 1:2）在 N2 气氛下在剧烈搅拌下溶解在水（50ml）中。在 80°C 下将 25% NH3 的 H2O (5ml) 溶液加入溶液中，并继续反应 30 分钟。将所得悬浮液冷却至室温并用超纯水洗涤。通过磁倾析从溶剂中分离得到的裸磁性纳米粒子(bare MNPs)。

gH625的合成

该肽的制备如先前报道的 [27] 采用标准固相 9-芴基甲氧基羰基 (Fmoc) 方法。简而言之，通过连续的脱保护和偶联循环，在 Wang 树脂 (0.75 mmol/g) 上合成了 50 μmol 的肽。然后将树脂结合的肽与 4-氯-7-硝基苯并呋喃 (NBD-Cl) 反应；反应在 DIPEA 存在下进行过夜。肽从树脂上裂解下来，并通过用三氟乙酸 (TFA) 和清除剂的混合物处理脱保护，然后在冰冷的乙醚中沉淀。将肽溶解在水中并冷冻干燥。粗肽表征通过电喷雾电离 (ESI) LC-MS 采用乙腈 (0.1% TFA) 在水 (0.1% TFA) 中的线性梯度在 15 分钟内从 20% 到 80% 进行。再经制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化。

N 的合成 -羟基琥珀酰亚胺叶酸酯 (FA-NHS)

FA-NHS 是通过以下公开的方法制备的 [28]。将五百毫克叶酸 (FA) 溶解在 10 毫升二甲亚砜 (DMSO) 和 240 毫升三乙胺中。 NHS（260 毫克）和 N ,N 加入-二环己基碳二亚胺(470mg)，并使混合物在室温下在黑暗中反应过夜。通过过滤除去副产物二环己基脲。然后在减压下浓缩 DMSO 溶液，并在乙醚中沉淀 FA-NHS。产物用无水乙醚洗涤数次，风干。

功能化 MNP 的合成

NH2@MNPs的合成

使用超声波浴将 MNP（200 毫克）分散在 H2O（25 毫升）中 30 分钟。添加 NH2-PA (100mg)，并将悬浮液在室温下搅拌 2 小时。磁力分离颗粒，用H2O洗涤4次，然后用乙醇洗涤，风干。

gH625@MNPs的合成

NH2@MNP（300 毫克）和 gH625（1.2 毫克）分散在 DMSO（20 毫升）中。将溶液在 25°C 混合过夜。得到的颗粒进行磁分离；用DMSO、H2O和乙醇洗涤；风干。

PEG、FA@MNPs的合成

NH2@MNPs（300 毫克）、PEG-NHS（30 毫克）、FA-NHS（3 毫克）和 Rhod-NHS（3 毫克）分散在 DMSO（15 毫升）中，并将溶液在 25°下混合过夜C。得到的颗粒进行磁分离；用DMSO、H2O和乙醇洗涤；风干。

示例特征

X 射线粉末衍射 (XRD) 测量使用 θ –θ 5005 Bruker-AXS 衍射仪（Zeiss，Oberkochen，德国），使用 Cu Kα 辐射，在 40 kV 和 30 mA 下运行。 X 射线光电子能谱 (XPS) 使用带有标准 Al-Kα X 射线源的 PHI 5600 多技术 ESCA-俄歇光谱仪进行。以45°（相对于样品表面）的光电子角和± 7°的接受角进行分析。 XPS 结合能 (B.E.) 标度通过将由于碳氢化合物部分和外来碳导致的 C 1s 峰居中在 285.0 eV 进行校准。 UV/Vis 测量用 JASCO V-560 UV/Vis 分光光度计进行，光谱以 ± 0.2 nm 分辨率记录。 MNP 的动态光散射 (DLS) 和 zeta 电位测量在 25°C 下使用配备 He-Ne 激光器（633 nm）和背向散射检测器（173° ）。透射 FT-IR 测量是用 JASCO FTIR 430 光谱仪记录的，使用 KBr 颗粒技术，每个光谱收集 100 次扫描（扫描范围 560–4000 cm ^{− 1} , 分辨率 4 cm ^{− 1} ).

