环境兼容的生物共轭金纳米粒子作为炎症诱导的癌症成像的有效造影剂

介绍

在医学和生物研究中，人们对用于光学显微镜研究和诊断程序，尤其是共聚焦激光显微镜的金纳米粒子 (AuNP) 的兴趣正在增加。抗体/AuNP 偶联物的使用允许在单个粒子水平上实时检测活细胞（例如癌细胞）中的金摄取，从而能够估计 NPs 的细胞内量 [1,2,3]。

AuNP 的理化特性使其可用于许多医学研究，例如基因组学、生物敏感性、免疫测定、临床化学、微生物和癌细胞的检测和光热解 [1]。 Faulk 和 Taylor [4] 描述了第一种抗体与胶体金结合的方法，用于直接电子显微镜观察沙门氏菌的表面抗原。从那时起，许多研究针对与生物大分子（如抗体、凝集素和酶）结合的纳米粒子在不同领域（例如生物化学、微生物学、免疫学和形态学）中的应用[1, 4]。在癌症研究中，基于 AuNP 的高度特异性和灵敏的造影剂被用于 X 射线和光学成像模式，因为 AuNP 能够增强共轭分子的荧光强度 [5, 6]。

2014 年，我们证明了 AuNP 可以应用于细胞培养中的间接免疫荧光 (IF) 染色方法 [6]。在本研究中，我们描述了使用 AuNP 进行免疫荧光 (IF) 染色的三种新方法。在这里，我们使用组织切片并将每种方法的荧光强度与使用 Alexa Fluor® 488 (ALEXA) 抗体 (A1) 的标准染色方案进行比较，目的是优化用于临床应用的荧光技术 [7,8,9 ].

用于癌细胞靶向的荧光成像 (FI) 利用各种光学成像技术，以改进基于癌症特异性分子特征的早期肿瘤的检测 [10]。自 2013 年以来，使用 FI 的临床试验数量迅速增加。通常考虑对高危患者进行筛查，这是基于生活方式因素、遗传学或个人疾病史的组合，而监测则保留用于诊断为不典型增生/慢性炎症或疑似恶性肿瘤的患者。与目前可用的技术相比，FI 可能有助于识别恶性病变，具有更高的特异性和敏感性。此外，基于 FI 的筛查可以提供一种侵入性更小、更具成本效益的方法来检测癌变或癌前病变。具体而言，FI 比传统筛查方法更早发现病变的能力不仅会改善治疗结果，还会降低治疗成本，因为它将避免对多模式护理的需求，而这对于后期诊断的患者来说是必需的 [11] .在本研究中，我们证明了抗体/AuNPs偶联物可以通过荧光显微镜成功应用于慢性炎症的成像。

方法/实验

研究目的

本研究的目的是展示金纳米粒子的荧光特性如何用于 IF 和流式细胞术技术。此外，我们将使用 AuNPs 测试的方案与使用 ALEXA 的标准方案进行了比较，并证明可以在方案中使用 AuNPs，该方案速度更快，但与标准方案一样可靠。

化学品和试剂

三氯化金（30 wt% 在 HCl 中）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW =10.000）、氢氧化钠、透析管纤维素膜和甘油是 Sigma-Aldrich Chemical Co（美国圣路易斯）的产品。硫酸和过氧化氢购自 Vetec（巴西里约热内卢）。磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液和牛血清白蛋白（BSA，5%）购自 Life Technologies Corporation©（美国加利福尼亚州）。抗 COX-2（环氧合酶-2） 和抗 MIF（巨噬细胞迁移抑制因子）一抗购自 Santa Cruz Biotechnology（巴西圣保罗），而 Goat Anti-Rat IgG H&L Alexa Fluor® 488 二抗购自 ABCAM®（英国剑桥）。使用来自 ABCAM® (Cambridge, UK) 的带有 DAPI 的 Fluoroshield 封固培养基 (20 ml) 对 DNA 进行复染。

