磁性金纳米粒子标记乙酰肝素酶单克隆抗体及其在肿瘤磁共振成像中的后续应用

背景

肿瘤转移是一种恶性行为，是肿瘤患者死亡的主要原因。目前还没有检测早期肿瘤转移的有效策略。 B型超声、计算机断层扫描（CT）扫描和磁共振成像（MRI）是目前诊断肿瘤转移的标准工具，但它们只能在大多数患者已经发生远处转移时才能区分一定大小的转移性肿瘤[1]。 , 2]。因此，迫切需要开发检测早期肿瘤转移的新策略。

近年来，分子成像，如MR分子成像，因其良好的空间分辨率和平均对比剂敏感性而成为肿瘤早期诊断和治疗的新选择[3, 4]。开发不仅提供成像增强功能的新型造影剂是 MRI 开发的主要动机之一。最近，使用超顺磁性分子探针作为强信号放大系统大大提高了 MR 靶向造影剂的灵敏度。顺磁性离子复合物或磁性粒子偶联的 mAb 已被用于改变肿瘤弛豫时间 [5]。使用磁性纳米材料和 mAb 组合对抗肿瘤相关抗原 (TAA) 的分子成像是最近研究的重点。迄今为止发现的大多数 TAA，例如 AFP、PSA 和 CEA，都是肿瘤组织特异性的 [6]。因此，将针对这些 TAA 的 mAb 与磁性纳米材料结合可用于表达这些特定抗原的肿瘤。因此，鉴定一种适用于多种肿瘤的常见肿瘤抗原，并用磁性纳米材料标记针对此类抗原的单克隆抗体对肿瘤分子成像具有重要意义。

乙酰肝素酶 (HPA) 是一种与肿瘤转移相关的基因，1999 年由四个实验室同时克隆 [7,8,9,10]。只有内源性糖苷内切酶可以降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG)，它是细胞外基质 (ECM) 中的主要蛋白聚糖成分。 HPA在转移性恶性肿瘤中普遍表达，其表达水平与肿瘤转移密切相关。 HPA 可以通过裂解 ECM 和 BM 中的 HSPG 破坏 ECM 和基底膜 (BM) 的完整性，导致锚定在 ECM 中的分子的释放和激活，进而促进肿瘤血管生成和转移 [11, 12]。我们之前的研究表明，HPA 可用作肿瘤免疫治疗的 TAA [13,14,15,16]。在这里，我们试图评估HPA是否可用作肿瘤转移分子成像的常用TAA及其在肿瘤分子成像中的潜在应用。

本研究以磁性金纳米粒子（30 nm）为造影剂，HPA mAbs为靶向载体构建HPA&GoldMag分子探针，并考察了这些探针在MR分子成像对肿瘤早期诊断中的可行性和意义转移。还评价了HPA抗体的体外抗肿瘤生物学效应，为HPA mAb在肿瘤治疗中的应用提供实验依据。

方法

细胞系和小鼠

本研究中使用了七种细胞系。乙酰肝素酶阳性细胞系，包括肝癌细胞系 HepG2、人胃癌细胞系 MKN45 和 SGC-7901、结肠癌细胞系 SW480 和人骨肉瘤细胞系 U2OS，购自美国典型培养物保藏中心。乙酰肝素酶阴性细胞系、人乳腺癌细胞系 MCF-7 和人原代胚胎成纤维细胞系 HF 由梁博士（中国重庆第三军医大学烧伤研究所）提供。 HepG2细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养。 SGC-7901、SW480、U2OS 和 HF 细胞在含有 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 中培养。 MKN45 和 MCF-7 细胞在含有 15% 胎牛血清的 RPMI 1640 中培养。所有细胞均在 37°C 的 5% CO2 培养箱中培养，每 24-48 小时传代一次。 15只BALB/c裸鼠（4-5周龄）购自第三军医大学动物系。动物研究是在与第三军医大学当地伦理委员会的同意下进行的。所有裸鼠均保持在无特定病原体的环境中。