细胞培养

根据报道的方法 [29]，人脑微血管内皮细胞 (HBMEC) 和人胶质母细胞瘤细胞系 A-172 在鼠尾 I 型胶原包被的组织培养瓶中生长至汇合。简而言之，HBMEC 在补充有 5% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 内皮细胞生长补充剂的内皮细胞培养基中生长。 A-172 细胞系在含有 2 mM 谷氨酰胺和 10% FBS 的 DMEM 中生长，如前所述 [30]。在这两种情况下，还向培养物中加入了 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素。

细胞活力测定

用 [3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H 测定细胞活力 -溴化四唑] (MTT) 测试 [31]。在所有实验条件下，FBS 浓度降低到 1%（饥饿培养基）。将细胞以 7000 个细胞/孔接种在 96 孔板中，以获得整个实验过程中的最佳细胞密度。在所有检测中，细胞首先在 37°C 下与 MTT 孵育 3 小时；然后，加入含有 0.04 M HCl 的异丙醇，并在酶标仪（Synergy 2-BioTek）中以 570 nm 的测试波长在 1 小时时测量吸光度 [32]。

共聚焦显微镜

对 HBMEC 和 A-172 胶质母细胞瘤细胞进行共聚焦显微镜检查，这些细胞在置于 24 孔板中的显微镜盖玻片上生长。在有或没有 MNP 的情况下孵育后，通过在 PBS 中加入 4% 多聚甲醛来固定细胞，并如前所述进行免疫细胞化学处理 [33]。使用配备以下激发源的 Olympus FV1000 共聚焦激光扫描显微镜 (LSM) 进行共聚焦显微镜分析：二极管激光器 (405 nm)、多线 Ar 激光器 (457、488 和 515 nm)、HeNe(G) 激光器 ( 543 nm) 和 HeNe(R) 激光 (633 nm)。使用油浸物镜 (60xO PLAPO)，并通过光谱过滤系统以顺序模式检测发射光。探测器增益固定在一个恒定值，并且在整个井区的随机位置为所有样品拍摄图像。使用了以下采集参数：λ ex/em =405/425 − 475 nm（蓝色通道，DAPI 核染色）； λ ex/em =488/500 − 530 nm（绿色通道，NBD标记的gH625@MNP）；和 λ ex/em =633/650 − 700 nm（红色通道，PEG，FA@MNPs 由 rhod 标记）。使用ImageJ软件（1.50i版，NIH）进行荧光定量分析。

结果与讨论

MNP 的合成和表征

从共沉淀获得的 Fe3O4 纳米粒子制备 gH625@MNPs 和 PEG,FA@MNPs 的总体策略包括两个步骤，如图 1 所示。第一步，这两种纳米粒子是相同的，是基于带有氨基的膦酸 (NH2-PA) 的 MNP 功能化。第二步，NH2-PA预官能化的MNPs（NH2@MNPs）通过NHS偶联反应与特定的功能分子进一步偶联。特别是 N 用 NBD 标记的 gH625 的 -羟基琥珀酰亚胺活化形式用于制备 gH625@MNPs，以及 N -羟基琥珀酰亚胺活化形式的 PEG、FA 和 Rhod 用于获得 PEG、FA@MNP。请注意，gH625@MNPs 和 PEG,FA@MNPs 均已用发光探针（即分别为 NBD 和 Rhod）进行标记，以进行共聚焦激光扫描显微镜研究。

