无膦合成抑制再吸收的ZnSe/CdS/ZnS核壳量子点及其在高灵敏CRP检测中的应用

摘要

我们描述了一种无膦、单锅法制备ZnSe/CdS/ZnS核壳量子点（QDs），结合II型和I型带隙排列抑制再吸收。所得红光发射QDs实现82%光致发光量子产率（QY）和卓越光学稳定性。相比传统I型QDs，复合QDs展现显著更大斯托克斯位移和减少再吸收，转化为更高荧光输出。利用这些特性，我们将QDs作为荧光标记用于荧光免疫吸附测定（FLISA）检测C-反应蛋白（CRP）。该测定达成0.85 ng mL⁻¹检测限（LOD）——比基于CdSe/ZnS的FLISA（1.00 ng mL⁻¹）灵敏度高15%。结果表明ZnSe/CdS/ZnS II型/I型QDs是生物医学诊断和光子应用的有力候选者。

背景

半导体核壳QDs具备优异光学性质——宽发射范围、高量子产率（QY）和稳健化学稳定性——使其成为诊断、成像和光电子学理想荧光标记[1-7]。其电子结构按带隙排列分三类：I型、反I型和II型。I型QDs将电子和空穴限域在核内，增强辐射复合并将活性核与表面缺陷隔离[6-9]。然而，I型QDs常见的小斯托克斯位移（≈10 nm）导致显著再吸收，降低发射强度并限制定量分析[10,11]。II型QDs将电子空穴分离至核壳界面，产生红移发射和平坦一阶激子吸收峰。这减少光谱重叠、抑制再吸收、改善定量检测[12-13]。ZnSe/CdS II型QDs覆盖蓝紫至红发射并抑制再吸收[13]，但富Cd壳层易受表面陷阱淬火和生物毒性影响。外包ZnS壳层既钝化表面、提高QY又限制Cd析出[14-15]。先前ZnSe/CdS/ZnS QDs合成需剧毒膦且多步纯化，无生物应用报道。

本文引入无膦单锅法制备高质量红光发射ZnSe/CdS/ZnS QDs抑制再吸收。方法采用低毒Se前驱体（ODE-Se）和锌油酸盐形成ZnSe核，随后原位生长CdS和ZnS壳层无中间纯化——利于规模化生产。QDs达82% QY且Cd含量降低，大斯托克斯位移和平坦吸收谱产生低再吸收。最后演示其作为荧光探针在CRP FLISA中首次应用，达成0.85 ng mL⁻¹ LOD——优于CdSe/ZnS参比测定。

方法

化学品

所有试剂直接使用：CdO（99.99%）、ZnO（99.9%）、Se（99.9%）、1-十八烯（ODE，90%）、1-辛硫醇（OT，98%）、油酸（OA，90%）、PMAO、MES及标准实验溶剂（液体石蜡、丙酮、正己烷、甲醇）。缓冲成分（NaOH、HCl、Na₂CO₃、NaHCO₃、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、H₃BO₃、Na₂B₄O₇·10H₂O、Tween-20）来自上海桑工有限公司。BSA和小牛血清来自Sigma。EDC、磺基-NHS和微孔板来自Thermo Fisher Scientific。小鼠抗CRP单克隆抗体和CRP抗原来自Abcam。所有化学品未经进一步纯化直接使用。

Se前驱体（0.1 M）

Se（6 mmol）溶于60 mL ODE，氮气保护下220°C加热180 min，得澄清黄色溶液。

Zn和Cd前驱体

ZnO（30 mmol）与30 mL OA和45 mL ODE混合，氮气下310°C加热成澄清溶液；冷却至140°C备用注射。Cd前驱体制备相同，但240°C和0.2 M浓度。

ZnSe/CdS/ZnS II型/I型QDs合成

典型运行：4 mL Se前驱体和15 mL ODE加热至310°C。此温度下快速注入2 mL Zn前驱体。间隔取样监测PL位移关联颗粒生长。核达所需尺寸后降温至230°C生长CdS壳。Cd前驱体和OT（OT:阳离子=1:1.2）以3 mL h⁻¹滴加同时升温至310°C。ZnS壳同法生长。QDs经丙酮沉淀纯化，氯仿重分散。

CdSe/ZnS I型QDs

按既定方案[7]合成，后续相转移和FLISA制备与ZnSe/CdS/ZnS流程相同。

水相转移

用多马来酸酐-十八烯（PMAO）两性低聚物使疏水QDs水溶。QDs和PMAO溶于氯仿（QD/PMAO=1:7）超声，45°C旋干氯仿。加入等体积0.1 M NaHCO₃（pH 8.5）溶解复合物。所得QDs-PMAO保留全荧光，在宽pH范围展现优异水相稳定性。

