重吸收抑制的 II 型/I 型 ZnSe/CdS/ZnS 核/壳量子点的合成及其在免疫吸附测定中的应用

背景

荧光核/壳半导体量子点 (QD) 具有优异的光学特性，例如比传统有机染料更宽的发射范围、更高的光致发光 (PL) 量子产率 (QY) 以及更高的光学和化学稳定性。这些优势为生物医学诊断、分子成像和光电领域的荧光标记的革命性进步提供了机会 [1,2,3,4,5,6,7]。根据核壳材料之间的能带排列，核壳量子点可分为I型、反向I型和II型结构。 I型量子点以“嵌套”带排列结构为特征，可以将电子和空穴限制在核心区域以增强辐射复合，并将光学活性核心的表面与其周围介质物理分离，从而提高PL强度和光学稳定性 [6,7,8,9]。尽管有这些有利的特性，一个小的斯托克斯位移（只有十几纳米），被称为吸收光谱和 PL 光谱之间的差异，会产生严重的重吸收，导致整体发射损失并限制它们在定量测定中的应用 [10, 11]。相比之下，具有交错带隙排列的 II 型 QD 促进电子和空穴空间分离到核/壳结构的不同区域。随后的带边 e-h 复合跃迁能量小于任一组成材料组分的带隙，导致显着的红移发射，这对于任何一种单组分材料都是不可用的。与核心 QD 相比，II 型 QD 的第一激子吸收特征的振荡器强度显着降低 [12, 13]。较大的红移发射和平坦的第一激子吸收峰都降低了吸收和发射光谱的重叠，从而抑制了重吸收，有利于生物定量检测。典型的 II 型 ZnSe/CdS QD 具有从蓝紫色到红色范围的可调发射和抑制重吸收 [13]。然而，在 CdS 壳中离域的电子容易被表面缺陷或周围介质捕获，导致荧光量子产率低。一个可行的解决方案是用 ZnS 最外壳包覆 ZnSe/CdS 量子点，不仅可以钝化表面以提高量子产率和光学稳定性，还可以限制有毒 Cd 元素的泄漏，降低生物毒性。迄今为止，大多数研究都集中在 I 型 QDs 上，而对 ZnSe/CdS/ZnS II 型/I 型 QDs 的研究很少[12,13,14,15]。此外，所有关于 ZnSe/CdS/ZnS QD 合成过程的研究都使用了预纯化粗 ZnSe 核心 QD 的两步制备方法，并使用了有毒且昂贵的膦。此外，均未涉及ZnSe/CdS/ZnS量子点在生物检测中的应用。

在这里，我们报告了一种无磷化氢的一锅法合成高质量的红色发射 ZnSe/CdS/ZnS II 型/I 型核/壳量子点，其具有重吸收抑制的特性，并首次使用该量子点来制作荧光连接免疫吸附测定 (FLISA)。我们使用高反应性和低毒性的 Se 前体 (ODE-Se) 和油酸锌合成了高质量的 ZnSe 核量子点，然后在不纯化核量子点的情况下实现了多壳层生长。这显示出大规模合成核/壳量子点的巨大希望。所制备的红色发光 ZnSe/CdS/ZnS II 型/I 型 QD 的量子产率可高达 82%，并且有毒镉含量较低，这对于降低生物医学领域的生物毒性尤为重要。此外，QDs具有较大的Stokes位移和平坦的第一吸收峰，导致PL和吸收光谱的重叠较低，抑制了重吸收效应。

C-反应蛋白（CRP）作为一种来自肝细胞的急性期蛋白，被认为是感染和自身免疫性疾病的早期指标。此类疾病通常始于非常低的 CRP 水平。因此，对生物样品中 CRP 水平进行灵敏的定量免疫测定分析对于诊断和监测疾病的演变至关重要 [16]。与传统的酶联免疫吸附试验 (ELISA) 相比，FLISA 无需酶促反应即可节省时间，并且由于荧光 QD 的光学质量而对环境条件不太敏感 [17]。因此，FLISA已成为定量免疫分析的一个新的研究热点[2, 18,19,20,21]。在这里，我们首先展示了使用水溶性 ZnSe/CdS/ZnS II 型/I 型核/壳 QD 作为荧光探针的 FLISA 定量免疫分析。在对照实验中，CRP 蛋白定量检测的检测限 (LOD) 达到 0.85 ng/mL，比基于 CdSe/ZnS I 型 QD 的 FLISA 的灵敏度高 15%。 ZnSe/CdS/ZnS type-II/type-I QDs的高QYs、优异的光学稳定性和低重吸收效应可能会促进其在生物医学和光电领域的应用。