金纳米粒子的制备和表征以及荧光光谱

根据 Gasparotto 等人的一项研究，生产和表征了球形 AuNP（7.1 纳米）。 [12]。简而言之，将所有玻璃器皿保存在 KMnO4 + NaOH 溶液中过夜，用去离子水冲洗，保存在 H2O2 + H2SO4 溶液中（1:1 v /v ) 10 分钟，再次用去离子水冲洗，使用前干燥。 PVP（0.20 g）和氯化金（6.80 mg）溶解在10 ml水中。在单独的烧杯中，将甘油 (0.18 g) 和 NaOH (0.080 g) 溶解在 10 ml 的水中。然后将甘油-NaOH溶液加入AuCl3-PVP溶液中以产生以下最终浓度：1.0 mmol/L ^-1 Au ³⁺ 、0.10 M NaOH、0.10 M甘油和10 g/L ^-1 对战。由于 AuNPs 的形成，最终混合物呈深红色。 AuNPs 的胶体紫外-可见吸收光谱是用 Evolution 60S 紫外-可见分光光度计（Thermo Scientific，MA，USA）获得的。荧光光谱采用RF-5301 PC荧光分光光度计（Shimadzu，Kyoto，Japan）进行。

实验设计

所有三种方案都在两种慢性炎症模型的对照组中进行了测试，即醋酸诱导的溃疡性结肠炎 (UC) [7] 和酒精诱导的脂肪性肝炎 [8, 9] 大鼠。

对从生物技术中心/Universidade Federal da Paraiba 获得的雌性 Wistar 大鼠（体重 220 ± 20 g）进行乙酸诱导的 UC。将动物分为两组（n =5/组）：乙酸对照和非结肠炎大鼠。动物禁食过夜并用氯胺酮（70 mg/kg，10%）和甲苯噻嗪（10 mg/kg，2%）麻醉。根据最初由 MacPherson 和 Pfeiffer [13] 描述并由 Millar 等人修改的方法诱导 UC。 [14]。一根导管被小心地插入结肠。然后，将溶于 0.9% 盐水的 10% 乙酸（0.5 ml）滴入结肠腔中。非结肠炎组结肠内接受 0.5 ml 0.9% 生理盐水。保持大鼠仰卧特伦德伦伯卧位30 s，防止结肠内滴注液漏出。

将动物禁食过夜并在诱导后 48 小时用过量的硫喷妥钠安乐死。接下来，在无菌条件下取出结肠，用 PBS 冲洗，并放置在冰冷的板上。结肠已清除脂肪和肠系膜。然后，对每个样品称重并在恒定负载（2 g）下测量其长度。然后，根据 Bell 等人描述的标准，纵向打开结肠并在 0 到 10 的范围内对肉眼可见的损伤进行评分。 [15].

酒精性脂肪性肝炎在从北里奥格兰德联邦大学 (UFRN) 生物物理和药理学系获得的雄性 Wistar 大鼠（体重 290 ± 10 g）中诱发。将动物分为两组（n =5/组）：酒精和非酒精大鼠。乙醇溶液（7 g/kg 体重 30% v /v ) 被用作酒精组的慢性剂量。非酒精组的动物通过管饲法口服等量的盐水溶液（0.9% NaCl）。两组均每天灌胃1次，连续28 天。

第29天，通过腹腔注射7.5 ml/kg氯胺酮（50 mg/ml）和2.5 ml/kg甲苯噻嗪（20 mg/ml）进行安乐死。安乐死前，所有动物组均禁食12 h。一旦失去知觉，动物就进行心脏穿刺，然后取出肝脏。将肝脏碎片浸入10%甲醛缓冲液中进行组织病理学分析。

来自醋酸诱导的 UC 和酒精诱导的脂肪性肝炎的动物被圈养在标准条件下（12 小时光/暗循环，22 ± 0.1 °C，和 50-55% 湿度），随意 获得食物和水。按照动物实验伦理原则处理动物。

组织学

来自每个炎症模型的阳性对照（乙酸对照和酒精对照）的五个石蜡块用于间接 IF 染色。发现抗 COX-2 和抗 MIF 的一抗分别是醋酸诱导的 UC 和酒精诱导的脂肪性肝炎中良好的炎症标志物，通过提供可靠的荧光强度染色，可用于比较不同的协议。

组织在 10% 缓冲甲醛中固定，用乙醇（70%、80%、90%、95% 和 P.A.）脱水，在二甲苯中澄清并按照标准方案浸渍在石蜡中 [8]。在制备用于间接 IF 染色的切片之前，将载玻片在 60 °C 的烘箱中放置 24 h。