蛋白质印迹

按照我们之前研究中描述的程序进行蛋白质印迹以检测 Hpa 蛋白表达 [17]。用 M-PER 提取试剂（Pierce Co.）裂解每个细胞系。通过 BCA 测定法（Bio-Rad，CA，USA）测定蛋白质浓度。 30 微克蛋白质通过 10% SDS-PAGE 分离，然后转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜（Roche，Rotkreuz，瑞士）。膜用 5% (w /v ) TBST 中的脱脂牛奶（20 mM Tris-HCl [pH 8.0]、150 mM NaCl 和 0.1% [v /v ] Tween-20) 在室温下放置 2 小时。然后，在 4°C 的封闭缓冲液中用 1:200 稀释的抗 HPA 抗体（Insight，Israel）探测膜过夜。将膜用 TBST 洗涤四次，并与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠 IgG 抗体在室温下孵育 1 小时。然后用 TBST 冲洗膜，并用 ECL 蛋白质印迹检测试剂（GE Healthcare，NJ，USA）观察蛋白质条带。使用Quantity One 4.1软件（Bio-Rad）分析图像。实验至少重复3次。

免疫组化染色

通过免疫细胞化学检测上述细胞系中Hpa的表达。简而言之，将上述细胞在无菌盖玻片上在 37°C 下在 5% CO2 培养箱中培养 48 小时。通过用 0.3% H2O2-甲醇溶液处理 20 分钟来阻断内源性过氧化物酶活性后，将细胞与 Hpa 一抗（抗体的稀释度为 1:100）在 4°C 下孵育过夜。用含有 0.1% Triton X-100 的 PBS 彻底洗涤后，将载玻片与二抗在 20°C 下孵育 20 分钟。最后，将载玻片与亲和素-生物素酶试剂一起孵育 15 分钟。然后将载玻片浸入 3,3'-二氨基联苯胺/H2O2 溶液中。 PBS作为阴性对照。

HPA&GoldMag 分子探针的构建和原子力显微照片

分子探针的构建使用GoldMagTM-CS试剂盒（西安金磁纳米生物技术公司，GNK0202，西安，中国）按照操作说明进行。 HPA 抗体的浓度为 1 mg/ml。使用原子力显微照片 (AFM) 来评估纳米颗粒的形状、尺寸和表面外观。将未标记的磁性金纳米粒子或标记的磁性金纳米粒子置于盖玻片上并在室温下风干 24 小时。使用原子力显微镜（AFM，Nanoscope，Digital Instruments，Santa Barbara，CA）分析干燥的样品。

免疫荧光

简而言之，将细胞在无菌盖玻片上于 37°C 下在 5% CO2 培养箱中培养 48 小时。然后，细胞用 4% (w /v ) 甲醛在 PBS 中放置 30 分钟，然后用 0.2% (v /v ) Triton X-100 在室温下放置 5 分钟。通过将盖玻片与 10% (v /v ) PBS 中的山羊血清 30 分钟。然后，细胞用 HPA&GoldMag 分子探针或正常小鼠 IgG&GoldMag 探针以 1:50 的稀释度染色，然后用 Cy3 标记的山羊抗小鼠 IgG 以 1:100 的稀释度染色。然后在室温下用 0.4 mg/mL DAPI (Sigma-Aldrich) 将细胞染色 10 分钟。使用激光共聚焦显微镜获取显微图像。正常小鼠IgG&GoldMag探针作为阴性对照。

流式细胞术

HPA&GoldMag 探针的活性通过流式细胞术测定。细胞用山羊血清封闭 1 小时。然后，细胞在 4°C 下用 10 μg HPA&GoldMag 探针或正常小鼠 IgG&GoldMag 染色过夜，用 PBS 洗涤四次，然后与 FITC 标记的小鼠 IgG 抗体在 37°C 下孵育 1 小时。用PBS洗涤细胞，用流式细胞仪（Becton Dickinson）测定荧光强度。

