透明质酸功能化 Gd₂O₃ 纳米颗粒：增强肿瘤 MRI 引导放疗

摘要

实体瘤定位不准和内在放射抗性严重阻碍放疗临床应用。本研究通过一锅法水热工艺制备透明质酸功能化氧化钆纳米颗粒（HA-Gd₂O₃ NPs），用于有效磁共振（MR）成像和肿瘤放射增敏。得益于 HA 功能化，制备的 HA-Gd₂O₃ NPs 直径 105 nm，在水中分散性良好、细胞毒性低、生物相容性优异，并通过 HA 受体介导的内吞作用轻易进入癌细胞细胞质。重要的是，HA-Gd₂O₃ NPs 作为 MRI 造影剂表现出高纵向弛豫率 (r₁) 6.0 mM⁻¹S⁻¹，并以剂量依赖方式增强放射增敏。这些发现表明，合成的 HA-Gd₂O₃ NPs 作为双功能诊疗一体化剂，在肿瘤诊断和放疗中具有巨大潜力。

引言

放疗广泛应用于癌症，涉及高能 X 射线在肿瘤部位沉积照射剂量，通过自由基损伤或 DNA 损伤杀灭肿瘤[1-4]。然而，放射敏感性差、肿瘤定位不准、病变与正常组织分辨差导致照射副作用，限制了放疗临床实施[5]。因此，开发增强肿瘤放射敏感性同时最小化全身副作用的方法至关重要。纳米技术与放疗结合是放射增敏的既定优先方向。

近年，纳米技术被视为癌症诊断和治疗的吸引人策略[6-11]。纳米颗粒（NPs）主要功能之一是基于 NPs 在肿瘤组织选择性积累的准确肿瘤靶向，包括被动靶向的增强渗透和滞留（EPR）效应、主动靶向和延长循环时间[12-14]。我们先前工作表明掺杂杂原子的碳 NPs 能有效调控其固有性质并引入有益特性[15-17]。有趣的是，NPs 可用作放射增敏剂[18]。高原子序数（高 Z）重金属 NPs（如 Au、Bi、Gd）作为有前景的放射增敏剂，因其高 X 射线光子捕获截面和康普顿散射效应可用于放射增敏治疗[19]。X 射线与高 Z 纳米颗粒相互作用时，释放的奥热电子和光电子等次级电子损伤癌细胞，在放疗中提供剂量增强[20]。迄今，基于钆的 NPs (GdNPs) 被证明为有效 MRI 造影剂 (CAs)[21,22]，能无创、实时区分正常组织与病变组织。这些缩短纵向弛豫时间影响纵向弛豫率 r₁[23]，但靶向不准常导致副作用。众所周知，透明质酸（HA）是靶向 HA 受体（如簇分化 44 (CD44)）部位的主要配体和药物递送载体[24-26]。

基于前人研究，我们利用 HA 作为靶向配体功能化 Gd₂O₃ NPs，赋予双重功能：高效肿瘤靶向 MRI 造影剂和放射增敏剂，克服内在放射抗性和肿瘤定位不准。此外，HA-Gd₂O₃ NPs 显示高纵向弛豫率 (r₁) 作为有前景的 MR 成像剂，成像质量更优。与现有 CAs[27,28] 相比，HA-Gd₂O₃ NPs 具有三大显著优势：首先，因使用天然细胞外基质作为前驱体，HA-Gd₂O₃ NPs 生物相容性良好。其次，HA 功能化显著改善肿瘤靶向并减少副作用。最后，HA-Gd₂O₃ NPs 具备诊断和治疗双重能力。为验证有效性并探究放射增敏增强机制，我们评估了 HA-Gd₂O₃ NPs 对肿瘤细胞活力、细胞周期和凋亡的放射增敏效应。