反应方案。功能化MNPs的制备反应步骤

在共沉淀步骤后获得的裸 MNP 的 X 射线衍射 (XRD) 表征与我们之前的论文 [34, 35] 中报道的相似。简而言之，一个典型的图案（图 2a）显示了四个衍射峰（2θ =30.16°、35.48°、43.10° 和 57.04°），这与存在磁铁矿、磁赤铁矿或两相之间的任何中间成分一致。晶格常数，a ，发现是 8.389(4) Å，与块状磁铁矿的晶格参数 (8.396 Å) 非常吻合，平均晶体尺寸为 11.2，应用德拜-谢勒方程确定，与之前的值相当报道 [34, 35]。

MNPs 的典型 XRD 和 XPS 光谱。 a)裸MNPs和b)裸MNPs和c)NH2@MNPs的高分辨率Fe 2p3/2 XPS光谱区的XRD图

请注意，由于 Fe3O4 磁铁矿的晶体结构与 γ-Fe2O3 磁赤铁矿的晶体结构非常相似，因此很难通过 XRD 区分这两个相。因此，使用 X 射线光电子能谱 (XPS) 来进一步分析 MNP。图 2b 显示了裸 MNP 的 Fe 2p3/2 高分辨率 XPS 光谱。在 710.9 eV 处观察到的条带质心对应于 Fe 2p3/2 峰。该值低于针对 Fe ³⁺ 报告的值 无论是在 α-Fe2O3 (711.6 eV) 的八面体孔中 [36, 37] 还是在 γ-Fe2O3 的四面体和八面体混合孔中 (711.4 eV)，这与 Fe3O4 中 Fe 的混合氧化态一致 [37, 38 ].

最后，我们之前的论文 [34, 35] 报道了类似 MNP 的详细磁性表征。

通过 FT-IR 和 XPS 评估功能化过程。用膦酸单层功能化后，Fe 2p3/2 带（图 2c）未显示相关修饰，因此证实保留了 Fe3O4 相。然而，观察到 Fe 2p3/2 质心向较低结合能 (B.E) 的轻微偏移 (0.4 eV)，这与磷酸单层的锚定有关。事实上，在各种氧化铁的磷酸盐吸附中观察到了类似的变化 [39]，这可以归因于从吸附质到 Fe 原子的一些电荷转移。在用于锚定 PEG 和 FA 的所有功能化步骤后，Fe 2p3/2 位置保持在 710.5 eV。

图 3 分别报告了 NH2@MNP、PEG、FA@MNP 和 gH625@MNP 的 P2p、N1s 和 C 1s 光谱区域的比较。 NH2@MNPs 的 P2p 峰位置 (133.2 eV) 通常与以双齿方式固定在表面的膦酸有关 ​​[40,41,42,43]。 gH625@MNPs 和 PEG,FA@MNPs 光谱中的 P2p 带位置与 NH2@MNPs 光谱中观察到的相同，因此表明在肽和叶酸固定的偶联反应过程中没有去除膦酸分子。

功能化 MNP 的 XPS 表征。 a) NH2@MNPs, b) PEG,FA@MNPs, 和 c) gH625@MNPs 的高分辨率 P 2p、C 1s 和 N 1s XPS 光谱区域

NH2@MNPs 的 N1s 光谱的形状和峰值位置与锚定 NH2-PA 的存在一致。该条带由两个不同的成分组成：第一个在 399.9 eV 与锚定的氨基丙基磷酸酯的 -NH 基团相关，第二个成分以 401.5 eV 为中心是由于氨基通过质子化或形成与 Fe3O4 的表面相互作用-H 键。

在锚定 gH625 肽或 FA、PEG 和 Rhod 后，与 NH2@MNP 质子化氨基部分相关的 401.8 eV 组分相比，399.8 eV 处的 N1s 组分增加。这种增加是由于与锚定的氨基丙基磷酸酯和共轭分子（例如，gh625、FA、PEG 和 Rhod）之间的酰胺键 (400.2 eV) 以及 gh625 的 N 原子的 N 原子的重叠信号和 FA（在 399.1 和 400.6 eV）。