免疫荧光和协议设计

每只动物的三个组织切片 (4 μm) 在二甲苯中脱蜡，并在一系列浓度降低的乙醇中洗涤，从 99% 乙醇到 50% 乙醇。最后，组织切片在 dH2O 中洗涤两次，用 PBS 洗涤一次。通过将切片置于含有 0.05% Tween 20 的 10 mM 柠檬酸钠中，在 95 °C 下放置 30 分钟，然后在室温 (RT) 下放置 20 分钟，进行抗原修复。通过在室温下将切片在 70% 酒精中的 0.1% 苏丹黑中孵育 20 分钟，然后在 0.02% PBS-Tween 20 中洗涤 3 次来降低背景噪音/信号。样品在 0.2% Triton-X-100 中透化PBS（洗涤三次，每次 5 分钟），在 PBS 中洗涤，然后用 PBS、5% BSA、dH2O 和 Triton-X-100 封闭。将载玻片与封闭溶液在湿度室中孵育 2 小时。如表 1 和图 1 所示，抗 COX-2 和抗 MIF 一抗的孵育按照三种不同的方案（NP1、NP2 和 NP3）进行。将这些方案与两种基于 ALEXA 的方案进行了比较，这些方案在一抗的孵育时间上有所不同——我们研究小组采用的 ALEXA 标准方案（过夜孵育）作为大多数程序的标准方案 (A1) 和 ALEXA 修改方案 (A2) ；30 分钟孵育）。 NP1 是一种纳米颗粒依赖性免疫荧光染色方法，初次孵育 30 分钟。一抗在 1% BSA 中以 1:500（抗 COX-2）和 1:400（抗 MIF）的比例稀释，每个样品在室温（20 °C）的湿度室中孵育 30 分钟.接下来，将 100–150 μl 的 AuNP 添加到样品中，将其在室温 (20 °C) 下再孵育 30 分钟。在第二个纳米颗粒依赖方案 (NP2) 中，一抗在 1% BSA 中稀释并直接应用于载玻片，载玻片在冰箱中放置过夜。因此，A2 和 NP1 都是 30 分钟的孵育协议，但 A2 是使用二级荧光抗体 (ALEXA) 进行的，而 NP1 使用 AuNP 作为荧光团。这也适用于隔夜孵化协议 A1 和 NP2。在各自的孵育时间后，将每个方案的载玻片用 PBS 洗涤 3 次以去除多余的一抗。然后，将 100–150 μl 纳米颗粒添加到 NP2 中的每个载玻片中，而 ALEXA (1:400) 则添加到 A1 中。与AuNPs (NP2)和ALEXA (A1)孵育1 h后，所有载玻片用PBS洗涤3次。

醋酸诱导的 UC 和酒精诱导的脂肪性肝炎对照组的苏木精和伊红染色图像。 一 UC 模型的阴性对照（× 100；比例尺 =100 μm）。 b 乙酸诱导的UC。红色箭头表示粘膜区域的白细胞浸润（× 100；比例尺 =100 μm）。 c 脂肪性肝炎的阴性对照（× 200；比例尺 =50 μm）。 d 酒精性脂肪性肝炎。黑色箭头表示白细胞浸润（× 200；比例尺 =50 μm）

第三个协议 (NP3) 旨在探索 AuNPs 在荧光系统中的放大特性。在 NP3 中，ALEXA 在 1% BSA 中稀释期间应用 AuNP。测试了 BSA 中含有 AuNP 的二抗的三种稀释度（1:200、1:400 和 1:800），以便将每个稀释度的荧光强度与 A1 进行比较。稀释液的制备方式使 AuNPs 的体积与 BSA 的体积成正比，例如，对于 1:200 的稀释，2 μl 的 ALEXA 在 199 μl 的 AuNPs + 199 μl 的 BSA 中稀释。 A1和NP3中一抗的孵育时间约为18 h（过夜），而ALEXA+AuNPs悬液的孵育时间为1 h。

最后，使用带有 DAPI 的 Fluoroshield 封固剂封固样品。将载玻片储存在避光箱中并保持在 4 °C 直至进行显微镜分析。使用 Zeiss Observer z.1 正置显微镜获得荧光图像，用于荧光和明场成像（× 20 和 × 10 物镜，Carl Zeiss，Jena，德国）和 AxioCam MRc。利用蔡司ZEN lite blue edition软件（Carl Zeiss）的算术平均参数，对ALEXA通道的每张图片逐个像素地定量评估荧光强度。分析了每只动物的至少三个样本（每组五只动物），并从每个片段中拍摄了 5 张照片，目标为 × 10。