方法

化学品

氧化镉（CdO，99.99%），氧化锌（ZnO，99.9%，粉末），硒（Se，99.9%，粉末），1-十八碳烯（ODE，90%），1-辛硫醇（OT，98%），油酸（OA，90%）聚（马来酸酐-alt-1-十八碳烯）（PMAO）和 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）购自 Aldrich。石蜡油（分析级）、丙酮（分析级）、己烷（分析级）和甲醇（分析级）购自中国北京化学试剂有限公司。 NaOH、HCl、Na2CO3、NaHCO3、KH2PO4、Na2HPO4、H3BO3、Na2B4O7 · 10H2O和Tween-20购自中国上海生工股份有限公司。牛血清白蛋白 (BSA) 和小牛血清购自 Sigma。 1-乙基-3-（3-（二甲氨基）丙基）碳二亚胺（EDC）、N-羟基磺基琥珀酰亚胺（磺基-NHS）和微孔板购自Thermo Fisher Scientific（美国）。小鼠抗 C 反应蛋白单克隆抗体和 CRP 抗原购自 Abcam（美国）。所有化学品和溶剂均按原样使用，无需进一步纯化。

Se 前体 (0.1 M) 的原液

将 Se (6 mmol) 和 ODE (60 mL) 装入 100 mL 三颈烧瓶中，然后在氮气下加热至 220 °C 180 min，得到黄色澄清溶液。

锌前体 (0.4 M) 和镉 (0.2 M) 的原液

将 ZnO (30 mmol)、油酸 (30 mL) 和 45 mL ODE 装入 100 mL 三颈烧瓶中，并在氮气下加热至 310 °C 以获得澄清溶液。使所得溶液冷却至 140°C 以进行注射。 Cd前驱体的制备过程与Zn前驱体相同，只是将浓度调整为0.2 M，反应温度设置为240°C。

ZnSe/CdS/ZnS Type-II/Type-I QDs 的典型合成

作为典型的合成程序，将 4 mL Se 前体和 ODE (15 mL) 放入 100 mL 圆形烧瓶中。将混合物加热至 310°C。在此温度下，将 2 mL Zn 前体快速注入反应烧瓶中。在不同的时间间隔提取等分试样以监测与 QD 粒径协调的 PL 位置的演变。当核心纳米晶体达到所需尺寸时，为了 CdS 壳生长，反应温度降低到 230°C。没有任何纯化步骤，因为 Cd 前体和 1-辛硫醇的混合物（OT 和阳离子的摩尔比为 1:1.2）开始用注射泵以 3 mL/h 的速率逐滴加入，同时温度为升高到 310°C。相同的过程适用于 ZnS 的壳生长。在反应过程中取出 QD 的等分试样，以分析 ZnSe/CdS/ZnS 核/壳 QD 的发展。所制备的核/壳量子点通过加入丙酮进行纯化，然后再分散在氯仿中。

CdSe/ZnS Type-I 量子点的典型合成

CdSe/ZnS QD 的合成如我们之前的报告 [7] 中所述。随后，相转移过程、QDs-抗体检测探针和FLISA的制备与ZnSe/CdS/ZnS QDs的相同，将在下面描述。