NH2@MNPs 光谱的 C 1s 谱带由一个位于 285.0 eV 的单峰组成，如先前报道的那样 [40]。

在 gH625@MNPs 和 PEG,FA@MNPs 的 C1s 光谱中，288.3 eV 处的 C 1s 组分的存在是由于 gh625、FA 和 Rhod 分子的羧基和酰胺基团。

NH2@MNPs、gH625@MNPs 和 PEG、FA@MNPs 的 FT-IR 光谱如图 4 所示。在所有样品中，光谱未显示 1250 cm ^{− 1} 处的谱带 由于 P=O 和 900–1050 cm ^{− 1} 中的尖峰 由于 P-O-H 拉伸 [44,45,46]，但在 1040 cm ^{− 1} 处有一个宽而强的带 ，这与 PO3 ²⁻ 的振动有关 基团结合在铁表面。根据 XPS 结果，该带表明膦酸被去质子化并通过先前报道的 P-O-Fe 键固定在表面 [34, 40, 41]。 1500 到 1700 cm ^{− 1} 之间的 IR 光谱区域 显示了属于 gH625 和 FA 的氨基和酰胺基团的条带。特别是，NH2@MNPs 的光谱在 1650 cm ^{− 1} 附近显示出一个尖峰 与 NH2 弯曲有关 [47]。 PEG、Rhod 和 FA 锚定后，1700–1500 cm ^{− 1} 由于未反应的 NH2、酰胺基团以及 FA 和 Rhod 的苯环（1630–1600 cm ^{− 1} ) [35]。类似地，在肽锚定之后，大约 1650–1600 cm ^{− 1} 的宽带 可能是由于未反应的 NH2 和肽侧链的氨基部分以及肽酰胺键的 C=O 拉伸引起的几种振动的贡献 [48]。此外，约 1540 cm ^{− 1} 处的组件 由于组合 δ (N–H)/ν(C–N) 振动肽[48]也存在。

功能化 MNP 的 FT-IR 表征。 850–1900 cm ⁻¹ 内的 FT-IR 光谱区域 a) NH2@MNPs, b) gH625@MNPs, 和 c) PEG,FA@MNPs

PEG,FA@MNPs 胶体溶液的紫外/可见光谱也证明了 FA 锚定在 MNPs 上。图 5 比较了 NH2@MNPs 和 PEG,FA@MNPs 胶体分散体的光谱。添加了 FA 溶液 (5 μM) 的光谱作为参考。 FA 典型的 274 nm 处的明显条带在参考和 PEG,FA@MNPs 胶体溶液中均清晰可见，从而证实了 MNP 中存在 FA。请注意，锚定后从 280 nm 处的 FA-NHS 吸收到 274 nm 值的轻微变化可能是由于游离 FA-NHS 和纳米粒子锚定 FA 的环境发生了变化。文献中已经观察到 FA 表面锚定或与其他分子缀合后 280 nm 处吸收带的可变位移 [49,50,51]。

功能化 MNP 的 UV/Vis 表征。 5 μM FA-NHS 溶液和 NH2@MNP 以及 PEG、FA@MNP 胶体分散体的 UV/Vis 光谱。注意在NH2@MNPs和PEG,FA@MNPs的光谱中观察到的高背景是由于纳米颗粒胶体分散体的散射造成的

功能化 MNP 的平均流体动力学直径、多分散指数 (PDI) 和 zeta 电位通过 DLS 在 pH 7.4 的 PBS 缓冲液中对制备的 MNP 分散体和老化 72 小时后测定（表 1）。 NH2-PA@MNPs、gH625@MNPs 和 PEG,FA@MNPs 的流体动力学直径分别为 73.0 ± 3.0 nm、104.0 ± 4.0 nm 和 51 ± 2 nm，并且 PDI 值表明颗粒分布足够窄尺寸。正如预期的那样，与 gH625 的共轭增加了纳米粒子的尺寸，而 PEG,FA@MNPs 的尺寸减小是由于比 NH2@MNPs 更好的分散性，与 PEG 链的存在有关。

