利用茵陈蒿、马齿苋和夏枯草提取物绿色合成金纳米颗粒：抗氧化活性与细胞毒性评价

引言

对金属纳米颗粒（特别是金纳米颗粒AuNPs）日益增长的需求源于其作为药物载体、催化剂、成像剂和生物传感器的多功能性 [2]。传统合成路线——离子溅射、逆向胶束形成、化学还原——常涉及昂贵试剂和毒性担忧。绿色合成，利用植物提取物作为天然还原、封端和稳定剂，提供了一种成本效益高、可规模化、生物相容的替代方案 [2]。植物化学物质如酚类、萜类和黄酮类不仅还原金属离子，还赋予抗氧化特性并增强纳米颗粒稳定性。

Artemisia capillaris（菊科）长期用于传统医学，具有抗菌、抗炎和护肝作用，归因于其成分如茵陈蒿内酯和茵陈蒿素 [4‑6]。Portulaca oleracea（马齿苋科）具有抗菌、抗真菌和抗氧化活性，与生物碱、脂肪酸和黄酮类相关 [7‑8]。Prunella vulgaris（唇形科）表现出抗病毒、抗癌、免疫调节和抗氧化作用，主要归因于迷迭香酸和熊果酸等酚酸和三萜类 [9‑13]。

蛋白质冠——纳米颗粒进入生物流体后形成的血清蛋白吸附层——关键影响细胞摄取、生物分布和细胞毒性 [15‑17]。AuNPs的表面电荷、尺寸和形貌决定蛋白质冠组成，从而调节治疗功效。本研究考察了三种植物提取物抗氧化效力对AuNPs形成的影响，以及所得纳米颗粒在有无FBS条件下与癌细胞的相互作用。

方法

试剂

所有试剂均为分析纯。四氯金酸钾（KAuCl₄）和标准抗氧化剂（BHT、维生素C）购自Sigma‑Aldrich（美国圣路易斯）。细胞培养耗材来自Gibco（Thermo Fisher Scientific）和GE Healthcare HyClone™（澳大利亚维多利亚）。详细试剂规格见补充表。

仪器

UV‑Vis光谱用Shimadzu UV‑2600分光光度计（λ = 300–800 nm）。HR‑TEM成像用JEM‑2100F（JEOL，200 kV）。X射线衍射用Rigaku Miniflex（CuKα，1.54056 Å）。ICP‑OES分析用Perkin Elmer Optima 8300。动态光散射和zeta电位用NanoBrook 90 Plus分析仪测定。所有仪器按厂家指南校准。

水提取物制备

夏枯草和茵陈蒿干燥地上部从Omniherb（韩国大邱）购得；马齿苋从Handsherb（韩国永川）购得。各植物（100 g）在1 L去离子水中于25 °C超声3 h，重复三次。滤液冻干得粉末，‑20 °C保存待用。

抗氧化实验

按标准方案量化自由基清除（DPPH和ABTS）、还原力和总酚含量。所有实验三重复，结果以IC₅₀（µg mL⁻¹）或mg GAE g⁻¹表示。详细方法见补充材料。

AuNPs生物制备

配制KAuCl₄（10 mM）和植物提取物（2% w/v）储存液。离心（18,500 g，30 min，18 °C）后取上清液，混合至终浓度0.5 mM Au和0.05% w/v提取物，2 mL小瓶中。反应在37 °C进行5 h。记录UV‑Vis光谱监测SPR发展。

细胞培养

HT‑29（结肠）、PANC‑1（胰腺）、MDA‑MB‑231（乳腺）细胞用高糖DMEM补充10% FBS、100 U mL⁻¹青霉素和100 µg mL⁻¹链霉素，37 °C、5% CO₂培养。

细胞毒性实验

用EZ‑CYTOX WST法评估细胞活力。细胞（5 × 10³ cells mL⁻¹）接种96孔板，孵育24 h，然后用PV‑AuNPs（0–478.3 µg mL⁻¹ Au）±10% FBS处理24 h。记录450 nm吸光度，扣除PV‑AuNPs本身吸光度背景。

统计分析

数据以均值 ± SE表示。单因素方差分析后接Tukey事后检验（p < 0.05）评估显著性。用GraphPad Prism 5.02分析。

结果与讨论

提取物抗氧化特性

提取得率分别为茵陈蒿14.1%、马齿苋39.12%、夏枯草28.6%。抗氧化实验显示夏枯草DPPH（50.35 ± 1.22 µg mL⁻¹）和ABTS（38.6 ± 0.44 µg mL⁻¹）IC₅₀最低，优于BHT（71.37 ± 0.84 µg mL⁻¹）。还原力和总酚含量同趋势：夏枯草162.98 µg mL⁻¹，茵陈蒿235.38 µg mL⁻¹，马齿苋396.16 µg mL⁻¹。总酚分别为夏枯草90.53 ± 6.81 mg GAE g⁻¹，茵陈蒿39.88 ± 4.55 mg GAE g⁻¹，马齿苋18.32 ± 2.76 mg GAE g⁻¹。结果证实夏枯草拥有最强抗氧化成分。

三种提取物的DPPH、ABTS和还原力活性。 a DPPH清除；b ABTS清除；c 还原力。数据为均值 ± SEM；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001 vs 标准品。