结果与讨论

HA-Gd₂O₃ NPs 制备与表征

本研究通过简单水热法成功制备 HA-Gd₂O₃ NPs（方案 1）。动态光散射分析粒径，透射电镜进行形貌检查。图 1a 显示 HA-Gd₂O₃ NPs 均匀分散、离散准球形，无明显聚集。平均直径 105 nm。与正常组织相比，肿瘤组织毛细血管内皮通透性增加，内皮间隙 100–600 nm[29]。因此，合适尺寸 NPs 易渗透肿瘤组织，可显著提高被动靶向药物递送效率。

水热法合成 HA-Gd₂O₃ NPs (A) 及后续生物医学应用 (B) 示意图

HA-Gd₂O₃ NPs 表征. 低 (a) 和高 (b) 放大倍数 TEM 图像. 直径分布 (c) 和 XRD 图谱 (d)

以氧化石墨烯（GO）粉末为对照，XRD 分析 HA-Gd₂O₃ NPs 相结构。图 1d 显示 HA-Gd₂O₃ NPs 衍射图谱呈一主衍射峰 (2θ = 12.04°) 和两次要峰 (2θ = 29.6°, 42.1°)，分别对应 GO (100 晶面) 和石墨 (002 晶面) 特征峰。HA-Gd₂O₃ NPs 主晶格间距 0.73 nm（布拉格公式计算），小于 GO 的 d₀₀₁ = 0.85 nm，峰位上移可能归因于 sp³ 层间距减小。所有宽衍射峰表明 HA-Gd₂O₃ NPs 为非晶结构，可能归因于碳化过程中高度无序碳和 sp² (C-C) 层间距减小。结果进一步表明 HA-Gd₂O₃ NPs 晶度差、具异质多层结构，与我们先前关于碳点的报道一致[30,31]。

HA-Gd₂O₃ NPs 化学结构与表面组成

利用傅里叶变换红外光谱和 X 射线光电子能谱研究 HA-Gd₂O₃ NPs 表面官能团和组成。图 2a XPS 全谱显示 284.0、400.0、530.6、1188.5 eV 四个典型峰，表明 HA-Gd₂O₃ NPs 主要由钆、碳、氧、氢元素组成。Gd 3d 高分辨率谱（图 2b）显示 1187.5 eV 和 1221 eV 两强峰，自旋-轨道劈裂 32 eV，分别对应 Gd 3d_5/2 和 3d_3/2 能级，与 HA-Gd₂O₃ NPs 前人报道吻合。O 1s 谱（图 2c）以 531.4 eV 主峰为主，对应 O²⁻ 与 Gd³⁺ 键合。裸 NPs 和 HA-Gd₂O₃ NPs 均进行 FTIR（图 2d）。裸样品（图 2a）在 1580 和 1380 cm⁻¹ 特征吸收带 v_as O-C-O 显示碳酸根存在。3340 和 2900 cm⁻¹ 宽峰分别归因于 O-H 和 C-H 伸缩振动，对应表面吸附水。HA-Gd₂O₃ NPs 在 1580 和 1380 cm⁻¹ COO⁻ 伸缩振动增强，表明引入透明质酸羧基。结果显示 HA-Gd₂O₃ NPs 表面官能团主要含大量羰基、羧基、羟基。这些位于表面的官能团赋予 HA-Gd₂O₃ NPs 极佳水分散性。重要的是，嵌入 NPs 表面的 Gd 离子可用于 MR 成像和放射增敏，显著防止 Gd 离子泄漏至周围环境。

HA-Gd₂O₃ NPs 化学结构和组成. a HA-Gd₂O₃ NPs 全扫描 XPS 谱. b Gd 3d 谱. c O 1s 谱. d HA-Gd₂O₃ NPs FTIR 谱