QDs-抗体偶联

QDs-PMAO经EDC/磺基-NHS活化连接羧基至单克隆CRP抗体。PBS孵育和BSA封闭后，离心洗涤，50 µL BS缓冲液（5 mM，pH 8.0）中保存。

抗体包被微孔板制备

微孔板孔用1.8 mg mL⁻¹ CRP单克隆抗体（50 mM碳酸氢碳酸盐缓冲液，pH 9.6）包被，4°C孵育24 h，0.05% Tween-20在10 mM PBS中洗涤三次，0.5% BSA在PBS（pH 7.4）中封闭过夜。板干燥4°C保存。

FLISA定量CRP

各孔加入100 µL标准CRP或样品（缓冲液稀释），37°C孵育30 min，洗涤五次。加入100 µL QDs-mAb探针（10%小牛血清/PBS稀释），孵育洗涤同上。

表征

UV-vis吸收和PL谱用Ocean Optics PC2000-ISA分光光度计记录。QY相对乙醇中Rhodamine 101（QY=100%）测定。TEM成像用JEOL JEM-2010（200 kV）。相分析用D8-ADVANCE XRD（Cu-Kα，λ=1.54 Å）。动态光散射（Nano-ZS 90，Malvern）测定水动力学直径。

结果与讨论

壳层生长过程中UV-vis和PL谱演变见图1。裸ZnSe核显示420 nm吸收和428 nm发射（FWHM=17 nm）。加单层CdS将斯托克斯位移扩至54 nm，吸收497 nm、发射551 nm（FWHM=38 nm）。后续CdS壳层生长进一步红移PL至629 nm，FWHM展宽至52 nm，反映增强激子-声子耦合。平坦一阶激子吸收峰和强短波吸收（<500 nm）共同减少光谱重叠，有效抑制再吸收。ZnS壳随后蓝移发射并窄化FWHM至43 nm，QY随CdS/ZnS生长序列从20%升至82%。

图2确认结构演变：XRD峰锐化并移至六方CdS和ZnS位置，指示成功多壳生长和锌闪锌矿向纤锌矿相变。TEM图像（图2a-f）显示单分散球形QDs从3.90 nm（核）扩展至11.92 nm（全核壳）。HRTEM晶格间距（ZnSe 0.32 nm、CdS 0.35 nm、ZnS 0.31 nm）匹配XRD数据，确认成分保真度。

EDS分析（表S1）显示CdS壳层生长期间Cd/(Zn+Cd)比因>200°C阳离子交换而增加，但总Cd含量低（~13%）远低于典型I型CdSe/CdS/ZnS QDs（~40%）。降低Cd负载减轻生物毒性。

PMAO水相转移（图S1）保留PL强度和形貌，经UV-vis、PL、TEM和FTIR光谱确认。FTIR光谱显示成功酐环开环和QD表面COOH形成。

稳定性测试（图3）显示疏水QDs经反复纯化保留85% PL，PMAO包裹QDs在PBS中400 h、pH 1-13、高达90°C下维持>85% PL（90°C剩余76% PL）。确认适合生物测定。

与CRP抗体偶联（图4a）因分离损失降低PL强度~40%但保留光谱形状。DLS显示水动力学直径从46 nm（QDs-PMAO）增至120 nm（QDs-mAb），确认成功偶联无团聚。

用QDs-mAb进行FLISA（图5a）得清晰二次剂量响应（R²=0.9991），0-400 ng mL⁻¹范围。LOD 0.85 ng mL⁻¹超越CdSe/ZnS参比15%。回收实验（表1）显示低、中、高CRP浓度下83.6-105.9%准确度，凸显测定可靠性。

结论

我们开发了无膦、可规模化合成抑制再吸收的ZnSe/CdS/ZnS核壳QDs，结合II型和I型带隙结构。QDs提供高QY（82%）、大斯托克斯位移和优异稳定性，实现高灵敏CRP FLISA检测（LOD=0.85 ng mL⁻¹）。这些特性使ZnSe/CdS/ZnS QDs成为生物医学诊断和光电子器件的有前景工具。

缩略语

BSA

牛血清白蛋白

CRP

C-反应蛋白

DLS

动态光散射

EDC

1-乙基-3-(3-(二甲氨基)丙基)碳二亚胺

EDS

能量色散X射线光谱

ELISA

酶联免疫吸附测定

FLISA

荧光免疫吸附测定

FWHM

半高全宽

LOD

检测限

MES

2-(N-吗啉基)乙烷磺酸

OT

1-辛硫醇

PMAO

聚(马来酸酐-alt-1-十八烯)

QDs

量子点

QYs

量子产率

sulfo-NHS

N-羟基磺基琥珀酰亚胺