体外诱导 M2 极化 TAM

用于评估 M2 巨噬细胞、RAW 264.7 细胞（5 × 10 ⁵ 细胞/孔在 12 孔板中）在含有 10% 胎牛血清并补充有 20 ng/ml IL-4 的完全培养基中培养 24 小时。 IL-4处理后，细胞用无血清DMEM洗涤3次，同种培养基培养48 h。使用 Telaval 31 光学显微镜（ZEISS，Oberkochen，Germany）分析细胞。

流式细胞术

与 IL-4 孵育 48 h 后，RAW 264.7 细胞和 M2 巨噬细胞 (1.5 × 10 ⁴ 用刮刀收集 12 孔板中的细胞/孔）并用 0.5 g BSA 在 100 ml PBS (PBA) 中封闭 45 分钟，然后与 PerCP 偶联的抗小鼠 CD163 (1:1000) 和 FITC 孵育-缀合的抗小鼠 CD86 (1:1000) 在 4 °C 下持续 60 分钟。此外，M2 巨噬细胞用 COX-2 和 MIF 一抗标记，因此与 AuNP 结合。收集 M2 极化的 TAM 并用 PBS 中的 2% 多聚甲醛固定 10 分钟，然后与抗 COX-2 和抗 MIF 初级（1:100）在 4°C 下孵育 60 分钟，然后；然后，按照 Alexa 标准方案 [16] 中的描述，在室温下在孵育溶液 (1:100) 中用山羊抗兔 Alexa® Fluor 488 偶联二抗 (Thermo Fisher Scientific) 标记细胞 60 分钟。按照 AuNPs 替代山羊抗兔 Alexa® Fluor 488 偶联二抗的方案 (N1)，收获 M2 巨噬细胞，用 PBS 洗涤，并与抗 COX-2 和抗 MIF 初级抗体 (1:100 ) 在室温下孵育 30 分钟。然后，将细胞与 AuNPs (1:5) 在 4°C 下孵育 30 分钟（AuNPs 在 520 nm 激发）。在最后的洗涤步骤之后，在 BD FACSCanto II（BD Biosciences，荷兰）和 FlowJo 软件（10.1 版；Tree Star Inc.，UK）中分析标记的细胞。所有流式细胞术分析均使用一式三份并重复三次的样品进行。标准ALEXA和AuNPs协议的比较见表2。

统计分析

方差分析 (ANOVA) 和 Bonferroni 的事后 进行免疫荧光分析试验。对于流式细胞术分析，如所示，使用方差分析和邓恩检验计算组之间的显着差异。一个 p <0.05 被认为对所有进行的分析具有统计学意义。

结果

显微镜分析

图 1a 中的切片显示了用苏木精和伊红染色的组织切片（阴性对照）。乙酸诱导的慢性炎症过程如图 1b 所示，显示组织结构的丧失，随后上皮遭到破坏，杯状细胞减少，受伤部位附近出现出血和白细胞。图中可见慢性酒精暴露大鼠的肝脏中有脂肪滴堆积和炎症浸润（中性粒细胞和淋巴细胞）。

在荧光强度方面，AuNPs 看起来类似于 ALEXA，后者是用于 IF 染色的传统荧光团。在肝脏和结肠样本中，与 A1 相比，NP1 和 NP2 的荧光强度差异很小或不存在。在图 2 中，显示了使用抗 COX-2 和抗 MIF 一抗测试的 IF 方案之间的多重比较。图 2a 和 d 表明，与 A1 方案相比，A2、NP1 和 NP2 的荧光强度没有显着差异（ ^# p> 0.05)，表明 30 分钟的孵育方案（使用 ALEXA 或 AuNPs）可能适用于诊断环境。