AuNPs绿色合成

各提取物均促进AuNPs形成，由明显SPR峰和颜色变化证实：PO‑AuNPs（深蓝，500–700 nm宽带）、AC‑AuNPs（棕色，555 nm峰）、PV‑AuNPs（酒红，530 nm峰）。夏枯草优异的抗氧化活性转化为更高SPR强度、更窄带宽和更好的胶体稳定性。PO‑AuNPs在25 °C 30 min后聚集，稳定性最差。

PO‑AuNPs、AC‑AuNPs和PV‑AuNPs照片。

PO‑AuNPs（黑）、AC‑AuNPs（红）、PV‑AuNPs（蓝）UV‑Vis光谱。

形貌与尺寸分布（PV‑AuNPs）

HR‑TEM显示多样形貌：球形（23.8 ± 1.3 nm）、等边三角形（25.7 ± 2.2 nm）、棒状（28.4 ± 0.4 nm，长宽比 = 2.4）、菱形（长对角线 = 22.0 ± 0.6 nm，短对角线 = 15.4 ± 0.3 nm）。所有颗粒均为结晶，晶格条纹确认。尺寸直方图显示各形状呈高斯分布。

PV‑AuNPs HR‑TEM图像（比例尺：a 50 nm，b 50 nm，c 50 nm，d 50 nm，e 10 nm，f 2 nm，g 2 nm，h 2 nm）。

PV‑AuNPs尺寸分布：（a）球形，（b）三角形，（c）棒状，（d）菱形（长对角线），（e）菱形（短对角线）。

流体动力学尺寸与表面电荷

DLS测得流体动力学直径45 ± 2 nm（多分散指数 = 0.258），zeta电位‑13.99 mV，表明表面结合植物化学物质提供有效空间位阻和静电稳定化。

PV‑AuNPs流体动力学尺寸（a）和zeta电位（b）。

结晶度（HR‑XRD）

HR‑XRD图谱在2θ = 38.1°、44.5°、64.8°、77.4°显示特征峰，对应面心立方晶格的（111）、（200）、（220）、（311）晶面。Scherrer公式对（111）峰分析得晶粒尺寸约16.7 nm。

PV‑AuNPs HR‑XRD分析。

反应产率

ICP‑OES测得胶体溶液中Au 96.337 ppm，上清液0.679 ppm，转化率99.3%。

PV‑AuNPs抗氧化活性

PV‑AuNPs表现出剂量依赖性DPPH清除，IC₅₀为165.0 µg mL⁻¹ Au（≈49.4 µM维生素C）。该活性与植物介导AuNPs报道一致，归因于表面结合酚类。

PV‑AuNPs清除DPPH自由基（Au浓度以µg mL⁻¹表示）。

癌细胞系细胞毒性

无血清条件下，HT‑29细胞对PV‑AuNPs最敏感（478.3 µg mL⁻¹时抑制率65.6%）。PANC‑1和MDA‑MB‑231反应较低。加10% FBS后，PANC‑1细胞毒性增强（478.3 µg mL⁻¹时37.5%），而HT‑29毒性降低，凸显蛋白质冠依赖的组织特异性效应。负zeta电位可能促进选择性蛋白吸附（如纤维蛋白原），影响细胞摄取和毒性。

PV‑AuNP处理±10% FBS后HT‑29（a）、MDA‑MB‑231（b）、PANC‑1（c）细胞活力。

结论

三种植物水提取物均显示可测量的抗氧化活性。夏枯草作为最强还原剂，生成高结晶、酒红色AuNPs（PV‑AuNPs），转化率99.3%，流体动力学直径45 ± 2 nm。PV‑AuNPs表现出剂量依赖性抗氧化能力和对结直肠、胰腺、乳腺癌细胞的选择性细胞毒性，蛋白质冠调节功效。这些发现凸显高抗氧化植物提取物在绿色纳米颗粒合成中的价值，并提示PV‑AuNPs作为靶向药物递送的有希望候选者，特别是结合夏枯草的心脏保护植物化学物质。未来工作将致力于向PV‑AuNPs负载化疗药物，利用其抗癌和保护双重效应。

缩略语

ABTS:

2,2′‑联氮双(3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸)

AC‑AuNPs:

茵陈蒿提取物合成的金纳米颗粒

AgNPs:

银纳米颗粒

AuNPs:

金纳米颗粒

BHT:

丁基羟基甲苯

DMEM:

Dulbecco改良Eagle培养基

DPPH:

2,2‑二苯基‑1‑苦基肼

FBS:

胎牛血清

GAE:

没食子酸当量

HR‑TEM:

高分辨透射电子显微镜

HR‑XRD:

高分辨X射线衍射

HT‑29:

人结直肠腺癌细胞系

IC₅₀:

半最大抑制浓度

ICP‑OES:

电感耦合等离子体发射光谱

MDA‑MB‑231:

人乳腺腺癌细胞系

PANC‑1:

人胰腺导管腺癌细胞系

PO‑AuNPs:

马齿苋提取物合成的金纳米颗粒

PV‑AuNPs:

夏枯草提取物合成的金纳米颗粒

SPR:

表面等离子体共振

WST assay:

水溶性四唑实验