用于生物应用的 ZnSe/CdS/ZnS QD 的相转移

聚（马来酸酐-alt-1-十八碳烯）（PMAO）——一种两亲性低聚物，其疏水端与量子点上的有机涂层交错，亲水端基可以自由与周围的缓冲液相互作用——已被用于将疏水性量子点转化为纯水。将 ZnSe/CdS/ZnS QD 和 PMAO 混合并溶解在氯仿中，超声处理（QD/PMAO 的摩尔比为 1:7）。之后，然后通过在 45°C 下旋转蒸发除去氯仿。然后，加入等体积的 0.1 M NaHCO3 水溶液（pH =8.5）以溶解 QDs-PMAO。 PMAO封装的ZnSe/CdS/ZnS II型/I型QDs没有荧光损失，在较宽的pH环境下在水溶液中具有高稳定性。

QDs-抗体检测探针的制备

该程序已在以前的文献中广泛报道 [1,2,3]。 QDs-PMAO首先通过EDC和磺基-NHS激活这些-COOH基团与单克隆CRP抗体偶联。接下来，将一定量的单克隆 CRP 抗体加入 QD 并溶解在 BS 缓冲液中，然后用 BSA 封闭。最后，在离心下用5mM BS缓冲液(pH =8.0)洗涤产物。 QDs-mAb 储存在 50 μL BS 缓冲液（5 mM，pH =8.0）中。

抗体包被的荧光微孔板的制备

一抗（CRP单克隆抗体的浓度为1.8mg/mL）在微孔板的每个孔中用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（50mM pH =9.6，CB缓冲液）稀释。随后，用密封膜覆盖微孔板并在 4°C 下孵育 24 小时。为了去除额外的包被抗体，将微孔板用洗涤缓冲液（0.05% Tween-20 在 10 mM PBS 中，pH =7.4）洗涤 3 次。然后，用 0.5% (w/v) BSA 的 10 mM PBS (pH =7.4) 封闭多余的结合位点，在 4°C 下孵育过夜。该过程确保微孔板孔的所有可用和剩余结合面都被覆盖。微孔板在恒温恒湿室中干燥 24 小时，然后在 4°C 下储存以备将来使用。

通过荧光相关免疫测定法定量检测 CRP

在 96 孔微孔板的每个孔中，加入 100 μL 标准抗原并用样品缓冲液稀释至一系列浓度。将板在 37°C 下孵育 30 分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤五次。接下来，将 100 μL QDs-mAb 探针用探针缓冲液（0.1 M PBS 中的 10% 小牛血清 (v/v)）稀释到每个孔中，按照上述过程进行孵育和洗涤。

特征化

使用海洋光学分光光度计（模式 PC2000-ISA）测量室温 UV-vis 吸收和 PL 光谱。 PL 量子产率 (QYs) 通过比较溶液中 QD 样品的积分荧光强度与已知 QYs 的标准（罗丹明 101 (R101) 乙醇溶液（0.01% HCl，QY =100%）作为标准）的积分荧光强度来确定.使用在 200 kV 下运行的 JEOL JEM-2010 电子显微镜进行透射电子显微镜 (TEM) 研究。在 X 射线衍射仪 (D8-ADVANCE) 上使用 Cu-Ka 辐射（波长 =1.54 Å）对产物进行相测定。使用动态光散射（Nano-ZS 90，Malvern Instruments，UK）记录量子点和量子点抗体探针的大小。

结果与讨论

壳生长过程的 UV-vis 吸收和 PL 光谱如图 1 所示。ZnSe 核的斯托克斯位移仅为 8 nm，第一个吸收峰位于 420 nm，发射峰位于 428 nm，发射全宽为一半最大 (FWHM) 为 17 纳米。然而，当只有一个单层 (ML) 的 CdS 壳在 ZnSe 核上生长时，斯托克斯位移显着增加到 54 nm，第一个吸收峰位于 497 nm，发射峰位于 551 nm，发射全宽为半峰宽 (FWHM) 38 纳米。由于电子波函数的离域，ZnSe/CdS QD (629 nm) 的 PL 发射相对于 ZnSe 核心 QD (428 nm) 发生红移，并且 FWHM 随着 CdS 壳层的沉积而展宽至 52 nm。加宽的 PL FWHM 源自增强的 Frölich 样激子 - 声子相互作用 [22, 23]。此外，由于从 ZnSe 的价带到 CdS 的导带的空间间接 II 型跃迁，第一个吸收峰的振子强度迅速减弱。这种现象在 II 型 QD 中很常见 [24,25,26]。而蓝色光谱区域 (<500 nm) 的吸收急剧增加归因于体 CdS 材料的带隙 (2.42 eV)。因此，ZnSe/CdS II 型 QD 的红色发射、平坦的第一激子吸收峰和短波长区域 (<500 nm) 的强吸收导致大斯托克斯位移并抑制重吸收。随着 ZnS 壳的连续生长，PL 向短波长移动，FWHM 从 52 nm 变窄到 43 nm。这种现象归因于Zn原子在高温下扩散到富Cd区域形成梯度壳，从而增加了壳的带偏移。在CdS和ZnS在ZnSe核上的壳生长过程中，QYs可以从20%增加到82%。