组间荧光强度的比较。 一 与仅 A1 乙酸诱导的 UC（抗 COX-2 抗体）相比，A2、NP1 和 NP2 中 AuNP 的荧光强度。 b 与 A1 (1:400) 的荧光强度相比，NP3（1:200、1:400 和 1:800）的所有稀释度 - 仅醋酸诱导的 UC（抗 COX-2 抗体）。 c 醋酸诱导动物和阴性对照在短时间（A2 和 NP1）和过夜孵育（A1 和 NP2）后荧光强度的比较。 d 与仅 A1 酒精诱导的脂肪性肝炎（抗 MIF 抗体）相比，A2、NP1 和 NP2 中 AuNP 的荧光强度。 e NP3 的所有稀释度（1:200、1:400 和 1:800）与 A1（1:400）-仅酒精诱导的脂肪性肝炎（抗 MIF 抗体）的荧光强度相比。 f 酒精性脂肪性肝炎动物和阴性对照在 30 分钟孵育（A2 和 NP1）和过夜孵育（A1 和 NP2）后荧光强度的比较。统计数据：方差分析和 Bonferroni 的事后检验， ^# p ≥ 0.05, **p <0.01,***p <0.001 和 ****p <0.0001

此外，NP3 协议（图 2b、e）证明可以将 AuNP 与 ALEXA 结合，从而增加检测到的荧光强度（***p <0.001)，允许 ALEXA 稀释倍数，而荧光相对于最初在 A1 上测试的 1:400 稀释度没有降低 ( ^# p> 0.05).

最后，我们将患病组与健康组进行了比较（图 2f），以证明所有测试的方案，无论是使用 ALEXA 还是使用 AuNP，都能有效检测以抗原 COX-2 和 MIF 为特征的炎症过程的发生。图 3 和图 4 支持图 2 中图形显示的数据。ALEXA 和 AuNP 均以绿色染色表示，其分布对应于白细胞浸润和组织损伤增加的部位。

来自盐水（阴性对照）和醋酸诱导的 UC 组的结肠样品的抗 COX-2 IF 图像用绿色荧光化合物（ALEXA、AuNPs 或两者）和 DAPI（蓝色）染色的细胞核。 一 用 ALEXA 标准方案 (A1) 与抗 COX-2 和 ALEXA（绿色）染色的阴性对照。 b 阴性对照用带有抗 COX-2 和 ALEXA 的改良 ALEXA 方案 (A2) 染色。 c 阴性对照用纳米粒子方案 1 (NP1) 染色，使用抗 COX-2 和 AuNPs（绿色）代替 ALEXA。 d 用纳米粒子协议 2 (NP2) 染色的阴性对照，用抗 COX-2 和 AuNPs 代替 ALEXA。 e 阳性对照用 A1 染色。 f 阳性对照用 A2 染色。 g 阳性对照用 NP1 染色。 h 阳性对照用 NP2 染色。 我 阳性对照用纳米颗粒方案 (NP3) 染色，抗 COX-2 + AuNPs 和 1:200 ALEXA。 j 阳性对照用 NP3 染色（用 1:400 稀释的 ALEXA）。 k UC 阳性对照用 NP3 染色（用 1:800 稀释的 ALEXA）。放大倍数，× 200。比例尺 =50 μm

来自盐水（阴性对照）和酒精诱导的脂肪性肝炎组的肝脏样本的抗 MIF 图像，用绿色荧光化合物（ALEXA、AuNPs 或两者）和 DAPI（蓝色）染色的细胞核。 一 阴性对照用 ALEXA 标准方案 (A1) 染色，含有抗 MIF 和 ALEXA（绿色）。 b 用 ALEXA 修改方案 (A2) 与抗 MIF 和 ALEXA 染色的阴性对照。 c 用纳米粒子协议 1 (NP1) 染色的阴性对照，用抗 MIF 和 AuNPs（绿色）代替 ALEXA。 d 用纳米粒子协议 2 (NP2) 染色的阴性对照，用抗 MIF 和 AuNPs 代替 ALEXA。 e 阳性对照用 A1 染色。 f 阳性对照用 A2 染色。 g 阳性对照用 NP1 染色。 h 阳性对照用 NP2 染色。 我 阳性对照用纳米颗粒方案 3 (NP3) 染色，抗 MIF + AuNPs 和 1:200 ALEXA。 j 阳性对照用 ALEXA 1:400 稀释的 NP3 染色。 k 阳性对照用 ALEXA 1:800 稀释的 NP3 染色。放大倍数，× 200。比例尺 =50 μm