HA-Gd₂O₃ NPs 生物相容性

作为潜在生物医学制剂，HA-Gd₂O₃ NPs 生物相容性至关重要。首先，用 CCK-8 法评估 HA-Gd₂O₃ NPs 对 HepG2 和 VSMC 细胞固有细胞毒性。图 3a 和 S. 图 1 显示，HA-Gd₂O₃ NPs 3 天内无明显细胞毒性。即使 200 μg/mL 浓度孵育 24 h，细胞活力仍约 90%。其次，溶血实验评估 HA-Gd₂O₃ NPs 体内血液相容性。图 3b 显示水中（阳性对照）观察到红细胞溶血。相反，HA-Gd₂O₃ NPs 0–200 μg/mL 不同浓度孵育 2 h 无明显溶血，与 PBS（阴性对照）相似。与阴性对照比，基于 541 nm 上清液吸光度计算的不同浓度 HA-Gd₂O₃ NPs 溶血百分比均 <3%，验证良好血液相容性。为检查潜在毒性，HA-Gd₂O₃ NPs 静脉注射 Balb/c 小鼠（见 S. 图 2）。1 周后处死，收集膀胱、肾、脾做病理切片分析。S. 图 2 显示 HA-Gd₂O₃ NPs 处理组小鼠器官无明显病变或炎症反应。结果明确表明合成 HA-Gd₂O₃ NPs 具有良好细胞相容性和血液相容性。

a CCK-8 法检测 HA-Gd₂O₃ NPs 对 HepG2 和 VSMC 细胞活力影响. b HA-Gd₂O₃ NPs 不同浓度 (50, 100, 200, 300, 400 μg/mL) 溶血活性. PBS 和水分别为阴性和阳性对照

MRI 幻影研究

在磷酸缓冲液（pH 7.4, 0.2 M）中，与商业造影剂 Magnevist (Gd-DTPA) 对照，体外研究 HA-Gd₂O₃ NPs 纵向 (T₁) 弛豫时间。随 Gd 浓度增加，T₁ 加权幻影图像信号强度明显增强，表明所有样品均能在 T₁ 加权序列产生 MRI 造影增强（图 4a）。进一步，信号强度与反转时间绘图给出各造影剂特定浓度下 T₁ 弛豫时间。图 4b 显示 HA-Gd₂O₃ NPs r₁ 值为 6.0 mM⁻¹S⁻¹，显著高于同条件下 Magnevist (3.86 mM⁻¹S⁻¹)。增强的 r₁ 可归因于 HA-Gd₂O₃ NPs 更大流体动力学半径和表面积，更多掺杂晶格 Gd 原子接触水分子，缩短纵向弛豫增强 r₁ 值。

a 不同总 Gd 离子浓度 HA-Gd₂O₃ NPs T₁ 幻影图像. b 1/T₁ 对总 Gd 离子浓度对应绘图. c 静脉注射 HA-Gd₂O₃ NPs 作为造影剂后小鼠体内 T₁ MR 成像及分析. d 给药不同时间点膀胱和肾信号变化量化 (SNR 比) (n = 3). *p < 0.05

体内 MR 成像

为确定体内潜在应用，以正常 BALB/c 小鼠为模型，用 MRI 扫描仪研究 HA-Gd₂O₃ NPs (10 mg/kg) MR 成像性能和循环命运。与注射前图像比（图 4c），虚线圈标示的肾脏和膀胱更亮区域在注射后 10 分钟清晰观察到，表明 HA-Gd₂O₃ NPs 可作为 CAs 增强体内这些主要器官 T₁ 弛豫。重要的是，HA-Gd₂O₃ NPs 造影增强维持至注射后 60 分钟，远长于 Gd 复合小分子（小动物半寿命仅几分钟）[27]，表明 HA-Gd₂O₃ NPs 体内保留时间长于商业造影剂。为定量分析 MR 造影效应，通过精细分析 MRI 感兴趣区计算信噪比 (SNR)，计算 SNR_post/SNR_pre 代表相对信号增强 (RSE)（图 4d）。HA-Gd₂O₃ NPs 在肾脏 RSE 值为 1.35、1.99、1.86。膀胱 RSE 值高于肾脏（1.29、3.59、2.26）。大尺寸（>100 nm）HA-Gd₂O₃ NPs 显示长循环时间，可能经胆肠途径消除[32]。此外，体内延长循环时间可通过增强 EPR 效应增加肿瘤被动靶向。