ZnSe/CdS/ZnS核/壳量子点连续生长后紫外-可见吸收光谱和PL光谱的演变

值得注意的是，在核心溶液中，Zn-OA 前体相对于 Se 前体过量是获得高质量和单分散 ZnSe 核心 QD 所必需的。因此，在初始阶段添加 Cd-OT 壳前驱体过程中不可避免地会形成 ZnCdSeS 合金壳，因为高温 (>200°C) 促进了 Zn ²⁺ 和 Cd ²⁺ , 并且 Cd-OT 前体中富含的辛硫醇也可以与过量的 Zn-OA 发生反应 [7, 12, 27, 28]。合金壳不仅可以降低界面张力和缺陷以增加QY，还可以为空穴产生能垒。 ZnCdSeS合金壳材料的导带边缘位于ZnSe和CdS之间，而价带边缘比CdS深。这在价带边缘形成了一个更大的电位槽，作为空穴的额外阻挡层（方案 1）[12]。这种能带结构可以进一步减少电子和空穴的重叠，从而降低第一激子吸收峰的强度并抑制重吸收。

示意图结构（向上 ) 和波段对齐 (bottom ) ZnSe/CdS/ZnS type-II/type-I QDs，分别基于相应的突变界面和合金界面

通过核和核/壳纳米晶体的 XRD、TEM 和 HRTEM 的比较，可以进一步验证核/壳带结构以及壳生长过程中 PL 和吸光度的演变。 ZnSe 核、ZnSe/CdS 和 ZnSe/CdS/ZnS 核/壳（图 2 的左图）的粉末 XRD 谱显示衍射峰变得尖锐并移动到与体纤锌矿 (WZ) CdS 对应的位置或 ZnS 晶体结构。该结果与在最终核/壳 QD 中与 ZnSe 核相比更大体积的 CdS 或 ZnS 壳的预测值一致，并证明了多壳的生长。此外，CdS 和 ZnS 涂层发生了从闪锌矿 (ZB) 型 ZnSe 核向 WZ 型核/壳的转变。这种现象在 CdSe/CdS 核/壳 QD 系统中已有报道 [29, 30]。核 QD 和几个核/壳 QD 的 TEM 图像如图 2a − 2 F所示。所有 TEM 图像都显示几乎单分散的球形 QD，平均直径从原始 ZnSe 核（3.90 nm）到 ZnSe/6CdS 型 - II QDs (7.98 nm) 和 ZnSe/6CdS/6ZnS type-II/type-I QDs (11.92 nm)。如 ZnSe 核 QD 的 HRTEM 图像（图 2a 的插图）所示，（111）面的晶格间距为 0.32 nm，QD 具有良好的结晶度和单分散性。根据 XRD 数据，随着壳的生长，晶格参数显示出相应的变化（CdS 为 0.35 nm，ZnS 为 0.31 nm）。结果清楚地表明CdS和随后的ZnS壳材料的可控生长。

左 ：具有不同壳层生长阶段的 ZnSe/CdS/ZnS II 型/I 型 QD 的 XRD 谱。闪锌矿 (ZB) ZnSe（底部）、WZ CdS（中 ), 和 WZ ZnS (top ) 被索引。 对了 :相应的 TEM 和 HRTEM (插图 , 条形 5 nm) ZnSe 核 (a ), ZnSe/CdS II 型 QDs 与 2 ML (b ), 4 ML (c ) 和 6 ML (d ) 分别为 CdS 壳和 ZnSe/CdS/ZnS II 型/I 型量子点，分别具有 3 ML (E) 和 6 ML (F)