用于磁共振成像的磁性金纳米粒子的体外研究

使用 1% 琼脂糖溶液将磁性金纳米颗粒溶液 (5 mg/ml) 连续稀释两次 (1:20–1:1280)。溶液在 EP 管中固化。使用 1% 琼脂糖凝胶作为空白对照进行 MR 扫描。扫描参数如下：T1WI； TR600 毫秒/TE12 毫秒；厚度，2.0 毫米；视场，150 毫米；和 T2WI； TR6000 毫秒/TE92 毫秒；厚度，2.0 毫米；视场，150 毫米。 HPA&GoldMag MR 分子探针是使用用 30 nm 磁性金颗粒标记的 HPA mAb 构建的。细胞在 100 毫米培养皿中常规培养，然后将 HPA&GoldMag 探针或阴性 IgG&GoldMag 探针添加到细胞培养物中，并在 37°C 下孵育 90 分钟。加入适量的山羊血清封闭未结合的探针。 PBS 洗涤 3 次后，用胰蛋白酶消化细胞。然后收集细胞，与 1% 琼脂糖溶液混合，并转移到 1.5 ml EP 管中。使用 3.0 T MRI 扫描仪（扫描参数与上述相同）使用动物的特定磁共振线圈进行 MR 扫描。扫描前，小鼠用1%戊巴比妥麻醉，置于扫描床上。

用于磁共振成像的磁性金纳米粒子的体内研究

将 200 μl MKN45 细胞皮下注射到 4 至 6 周大的雄性裸鼠（26-30 克）的髋部。每只裸鼠注射约 2.0 × 10 ⁶ 细胞。 2 周后，肿瘤可见并用于 MR 成像。注射前和注射后 2 小时，使用 3.0 T MRI 扫描仪进行 MR 扫描。参数为T2WI、TR6000 ms/TE92 ms；厚度，1.5 毫米；和 FOV，120 毫米。之后，收集肿瘤、脾、肝、肾、脾、心、肺组织进行普鲁士蓝Fe染色。

统计分析

所有数据均表示为平均值 ± 标准偏差。使用SPSS13.0软件进行方差分析。一个 P 值 <0.05表示差异显着。

结果

HPA 在各种癌细胞中的表达不同

使用蛋白质印迹和免疫组织化学染色分析来测试 Hpa 在 HepG2、SGC-7901、MKN45、MCF-7、SW480 和 U2OS 细胞中的表达。结果表明，HepG2、SGC-7901、MKN45、SW480和U2OS细胞中Hpa的表达要高得多，而MCF-7细胞中Hpa的表达要低得多（图1）。

Hpa 蛋白在各种细胞系中的表达。 一 蛋白质印迹用于检测各种肿瘤细胞系中的 HPA 蛋白表达 (65 kDa)。泳道 1，HepG2；泳道2，SGC-7901； 3号车道，MKN45；泳道 4，MCF-7； 5号车道，SW480；车道 5，U2OS。 b HepG2、SGC-7901、MKN45、MCF-7、SW480和U2OS细胞系HPA表达的免疫组织化学分析

HPA&GoldMag分子探针的构建与检测

HPA&GoldMag 分子探针是通过利用磁性金纳米粒子表面之间的偶联反应将 HPA mAb 与磁性金纳米粒子偶联来制备的。原子力显微镜（AFM）用于直接观察探针的表面结构。我们发现磁性金纳米粒子的平均直径为 13.78 nm，没有用 HPA mAb 标记（图 2a）；粒度均匀。用 HPA mAb 标记后，平均直径约为 24.80 nm（图 2b）。这些结果表明磁性金纳米颗粒适合与HPA mAb偶联。