肿瘤成像

HA-Gd₂O₃ NPs 优异 MR 成像性能和长循环时间为通过 EPR 效应成像肿瘤提供良机。我们建立皮下肝瘤模型，研究肝细胞癌（HCC）能否经 HA-Gd₂O₃ NPs 增强 MRI 检测。静脉注射 HA-Gd₂O₃ NPs 后，冠状和横断扫描均显示皮下肿瘤区域比周围组织更亮（图 5a）。皮下肿瘤 RSE 横断和冠状扫描分别显著达 1.54 和 1.83，表明 HA-Gd₂O₃ NPs 经 EPR 效应在肿瘤区有效富集。这些发现证明 HA-Gd₂O₃ NPs 对肿瘤 MRI 可视化高度敏感。许多研究表明长循环时间可通过实体瘤渗漏血管促进被动靶向效率[33]。

静脉注射 HA-Gd₂O₃ NPs 后 Heps 小鼠肝癌异种移植瘤 T₁ 加权 MR 成像 (a) 和定量分析 (b)

HA-Gd₂O₃ NPs 放射增敏增强

HA-Gd₂O₃ NPs 作为 T₁ 造影剂优异性能促使我们准确确定其在肿瘤放射增敏中的定位。首先，用 CCK-8 法探究联合治疗是否产生剂量增强。图 6a 显示，单独 HA-Gd₂O₃ NPs（0–200 μg/mL）不显著影响 HepG-2 活力，但 X 射线（0–9 Gy）照射使 HepG-2 活力在 9 Gy 降至 70% 以下。重要的是，X 射线照射联合 HA-Gd₂O₃ NPs 显著降低 HepG-2 活力至 50% 以下，特别是 200 μg/mL、9 Gy 时。接着，克隆形成实验评估 X 射线照射联合 HA-Gd₂O₃ NPs 后 HepG-2 细胞活力。图 6b 显示，单独 HA-Gd₂O₃ NPs 对 HepG-2 克隆形成无显著影响，但 X 射线照射使克隆形成降至 46.7%。然而，X 射线联合 HA-Gd₂O₃ NPs 处理显著抑制克隆形成活力至 29.8%。对应图像进一步验证 HA-Gd₂O₃ NPs 对 HepG-2 细胞放射增敏作用。

HA-Gd₂O₃ NPs 体外放射增敏效应. a HA-Gd₂O₃ NPs (0, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL) 与 X 射线 (0, 3, 6, 9 Gy) 协同效应对 HepG2 细胞活力影响 (CCK-8). *p < 0.05, **p < 0.01, 差异显著. b HepG2 细胞经 HA-Gd₂O₃ NPs 和 X 射线处理的克隆存活实验和 c 克隆形成能力定量分析. d 不同治疗组小鼠肿瘤体积生长曲线. 组别: a 对照, b 放射, c HA-Gd₂O₃ NPs, d 放射 + HA-Gd₂O₃ NPs. e 治疗结束不同组小鼠肿瘤照片

体外放疗有效性鼓励我们将 HA-Gd₂O₃ NPs 联合照射应用于肿瘤负荷小鼠抑制肿瘤生长。对照组和单独 HA-Gd₂O₃ NPs 处理组肿瘤体积快速增长，均增加 180%。相比单独照射 58%，HA-Gd₂O₃ NPs 联合放射 10 天后高效抑制肿瘤 38%（图 6d）。肿瘤拍照，各组平均肿瘤体积显示组 (a) 最大，组 (d) 最小（图 6e）。结果表明制备 HA-Gd₂O₃ NPs 在 X 射线照射下对抑制肿瘤生长极具前景。