同时，为了确认多壳生长过程中成分的演变，对核/壳生长的不同阶段进行了能量色散 X 射线光谱 (EDS) 分析，如附加文件 1：表 S1 所示。 EDS数据显示，Cd、Se、Zn、S含量的相应变化与壳生长阶段一致。但值得注意的是，由于 Zn ²⁺ 和 Cd ²⁺ 在 200°C 以上将 CdS 壳包覆到 ZnSe 核上的过程中。与已发表的关于典型 I 型 CdSe/CdS/ZnS 量子点（Cd 摩尔比 ~ 40%）的文献相比[31]，II 型/I 型 ZnSe/CdS/ZnS QDs 含有更少的 Cd 元素（~ 13%）。

附加文件 1：图 S1 (A) 中显示了氯仿中疏水性量子点和水中 PMAO 封端量子点在阳光和紫外线下的视觉比较。看来这两种 QD 解决方案都不受干扰，也没有纳米颗粒的聚集。当用手持式紫外线灯 (365 nm) 照射时，两个 QD 发出相同的红光。附加文件 1：图 S1 (B) 显示了相转移前后 QD 的紫外-可见吸收和 PL 光谱。与氯仿中的疏水性量子点相比，PMAO 封端的量子点的 PL 光谱变化可以忽略不计，表明粒径和 PL 性质没有明显变化。附加文件 1：图 S1 (C) 和 (D) 显示了相转移前后 QD 的 TEM 图像，这进一步确定了 PMAO 封端的 QD 的形态和状态。看来，PMAO 封端的量子点是很好的分离，很少观察到聚集体。

为了确认在相转移过程中 PMAO 封装 QD 的形成，FTIR 光谱用于表征 QD 表面的官能团（如附加文件 1：图 S2 所示）。 1777 cm ⁻¹ 处的峰值下降 （PMAO 与 QDs-PMAO 的比较）以及 1715 cm ⁻¹ 处的峰值增加 （比较三个样品）归因于酸酐的分解和-COOH的形成。 FTIR结果表明PMAO两亲聚合物成功包覆在ZnSe/CdS/ZnS量子点表面。

所制备量子点的稳定性对于后续处理非常重要。图 3a 显示了纯化步骤后疏水性 ZnSe/CdS/ZnS QD 的相对 PL 稳定性的演变。在己烷中经过多次纯化循环后，ZnSe/CdS/ZnS 核/壳量子点的 PL 强度可以保持 85%。如图 3b 所示，QDs-PMAO 在 BS 缓冲液（pH =7.2）中的胶体稳定性被估计为 25°C 下时间的函数。 PL 强度几乎保持恒定并且即使在 400 小时后溶液也清澈。这表明 QDs-PMAO 在 BS 溶液中是稳定的，没有任何损坏。图 3c 显示了 QDs-PMAO 的 PL 强度变化，将其浸入酸性到碱性 pH（pH =1-14，通过 HCl 或 NaOH 调节）溶液中 30 分钟。除了PH =14时，亲水QDs的PL强度可以保持85%以上。图3d显示了温度参数对QDs-PMAO相对荧光强度的影响。随着温度的升高，荧光强度逐渐降低，但在 90°C 时仍保持 76%，而由于热膨胀和电子 - 声子耦合效应，PL 峰逐渐向更长的波长移动。所有稳定性评估表明ZnSe/CdS/ZnS type-II/type-I QDs和QDs-PMAO非常稳定，适合生物应用。

