壳聚糖、N-酰基壳聚糖和壳聚糖低聚糖功能化金纳米颗粒增强基因递送

摘要

金纳米颗粒（AuNPs）因独特光学性质、高密度、易表面修饰在生物医学研究中日益应用。本文呈现非病毒基因递送平台，结合AuNPs与三种壳聚糖衍生聚合物：天然壳聚糖（CO）、N-酰基壳聚糖（Acyl-CO）、壳聚糖低聚糖（COS）。探索两条合成路线：常规硼氢化钠化学还原和绿色一锅法合成（COS同时还原和稳定AuNPs）。纳米复合材料经UV-Vis、ζ电位、FTIR、透射电子显微镜（TEM）全面表征。琼脂糖凝胶电泳确认质粒DNA（pDNA）稳健复合，HEK-293细胞转染效率经β-半乳糖苷酶活性和EGFP荧光评估。CO-AuNPs、Acyl-CO-AuNPs、COS-AuNPs转染率分别为27%、33%、60%，证明绿色COS基配方在避免有毒还原剂同时实现卓越基因递送性能。

背景

基因治疗依赖将治疗遗传物质递送至靶细胞。病毒载虽转染效率高，但免疫原性、载荷有限、生产复杂。非病毒载体更安全、易生产、贮存稳定。壳聚糖源自几丁质的天然多糖，因正电荷、低毒性、保护DNA免酶降解成为有前途非病毒载体。但天然壳聚糖生理pH难溶、稀酸溶液高粘度限制生物医学应用。N-酰化等化学修饰增加疏水性、调节脱乙酰度，低聚化（COS）降低粘度、缩短链长增强细胞摄取。

金纳米颗粒凭借可调尺寸、表面等离子共振、对胺/巯基/氰基强亲和力，是构建多功能纳米载体理想候选。阳离子聚合物如壳聚糖可接枝AuNPs创建正电荷表面静电结合质粒DNA，促进细胞内化。AuNPs高密度促进快速细胞摄取，光学性质支持递送实时监测。

前人证实壳聚糖-AuNPs偶联物转染效率超脂质体或聚合物纳米颗粒。但多数合成依赖硼氢化钠或十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等有毒还原剂。本工作引入绿色合成路线，用COS同时作为还原和稳定剂，消除有害化学品同时保持纳米复合物有利理化性质。

实验方法

纳米复合材料合成

制备三种不同AuNPs配方（图2）。CO-AuNPs和Acyl-CO-AuNPs经NaBH₄化学还原合成，COS-AuNPs经绿色一锅法制备（COS同时还原Au³⁺和封端纳米颗粒）。

材料

四氯合金酸三水合物（HAuCl₄·3H₂O）、硼氢化钠（NaBH₄）、低分子量壳聚糖（50-190 kDa，75%脱乙酰）、COS（5 kDa）购自Sigma-Aldrich。所有玻璃器皿王水浸泡24小时、超纯水冲洗除金属痕量。

CO-AuNPs

CO（2 mg mL⁻¹）溶于1%乙酸过夜。溶液过滤（0.22 µm）与10 mM HAuCl₄（1 mL）剧烈搅拌30分钟。滴加NaBH₄（100 mM，0.4 mL）；颜色黄变酒红指示纳米颗粒形成。继续搅拌2小时。

Acyl-CO-AuNPs

低分子量壳聚糖经己酰氯改性酰化，改良方案进行。所得凝胶丙酮沉淀、甲醇洗涤、干燥。凝胶（0.33%于0.1 M HCl）与10 mM HAuCl₄（1 mL）搅拌1小时。加入NaBH₄（100 mM，0.4 mL）得粉红红溶液，搅拌2小时完全着色。

COS-AuNPs

绿色合成中，COS（100-200 mg）加入HAuCl₄（0.003-0.017 wt%）于80°C搅拌60分钟。制备四种变体，COS量和金浓度不同（表1）。纳米颗粒离心（12000 g，30分钟）纯化。

表征

FTIR

FTIR谱（Perkin Elmer Spectrum One）确认酰胺带和Acyl-CO成功酰化。取1651 cm⁻¹和3350 cm⁻¹吸光度比计算取代度（DS）为75%。