在任何情况下，请注意所有系统都观察到高度负的 zeta 电位 (<− 30 mV)。这种负 zeta 电位值可确保长期稳定性并避免广泛的颗粒聚集 [52, 53]。事实上，负表面电荷仅略微依赖于涂层，但主要是由于 Fe3O4 纳米粒子的带负电荷核心 [54] 和类似系统中观察到的膦酸基团的影响 [52, 34] 的组合。因此，与用于功能化 MNP 的其他合成策略相比，使用膦酸单层作为连接器不仅可以在表面和官能团之间形成稳定的键合，而且还可以诱导高度负的 zeta 电位。老化 72 h 后，NH2-PA@MNPs、gH625@MNPs 和 PEG,FA@MNPs 的尺寸和 zeta 电位大致保持不变，表明所有装饰表面都随着时间的推移保持稳定。

细胞活力

HBMEC 和 A-172 细胞与 gH625@MNPs 和 FA,PEG@MNPs 一起孵育的活力在不同的孵育时间和不同浓度的纳米颗粒（10 和 20 μg/ml）下使用 MTT 测定进行评估。如图 6 所示，未观察到装饰系统对 HBMEC 和 A-172 细胞的浓度和/或时间依赖性（24-48-72 小时）细胞毒作用。

细胞活力。 a 的细胞活力 HBMEC 和 b A-172 细胞与 gH625@MNPs 10 μg/ml（黑条）、gH625@MNPs 20 μg/ml（红条）、PEG、FA@MNPs 10 μg/ml（蓝条）孵育 24、48 和 72 小时) 和 PEG,FA@MNPs 20 μg/ml（品红色条）

细胞内摄取

为了确定gH625肽固定在纳米颗粒表面后是否保留其细胞穿透能力，并比较gH625和FA穿越BBB的能力，NBD标记的gH625@MNPs内化到人脑内皮细胞和Rhod标记的PEG,FA@MNPs已经用激光共聚焦扫描显微镜进行了研究。

孵育 24 小时后，PEG-FA@MNP 的吸收不明显，而 gH625@MNP 的内化清晰可见（图 7）。与 gH625 结合导致细胞内荧光吸收更快，强度增加近两倍（图 8）。

HBMEC 的 LSM 荧光显微照片。 HBMEC 孵育 24 小时的 LSM 荧光显微照片 (b , f ) 和 72 小时 (d , h ) 与 NBD 标记的 gH625@MNPs 15 μg/ml (b , d ) 及其控件 (a , c ) 或 Rhod 标记的 PEG,FA@MNPs 15 μg/ml (f , h ) 及其控件 (e , g ）。比例尺 =20 μm

细胞内荧光的归一化强度。 HBMEC 与 NBD 标记的 gH625@MNPs 和 Rhod 标记的 FA,PEG@MNPs 孵育 24 和 72 小时后细胞内荧光的定量分析

对于更长的孵育时间（72 小时），两个系统内化之间的差异会减少。这种行为并不出人意料，因为在较长的孵育时间内，FA,PEG@MNPs 的非特异性内化过程可能发生，我们的结果进一步证实了我们之前报道的功能化和非功能化聚苯乙烯纳米粒子的吸收 [55]。

为了进一步探索使用 gH625@MNPs 作为脑肿瘤治疗剂的可能性，使用 A-172 胶质母细胞瘤细胞系研究了 gH625@MNPs 和 FA,PEG@MNPs 的细胞摄取。胶质母细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤之一，也是最致命的癌症之一。

孵育 24 小时后 gH625@MNPs 和 FA,PEG@MNPs 的细胞摄取量相当，如图 9 所示。

胶质母细胞瘤细胞的 LSM 荧光显微照片。胶质母细胞瘤细胞的 LSM 荧光显微照片。合并的蓝绿色图像：控制单元格 (a ) 和用 15 μg/ml NBD 标记的 gH625@MNPs (b ）。合并的蓝红图像：控制单元格 (c ) 和用 15 μg/ml 罗德标记的 PEG,FA@MNPs (d ）。比例尺 =20 μm