在临床应用方面，NP1方案被证明是最有前途的，因为与标准A1方案相比，它可以节省18 h。

流式细胞术：一抗偶联金纳米颗粒 (AuNP) 标记的 M2 巨噬细胞

为了进一步表征 M2 巨噬细胞，在流式细胞术中分析了 IL-4 刺激的 RAW 264.7 细胞中 M1 (CD86) 和 M2 (CD163) 相关标记的表达。流式细胞术结果显示CD163受体等M2相关标志物显着高于天然细胞（图5a，c，p <0.001) 而 CD86 受体表达在 M2 巨噬细胞和幼稚细胞之间没有显示任何差异（图 5b、c、p> 0.05)。结果表明，IL-4 (20 ng/ml) 成功地诱导了经典巨噬细胞向 M2 巨噬细胞的转变。在此步骤之后，将 M2 巨噬细胞与 COX-2 和 MIF 一抗一起孵育，然后用 AuNP 进行标记，以比较一抗偶联的金纳米粒子 (AuNP) 与标准方案 (ALEXA) 的效率。结果表明，无论是 COX-2 还是 MIF 抗体偶联的金纳米粒子（图 5d、f、p <0.001) 或 ALEXA（图 5e、f、p <0.001) 与未染色样品相比，M2 巨噬细胞的荧光强度更高。

COX-2 和 MIF 抗体偶联的金纳米粒子 (AuNPs) 在 M2 巨噬细胞表面具有高亲和力。 一 –c RAW 264.7 细胞用 IL-4 (20 ng/ml) 刺激 24 h，然后进行流式细胞术分析以量化 CD163（一种 M2 巨噬细胞标记物）和 CD86（一种 M1 标记物）的数量。 d , f COX-2 和 MIF 抗体偶联的金纳米颗粒或 e , f 与未染色的样品相比，ALEXA 488 在 M2 巨噬细胞中显示出更高的荧光强度。数据表示为平均值 ± SD， ^# p> 0.05, ***p <0.001, p <0.0001。显示的代表性流量数据来自至少 3 次独立进行的实验

荧光光谱

为了在不存在和存在抗 COX-2（图 6a）、抗 MIF（图 6b）和 ALEXA（图 6c）的情况下测量纯化 AuNP 的荧光发射光谱，固定激发波长在 320 nm 处，发射记录在 650 到 900 nm 的范围内。激发波长的增加不会改变粒子的发射范围，因此排除了散射过程的可能性。随着抗 COX-2 吸收（最高抗体浓度增加 11.93 吸光度单位 (au)）、抗 MIF（最高抗体浓度增加 12.15 au）和 ALEXA（增加 3.18 au，最高抗体浓度），荧光发射略有增加最高抗体浓度）结合AuNPs。

在抗 COX-2 (a ), 抗 MIF (b ) 和 ALEXA (c ）。本研究中使用的球形纳米粒子的 TEM 图像，显示其尺寸和分布 (d ）。激发和发射狭缝为10 nm。 AuNPs的浓度保持恒定在29.6 ng/ml ^-1 .抗体浓度为100 ng/ml ^-1 （蓝色曲线），150 ng/ml ^-1 （红色曲线）和 200 ng/ml ^-1 （绿色曲线）

讨论

已经表明，AuNPs 由于其化学结构和大小而具有荧光特性，并且可以作为荧光信号的放大分子。更具体地说，AuNP 荧光本身源于金原子表面的亲热相互作用 [17, 18]。图 6 中的数据与银纳米粒子的研究结果相似，其将荧光发射增加归因于吸附剂物种与溶解在溶液中的分子氧之间的竞争。因此，金纳米粒子的荧光发射增加可能是由于BSA吸附在其表面[19]。

荧光信号是表面等离子体共振现象 (SPR) 的函数。因此，自由电子数量的增加导致更强烈的 SPR 信号，因为 SPR 是自由电子的集体振荡。吸附的 BSA 阻止表面自由电子与氧分子结合，导致荧光信号增加 [20, 21]。抗 COX-2、抗 MIF 和 ALEXA 可能已吸附在 AuNP 上，从而防止 O2 到达纳米颗粒的表面。这得到图 6 的支持，其中荧光信号的增加发生在不同抗体的极低浓度下。然而，值得注意的是，ALEXA 需要更高的浓度才能导致 AuNPs 表面的 O2 隔离。

慢性炎症过程的特点是免疫细胞（主要是巨噬细胞）在各自模型中由乙酸或乙醇引起的损伤部位浸润。炎症的特征还在于响应病原体或压力条件的白细胞依赖性释放几种细胞因子和介质。 Among these cytokines, COX-2 and MIF are known to be markers for several inflammation processes, since they are pro-inflammatory cytokines. The green staining observed in Fig. 3 and Fig. 4 is due to the release of COX-2 and MIF cytokines, respectively.