流式细胞术和活/死染色实验进一步理解 HA-Gd₂O₃ NPs 联合 X 射线放射增敏机制。图 7a 显示，单独 HA-Gd₂O₃ NPs 处理 HepG-2 细胞观察到强绿荧光无红色，验证高细胞活力。X 射线单独处理观少量红荧光，指示低水平细胞凋亡。然而，HA-Gd₂O₃ NPs (200 μg/mL) 联合放射观察到强红荧光，证明 HA-Gd₂O₃ NPs 可显著增强 X 射线诱导细胞凋亡。流式细胞术进一步研究 HA-Gd₂O₃ NPs 放射增敏机制。图 7b 显示，单独放射和 HA-Gd₂O₃ NPs 分别诱导 27.55% 和 19.12% G2/M 期阻滞。然而，联合处理显著增加 G2/M 期阻滞，随剂量依赖从 30.89% 至 33.27%。同时，联合处理诱导凋亡细胞死亡从 10.63% 至 22.67%（sub-G1 比例反映），单独 HA-Gd₂O₃ NPs 和放射分别诱导 3.02% 和 13.87%。为进一步探究细胞死亡可能机制，流式细胞术进行 Annexin V-EGFP/PI 法。Annexin V-EGFP 发射信号绘于 x 轴，PI 发射信号绘于 y 轴（图 8）。坏死细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、活细胞数量分别由 Annexin V⁻/PI⁺ (Q3)、Annexin V⁺/PI⁺ (Q2)、Annexin V⁻/PI⁻ (Q4) 百分比确定。对照组和单独 HA-Gd₂O₃ NPs (100 μg/mL) 组细胞凋亡百分比 <5%，影响微弱。相比单独放射组 (8.8%)，HA-Gd₂O₃ NPs 联合放射凋亡率随浓度增加 (50 至 200 μg/mL) 升高。特别地，早期凋亡率明显增加至 33.2%，早晚期凋亡总计达 44.3%（200 μg/mL）。总体而言，HA-Gd₂O₃ NPs 联合 X 射线照射对细胞克隆形成、剂量依赖性细胞活力及放射增敏增强具有协同效应。基于这些结果，HA-Gd₂O₃ NPs 可能成为增强放疗放射增敏的有效替代方案。

HA-Gd₂O₃ NPs 辐射剂量增强. a HepG2 细胞活/死染色. 绿色 (荧光素二乙酸酯染色) = 活细胞, 红色 (碘化丙啶染色) = 死细胞. 比例尺 = 200 mm. b 不同处理后细胞周期分布, 通过流式细胞术量化 DNA 含量分析

HA-Gd₂O₃ NPs 凋亡分析. a X 射线照射 24 h 后 HepG-2 细胞凋亡水平. b 定量分析

结论

总之，我们通过一锅法水热工艺开发了用于肿瘤有效 MR 成像和放射增敏的双功能 HA-Gd₂O₃ NPs。HA 修饰后，合成 HA-Gd₂O₃ NPs 表现出良好水分散性、优异生物相容性。封装 Gd 原子的 HA-Gd₂O₃ NPs 不仅作为 T₁ 造影剂有效展现高纵向弛豫率 (r₁) 用于 MRI，还作为放射增敏剂通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期增强肿瘤放射敏感性。因此，新型 HA-Gd₂O₃ NPs 在肿瘤诊断和放疗中显示出巨大潜力。

材料与方法

材料

荧光素二乙酸酯 (FDA) 和碘化丙啶 (PI) 购自 Sigma (美国纽约)。GdCl₃·6H₂O、乙二醇 (99%) 购自恒瑞制药 (中国江苏连云港)。细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 购自 Dojindo (日本熊本)。NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、H₂SO₄ 购自广福精细化工研究院 (中国天津南开)。胎牛血清和 Dulbecco 改良鹰培养基 (DMEM) 购自 Invitrogen 中国 (上海)。所有化学品均为分析纯，未经进一步纯化直接使用。