这种行为表明gH625能够以与更常用的FA靶向单元相同的效率靶向脑肿瘤。

结论

Fe3O4 纳米粒子已经用 gH625 病毒细胞穿透肽功能化，采用基于 MNP 预功能化的通用途径，单层由双功能膦酸接头、3-氨基丙基膦酸组成。该系统的细胞内化能力已通过与基于 PEG、罗丹明和叶酸功能化的 MNP 的参考系统进行比较来评估，该参考系统采用相同的基于 NH2-PA 的平台获得。在来自人脑的原代微血管内皮细胞中评估了两种不同装饰的 MNPs 的吸收，这些细胞是 BBB 的主要成分并模拟 BBB 的体外模型。 These surface modifications influence the internalization of MNPs in HBMEC and, therefore, their capability to cross the BBB. In fact, conjugation with the gH625 peptide upgraded the delivery of nanoparticles across the in vitro BBB, leading to significant higher cell uptake in HBMEC after 24 h compared with that of FA bearing MNPs (FA,PEG@MNPs). Note that also other strategies have been used to enhance nanoparticle uptake across the BBB. A common approach is to attach targeting ligands in order to activate receptor-mediated endocytosis. As examples, transferrin-coupling nanoparticles can penetrate into the BBB through a transferrin receptor-mediated process [56]. Analogously, the linkage of the apolipoprotein E to the nanoparticles enhances the BBB penetration [57]. Besides, nanoparticles having a surface charges modified with polyethylenimine (PEI) has been reported to cross the BBB by absorptive-mediated transcytosis [58]. Finally, the ability of MNPs to pass through human brain microvascular endothelial cells, used as an in vitro BBB model, can be also facilitated by an external magnet [59]. In our work, we studied a different approach which use a cell penetrating peptide, the gh625, to improve internalization capabilities of Fe3O4 nanoparticles. These results are in accordance with those previously obtained by D. Guarnieri et al. using different kinds of MNPs [55, 60] confirming that the gH625-decorated magnetic nanoparticle has a relevant role in crossing the BBB and could be used as a safe and effective drug delivery system.

缩写

A-172:

Human glioblastoma cell line

B.E.:

Binding energy

BBB:

Blood-brain barrier

CNS:

Central nervous system

CPPs:

Cell-penetrating peptides

DIPEA:

N ,N -Diisopropylethylamine

DLS：

动态光散射

DMEM：

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DMSO：

Dimethyl sulfoxide

FA:

Folic acid

FA-NHS:

Activated form of FA with NHS

FBS：

胎牛血清

Fmoc:

9-Fluorenylmethoxycarbonyl

FT-IR:

傅里叶变换红外光谱

gh625:

20-Residue peptide derived from the glycoprotein H (gH) of the Herpes simplex virus 1

gH625@MNPs:

NH2@MNPs functionalized with gh625

HBMECs:

Microvascular endothelial cells from human brain

MNPs:

Magnetic iron nanoparticles

MTT:

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H -tetrazolium bromide

NBD:

4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole

NH2@MNPs:

MNPs modified with NH2-PA

NH2-PA:

3-Aminopropylphosphonic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

PBS:

Phosphate-buffered saline

PDI:

Polydispersity index

PEG:

Polyethylene glycol

PEG,FA@MNPs:

NH2@MNPs functionalized with FA, Rhod and PEG

PEG-NHS:

Methoxypolyethylene glycol acetic acid N -succinimidyl ester

PEI：

聚乙烯亚胺

Rhod:

Carboxy-X -rhodamine

Rhod-NHS:

Carboxy-X -rhodamine N -succinimidyl ester

TFA:

Trifluoroacetic acid

XPS：

X射线光电子能谱

XRD：

X-ray powder diffraction