一 磁性金纳米粒子与 HPA mAb 的耦合模型。 b 磁性金纳米粒子的原子力扫描

HPA&GoldMag 分子探针可以与 HPA 特异性结合

首先，通过免疫荧光评估分子探针与 HPA 之间结合的特异性。结果表明，HepG2、MKN45、SW480和U2OS细胞的细胞质中检测到大量红色荧光，而MCF-7细胞中仅检测到少量红色荧光，HF细胞中未检测到荧光.然而，阴性小鼠 IgG&GoldMag 在任何细胞系中均未显示与 HPA 的任何相互作用（图 3）。我们进一步使用流式细胞术来测试 HPA&GoldMag 分子探针的特异性。我们在 HF 细胞中显示出阴性反应，并在 MCF-7 细胞中观察到 40% 的阳性率，在 HepG2、SW480、U2OS 和 MKN45 细胞中观察到 95% 的阳性率。这些结果表明探针可以与肿瘤细胞中表达的HPA特异性结合。

通过免疫荧光和流式细胞术检测探针的特异性和结合活性。 一 如所示使用探针进行免疫荧光。 b 流式细胞仪检测HPA&GoldMag分子探针的特异性

体外 HPA 和 GoldMag 探针的 MR 成像

使用 1% 琼脂糖连续稀释后，使用 T2WI 序列对磁性金纳米粒子进行 MR 成像显示不同的信号减少。 1:640 稀释的 T2WI 信号远低于 1% 琼脂糖凝胶对照 (P <0.05)（图 4a、b）。结果表明，磁性金纳米粒子即使在低浓度下也能有效降低MR信号，表明磁性金纳米粒子可适用于分子成像。然后，使用 HPA&GoldMag 分子探针标记 HepG2、SGC7901、MKN45、SW480、U2OS、HF 和 MCF-7 细胞，然后将其与 1% 琼脂糖混合并置于 3.0 T 磁共振 (MR) 下（图 4c）。 MR 扫描使用 T1WI（图 4c，d）或 T2WI（图 4c，e）序列进行轴向加冠状扫描。结果表明，与T1WI序列相比，MR扫描的T2WI序列信号明显减弱（P <0.05) 而标记后 HF 细胞中的信号没有显着变化 (P> 0.05)，标记后MCF-7细胞内的信号最低限度地降低(P <0.05).

一 两次连续稀释后磁性金纳米颗粒的 MR 成像。 b 两种连续稀释的磁性金纳米粒子的 MR 成像信号强度统计结果图。 c 用探针标记后所有细胞的 MR 成像。泳道 1, HF;泳道 2，MCF-7；泳道3，HepG2；泳道 4，SGC-7901； 5号车道，MKN45； 5号车道，SW480；车道 6，U2OS。 d 使用 T1WI 序列对用 HPA&GoldMag 探针标记的细胞进行 MR 成像的信号强度比较的统计结果。 e HPA&GoldMag探针标记细胞T2WI序列MR成像检测信号强度统计结果

裸鼠 HPA 和 GoldMag 探针的 MR 成像

所有裸鼠均用戊巴比妥钠以 50 mg/kg 的剂量麻醉。将分子探针注入裸鼠尾静脉，给药前和给药后2h进行MR扫描。由于探针可被肺和肝脏中的巨噬细胞吸收并经肾脏排泄，因此扫描结果显示注射后裸鼠体内的肿瘤、肝脏、肾脏和肺组织的信号明显减弱。注射前检测到的 (P < 0.05)（图 5）。

一 注射对照或 HPA&GoldMag 探针之前和之后 2 小时的裸鼠 MR 成像。箭头表示小鼠的肿瘤。 b 在裸鼠中注射对照或 HPA&GoldMag 探针前后使用 T2WI 比较来自 MR 图像的信号强度。 ^* P <0.01