HA-Gd₂O₃ NPs 合成

HA-Gd₂O₃ NPs 采用一锅法水热法制备：首先，0.1 g HA 在 20 mL 水中室温剧烈搅拌过夜溶解。随后分别加入 0.1 g GdCl₃·6H₂O 和 0.5 mL NaOH (1 M)。再搅拌 5 分钟形成均匀透明溶液，转入 50 mL 高压釜，密封，120°C 水热处理 6 h。自然冷却至室温后，0.22 μm 滤膜过滤去除大团聚物。制备溶液在 14 kDa 分子量截留透析袋中透析 3 天。收集透析液，真空冷冻干燥机冻干。获得 HA-Gd₂O₃ NPs 粉末供进一步表征。

仪器与表征

HA-Gd₂O₃ NPs 形貌经 JEM-2100 透射电镜 (JEOL, 日本东京) 200 kV 加速电压高分辨检查。元素组成经 MK II 光电子能谱仪 XPS 测定，Al-Kα (1486.6 eV) 为 X 射线源，傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱仪 (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, USA)。HA-Gd₂O₃ NPs 晶体结构经 Rigaku-D/MAX2500 X 射线衍射仪 (Rigaku, 日本) Cu Kα (λ=0.15405 nm) 辐射、4°/min 扫描速度、5–80° 范围表征。

细胞活力实验

经 CCK-8 实验研究 HA-Gd₂O₃ NPs 对细胞活力影响。HepG2 (人肝癌, ATCC: HB-8065) 和 VSMCs (血管平滑肌细胞) 以 3×10³ 细胞/孔密度接种 96 孔板，37°C、5% CO₂ 培养 24 h，用含不同浓度 HA-Gd₂O₃ NPs (0, 25, 50, 100, 200 μg/mL) DMEM 替换培养基。再孵育 4 h，每孔加 10 μL CCK-8 溶液，避光孵育 4 h。Synergy HT 多模式微孔板读数仪 (Bio Tek, 美国佛蒙特) 490 nm 测吸光度。未处理细胞 (DMEM) 为对照，相对细胞活力 (均值±SD, n=5) 表示为 Abs_sample/Abs_control × 100%。

溶血实验

简述：19–21 g、6 周龄雌性 BALB/c 小鼠按中国卫生部动物管理规则准备。取出眼球获 3 mL 肝素钠抗凝血液，1200 rpm、15 min 离心去上清。按文献用 PBS 洗沉淀 5 次获小鼠红细胞 (MRBCs)，再取 3 mL 眼球血肝素抗凝，1200 rpm、15 min 离心去上清，PBS 洗 5 次获 MRBCs。PBS 稀释 10 倍，0.1 mL MRBCs 转入预装 0.9 mL PBS（含不同浓度 50–200 μg/mL HA-Gd₂O₃ NPs）、0.9 mL 水（阳性对照）、0.9 mL PBS（阴性对照）的 1.5 mL 管。轻摇后室温孵育 2 h，12,000 rpm 离心 1 分钟。拍照所有样品，UV-2450 UV-Vis 分光光度计测上清液（血红蛋白）541 nm 吸光度。按样品、阳性、阴性对照 541 nm 吸光度差计算不同样品溶血百分比。

体外和体内 MR 幻影研究

3.0 T MRI 扫描仪 (Magnetom Trio Tim, 西门子, 德国) 采集体外体内 MR 图像。体外 T₁ 幻影研究：0–16 mM 不同浓度 HA-Gd₂O₃ NPs 溶液加入 96 孔培养板，商业 Magnevist (Gd-DTPA) 为对照。体内 MR 成像：选正常 BALB/c 小鼠模型 (n=4)。动物实验严格遵守中国卫生部动物管理规则。10 mg/kg HA-Gd₂O₃ NPs 经 0.22 μm 灭菌滤膜过滤后静脉注射，即刻 MRI 扫描。体外体内样品成像参数：TR/TE = 300/10 ms, 256×256 矩阵, 层数=5, 厚度=2 mm, 平均数=2, FOV=80×80。