ζ电位

ζ电位测量（Malvern Nano Z）显示所有复合物正表面电荷（43-55 mV），确认DNA结合适宜。复合后值下降，指示质粒成功吸附。

UV-Vis

UV-Vis谱（400-700 nm）显示局域表面等离子共振（LSPR）峰：CO-AuNPs 534 nm、Acyl-CO-AuNPs 507 nm、COS-AuNPs 533-536 nm。150天无光谱漂移，证实胶体稳定性。

TEM

TEM图像（JEOL JEM-1010）显示3-15 nm球形纳米颗粒。COS-AuNPs尺寸分布更窄，反映优异单分散性。

复合物形成与DNA结合

质粒pSV-β-Gal（6.82 kb）和pIRES2-EGFP（5.3 kb）碱性裂解纯化。DNA（200-400 ng）与各纳米复合物在DMEM中混合，琼脂糖凝胶电泳（0.8%琼脂糖，90 V，60分钟）显示所有纳米复合物完全滞留DNA于样品孔，游离质粒迁移至底部，确认静电复合。

细胞转染

细胞培养

HEK-293细胞96孔板播种12000细胞/孔，24小时达~90%汇合。

EGFP转染

复合物（15 µL，200 ng DNA）加入细胞2小时，随后完全培养基中48小时培养。荧光显微镜（Carl Zeiss Axio Vert.A1）定量GFP表达。

β-半乳糖苷酶转染

24小时孵育后，细胞固定并经X-gal溶液孵育。蓝色染色指示β-半乳糖苷酶活性，倒置显微镜（Motic AE2000）明视野观察。LipofectAMINE™ 2000作阳性对照。

细胞活力

Trypan blue排除法（0.2%）评估转染2小时后活力。浓度范围：CO-AuNPs和Acyl-CO-AuNPs 0.1-3 mM，COS@3-AuNPs和COS@4-AuNPs 0.5 mM，COS@1-AuNPs和COS@2-AuNPs 0.1 mM。

结果与讨论

纳米复合材料合成与表征

绿色COS-AuNPs无有害试剂制备，展示全生物相容合成路线可行性。UV-Vis谱（图3）确认AuNPs形成，LSPR峰跨配方一致。150天稳定性测试无光谱位移，指示优异胶体稳健性。

稳定性

UV-Vis谱150天后：CO-AuNPs（a）、Acyl-CO-AuNPs（b）、COS-AuNPs（c）均无变化。

FTIR

壳聚糖、Acyl-壳聚糖、COS FT-IR谱。关键带：1651 cm⁻¹（酰胺I）、1591 cm⁻¹（酰胺II）。

ζ电位

表2列ζ电位值：CO-AuNPs 43.3 mV、Acyl-CO-AuNPs 40.2 mV、COS-AuNPs 46.3-55.3 mV。DNA结合后均保持正值，确认复合化。

TEM

TEM显微照片：(a) Acyl-CO-AuNPs 4.7 nm，(b) CO-AuNPs 3.5 nm，(c-f) COS-AuNPs 7.4-15.6 nm。

DNA复合化

琼脂糖凝胶（图7）显示所有纳米复合物完全滞留DNA，游离质粒迁移底部。COS-AuNPs结合最强，饱和前保留高达350 ng质粒。

转染效率

HEK-293细胞中，COS-AuNPs达最高转染率：β-半乳糖苷酶60%、EGFP 48%。Acyl-CO-AuNPs和CO-AuNPs分别达33%、27%。COS-AuNPs优势归因于更高壳聚糖/金比例和最佳粒径。

细胞活力

Trypan blue排除显示COS-AuNPs高活力（>90%），LipofectAMINE™ 2000和CO-AuNPs较低（61%、78%）。COS-AuNPs因此结合高转染效率与最小细胞毒性。

结论

我们成功通过常规和绿色路线制备金纳米颗粒-壳聚糖偶联物。无毒试剂合成的COS-AuNPs展现卓越转染效率（高达60%）和优异细胞相容性（>93%）。窄尺寸分布和正表面电荷实现稳健质粒结合和高效细胞摄取。这些发现确立COS-AuNPs作为有前途、环境友好基因递送平台，适合进一步临床前开发。

数据与材料可用性

支持本研究结论的所有数据集均包含在正文内。

缩写

Acyl-CO

酰基壳聚糖

AuNPs

金纳米颗粒

CO

壳聚糖

COS

壳聚糖低聚糖

DMEM

杜尔贝科改良鹰培养基

FTIR

傅里叶变换红外

PBS

磷酸盐缓冲盐水

pDNA

质粒脱氧核糖核酸

TEM

透射电子显微镜