疏水性量子点在 (a ) 重复纯化工艺步骤； QDs-PMAO 在 (b ) BS 缓冲区, (c ) PH, 和 (d ) 温度

CRP是来自肝细胞的急性期蛋白，其水平被认为是感染和自身免疫性疾病的早期指标。在这里，合成的 PMAO 封端的 ZnSe/CdS/ZnS 量子点与 CRP 结合，证明了在定量免疫测定中应用的可能性。水性 ZnSe/CdS/ZnS QD 和 QDs-mAb 的荧光光谱的比较图如图 4a 所示。显然，两种样品的 PL 峰形大致相同，只是由于离心分离过程中不可避免的样品损失，偶联反应后荧光强度下降到 60%。证明了ZnSe/CdS/ZnS type-II/type-I QDs在抗体蛋白偶联过程后仍具有优异的光学稳定性。

荧光光谱 (a ) 和动态光散射 (b ) 缓冲液中的 QDs-PMAO 和 QDs-mAb

为了进一步研究共轭对量子点大小的影响，水性量子点和量子点-mAb 通过动态光散射 (DLS) 进行表征。 DLS 结果（图 4b）清楚地表明，这两种样品都具有窄的尺寸分布，具有良好的单分散性，并保持离散形式而没有聚集，而偶联过程后流体动力学尺寸从 46 nm 增加到 120 nm。这证明了与CRP抗体结合的成功。

此外，我们使用ZnSe/CdS/ZnS II型/I型复合量子点代替CdSe/ZnS I型量子点作为荧光探针，建立了用于CRP定量检测的FLISA。组装过程见附加文件1：Scheme S1。图 5a 显示了在检测各种浓度的 CRP 抗原（标准 CRP 抗原稀释至 0、1、5、10、50、100、200、400 ng/mL）时，用于免疫测定的 QD 荧光标记的相对荧光强度。显然，PL强度随着CRP浓度的增加而逐渐增加。图 5b 显示荧光强度与目标 CRP 浓度之间的相关性服从 y 的二次回归曲线方程 =44230 + 8121.1x-10.3x ² 相关系数为0.9991，越接近1越好。工作浓度范围为 0 到 400 ng/mL。 LOD 是 FLISA 免疫测定的关键参数之一。采用ZnSe/CdS/ZnS复合II型/I型QDs作为荧光探针，CRP定量检测灵敏度为0.85 ng/mL，比基于CdSe/ZnS型的FLISA灵敏度提高15% -I QDs (1.00 ng/ml)（在附加文件 1 中：图 S3）。

FLISA光致发光光谱测定不同浓度CRP抗原(a ) 和标准曲线 (b )

此外，还使用回收率实验来评估 FLISA 与一系列已知标准 CRP 抗原的基质效应进行分析，最终浓度涵盖低、中和高风险水平。如表 1 所示，所有的回收率都在 83.61-105.9% 的范围内。这些结果表明，基于ZnSe/CdS/ZnS II型/I型QDs的具有重吸收抑制特性的FLISA具有较高的准确度，在定量免疫检测中具有很大优势。

结论

我们报告了一种无磷化氢的一锅法来合成重吸收抑制的 ZnSe/CdS/ZnS II 型/I 型核/壳 QD，具有大斯托克斯位移和平坦的第一吸收峰。这些特性减少了重吸收并提高了荧光输出水平。合成后的 QD 具有高 QY (82%) 和针对各种测试条件的高稳定性。然后，我们首先在 FLISA 中使用 ZnSe/CdS/ZnS QD 作为荧光探针，以高灵敏度（0.85 ng/mL 的 LOD）定量检测 CRP 蛋白。这表明抑制重吸收的ZnSe/CdS/ZnS II型/I型核/壳量子点在生物医学和光电领域具有广阔的应用前景。

缩写

BSA：

牛血清白蛋白

CRP：

C反应蛋白

DLS：

动态光散射

EDC：

1-乙基-3-(3-(二甲氨基)丙基)碳二亚胺

EDS：

能量色散X射线光谱

ELISA：

酶联免疫吸附试验

FLISA：

荧光免疫吸附试验

FWHM：

半高全宽

细节层次：

检测限

MES：

2-(N-吗啉)乙磺酸

OT：

1-辛硫醇

PMAO：

聚（马来酸酐-alt-1-十八碳烯）

量子点：

量子点

QY：

量子产率

磺基-NHS：

N-羟基磺基琥珀酰亚胺