讨论

肿瘤侵袭和转移是一个复杂的生物学过程，导致肿瘤预后不良。因此，肿瘤转移的早期诊断是选择临床治疗策略的重要策略。 MRI 是一种有用的非侵入性肿瘤检测方法；它可以实现多维高对比度组织成像。然而，MRI 无法检测到小尺寸的肿瘤，应使用金属纳米粒子（铁、金等）等高对比度药物来增强肿瘤可视化 [18,19,20]。基于新型纳米材料的新型造影剂的开发有利于改进用于癌症早期检测的 MRI 技术。在显像剂中，超顺磁性氧化铁颗粒（SPIO）被用作MR分子成像中常见的造影剂，其中磁性金纳米颗粒是具有Fe3O4（核）/Au（壳）结构的超顺磁性纳米复合材料[21,22 ,23,24]。无机纳米粒子的超顺磁性可用于磁共振成像 (MRI) [25]。这些纳米颗粒与组织特异性试剂（抗体或低分子量物质）的组合能够精确检测和诊断肿瘤。大量研究表明，HPA在多种肿瘤中均有表达，其表达水平与肿瘤的转移潜力密切相关[26]。 HPA 可通过降解 HSPG 破坏 ECM 和 BM 的完整性，从而释放锚定在 ECM 中的 bFGF、HGF 和 VEGF 等活性分子，从而促进肿瘤进展 [27,28,29,30]。由于 HPA 主要在中晚期肿瘤中表达，我们之前的研究表明 HPA 可作为肿瘤治疗的常用 TAA [13,14,15]。因此，HPA可能是肿瘤分子成像和治疗的潜在有用靶点。

磁性金纳米粒子是通过还原 Au ³⁺ 产生的具有 Fe3O4（核）/Au（壳）结构的超顺磁性复合纳米材料 通过来自超顺磁性 Fe3O4 颗粒的盐酸羟胺 [31, 32]。由于标记方法非常简单，它们可用于细胞选择、蛋白质纯化、核酸分离和免疫分析等生物学应用。因此，通过遵循既定程序，我们能够成功地制备和表征与抗 HPA 抗体相关的镀金氧化铁纳米颗粒。在这项研究中，使用了 30 纳米磁性金颗粒，因为它们比 50 纳米磁性金颗粒稳定得多。 1 毫克 30 纳米磁性金颗粒可以与大约 200 微克 HPA mAb 结合。我们的数据显示，在 3.0 T MRI 扫描中，与空白对照组相比，使用 1:640 稀释度（约 10 μg）的磁性金纳米粒子产生的信号减少（P < 0.05）。由此，可以计算出磁性金粒子活体成像的临界值。

随后使用激光共聚焦显微镜、流式细胞术和原子力显微镜检测磁性金纳米颗粒偶联的 HPA mAb 探针的活性和特异性。简而言之，通过将靶向探针和阴性对照探针与 HPA (+) 和 (-) 细胞一起孵育来体外测试探针。在这里，人 MCF-7 乳腺癌细胞表现出较弱的 HPA 表达，而 MKN45、SW480、U2OS、HepG2 和 SGC-7901 细胞具有较高的 HPA 表达。此外，以正常小鼠IgG作为HPA mAbs的对照，进一步证明了纳米颗粒的特异性。

在体外测试探针的特异性后， 将靶向探针和对照探针注射到裸鼠皮下注射人MKN45胃癌细胞。一旦肿瘤组织的直径达到 1 cm，使用 3.0 T MRI 室进行 MR 扫描，以检测注射探针前后肿瘤的信号变化。扫描结果显示，与探针注射前的信号相比，探针注射后 2 小时的肿瘤信号显着降低。这些结果表明，HPA&GoldMag探针在携带MKN45细胞的裸鼠中具有良好的免疫活性和更好的效果。

结论

总之，我们证明了与 HPA mAb 偶联的 HPA&GoldMag 分子探针具有优异的物理和化学性质。该探针可以在体外和体内特异性地靶向许多表达高 HPA 的肿瘤细胞。使用 3.0 T MRI 扫描，显示探针显着降低肿瘤组织中的 T2WI 信号；这可能为肿瘤转移的分子成像提供实验基础。

缩写

原子力显微镜：

原子力显微照片

BM：

基底膜

CT：

计算机断层扫描

ECM：

细胞外基质

HPA：

乙酰肝素酶

HSPG：

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖

MRI：

磁共振成像

PVDF：

聚偏二氟乙烯

TAA：

肿瘤相关抗原