体外放射增敏效应

CCK-8 实验评价 HA-Gd₂O₃ NPs 体外放射增敏活性。5 块 96 孔板以 3×10³ 细胞/孔密度接种，相同条件：37°C、5% CO₂ 培养 24 h，用含不同浓度 HA-Gd₂O₃ NPs (0, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL) DMEM 替换培养基。孵育 4 h 后，五块板分别用不同 X 射线剂量 (0, 3, 6, 9 Gy)、300 cGy/min 照射。照射后所有板再孵育 4 h，同参数测吸光度。

克隆形成存活实验也研究体外放射增敏效应。HepG2 细胞以 4.0×10⁴ 细胞/孔接种 6 孔板生长 16 h。细胞用细胞培养基稀释 HA-Gd₂O₃ NPs 孵育 6 h。临床直线加速器 (Oncor, 西门子, 德国) 6 MeV、10 cm×10 cm 照射野、源皮距离 (SSD) 100 cm 覆盖所有细胞，照射 6 Gy。照射细胞继续生长 14 天，4% 多聚甲醛室温固定 40 min，洗涤后 1% 结晶紫染色。

活/死染色与流式细胞术

研究 HA-Gd₂O₃ NPs 放射增敏效应：HepG2 细胞 4.0×10⁴ 细胞/孔接种 6 孔板生长 12 h，分六组（对照、HA-Gd₂O₃ NPs、放射、放射+50 μg/mL HA-Gd₂O₃ NPs、放射+100 μg/mL HA-Gd₂O₃ NPs、放射+200 μg/mL HA-Gd₂O₃ NPs）。细胞长至 80% 融合度，第一组无处理，第二组孵育 100 μg/mL HA-Gd₂O₃ NPs 24 h，第三组仅照射，第四至六组照射后孵育不同浓度 HA-Gd₂O₃ NPs (50, 100, 200 μg/mL) 24 h。加入 FDA 和 PI 工作液染色。荧光显微镜 (×20) 观察染色细胞荧光，活细胞绿色、死细胞红色。此外，不同处理细胞 PBS 洗 3 次、消化、收集、2000 rpm 离心 5 min，70% 乙醇 -20°C 过夜固定后 PI 染色。流式细胞仪 (BD, Accuri, C6) 测 PI 荧光强度量化 DNA 片段，软件 (FLOWJO 7.6.2) 分析细胞周期分布。

体内放射增敏效应

19–21 g、6 周龄雌性 BALB/c 小鼠来自扬州大学实验动物中心标准条件。动物实验符合中国卫生部动物管理规则。皮下肿瘤模型建立步骤：首先，1×10⁶ HepS 细胞腹腔接种小鼠，5 天后收集腹水。腹水皮下注射。肿瘤体积达 ~100 mm³ 建立皮下肿瘤模型用于后续实验。

每组 8 只带瘤小鼠，3 Gy/次 分割照射，7 天内总剂量 9 Gy。放疗在 HA-Gd₂O₃ NPs (10 mg/kg) 静脉注射 3 h 后进行，西门子 Primus 临床直线加速器 (6 MeV) 用自制装置覆盖整个肿瘤。1% 戊巴比妥 (50 mg/kg) 麻醉确保照射固定。游标卡尺测量记录肿瘤长 (a) 短 (b) 径，公式 V = 0.5 × a × b² 计算体积 (V mm³)。相对肿瘤体积归一化初始大小。每组 8 只，Student 双尾 t 检验统计分析 (*p < 0.05, **p < 0.001)。

数据与材料可用性

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