In chronic UC and liver steatohepatitis, macrophages are the main cells found which can be classified into two major types:M1 macrophages and M2 macrophages. The classically activated macrophages (M1 macrophages) are proinflammatory and play a pivotal role in host defense against infection which is associated with iNOS and IL-23 production and their cell surface-expressed CD86 or HLA-DR that attract killer cells like neutrophils and/or direct Th1 (cytotoxic) responses and stimulate further M1-type responses [22]. Meanwhile, the alternatively activated macrophages (M2 macrophages) are associated with the responses to anti-inflammatory reactions as well as tissue remodeling [23]. In the tumor context, it has been documented that M2-polarized macrophages promote pro-tumor functions by production of a large array of growth factors such as COX-2 and MIF for tumor cells, which are essential for tumor proliferation [24].

It is well established that UC is an important risk factor for colonic epithelial dysplasia and adenocarcinoma [25, 26]. According to Agoff et al. [25], increased malondialdehyde (MDA) levels and upregulation of Bcl-2 during UC are potential mechanisms to explain the relationship between COX-2 overexpression and neoplastic progression. In UC, the inflammation boosts COX-2 activity, leading to genetic damage through increased production of MDA. MDA is a by-product of COX-mediated prostaglandin synthesis and lipid peroxidation, and it is also constitutively produced by COX-1. Since COX-2 upregulates Bcl-2 expression, it leads to resistance to apoptosis in UC-associated neoplasia [27].

MIF is a multipotent cytokine in the innate immune responses that contributes to hepatic injury driven by alcohol-induced steatohepatitis [28]. When steatohepatitis has developed, the liver morphology rarely goes back to normal, even after cessation. In addition, there is a higher risk of the development of cirrhosis, which is the last stage of alcoholic liver disease (ALD) before hepatocellular carcinoma (HCC) [29].

Studies show MIF presence in the sera after hepatic resection or expression in the course of liver cancer progression [30]. MIF is involved in COX-2 and PGE2 upregulation and directly promotes tumorigenesis by inhibition of p53 accumulation, which is a classic tumor suppressor gene that can promote cell cycle arrest and apoptosis in response to DNA damage [31].

In a previous study [6], we have demonstrated that AuNPs can be easily conjugated with the antibodies anti-β-catenin and anti-E-cadherin to specifically target colorectal carcinoma cells, whose clinical value can be found in an early diagnosis of cancer through non-invasive methods in body fluids such as saliva and urine. In addition, we developed a new protocol to decrease the 27 h that are usually needed for the standard protocol to about 1 h needed for our improved protocol, which makes this method eligible for a clinical colorectal cancer diagnostic.

In this study, we took advantage of the properties of AuNPs conjugated with primary antibodies and applied them for the indirect IF staining method of tissue sections. At this point, we cannot affirm whether the interaction of the antibody with the nanoparticle is purely physical or if there is a chemical bond, since the amount of antibodies used in this method are far too small to produce discernible signals in Fourier-transform infrared spectroscopy. Thus, we rely only on fluorescence data that suggest that conjugation was achieved by direct adsorption of antibodies on the AuNPs surface. Such enhancement has been rationalized in terms of competition between adsorbing species and molecular oxygen dissolved in solution, as explained before by Lima et al. [6]. We found that the replacement of ALEXA by the AuNPs in NP1 saves about 18 h (similar to A2), when compared to standard protocol and NP2 that require about 24 h, each, from the antigenic retrieval to the assembling of the slides for microscopic analysis (Fig. 7 and Table 1). The time for incubation with the primary antibody was 30 min for A2 and NP1, but overnight (18 h) for A1, NP2, and NP3 (Fig. 7a and Table 1).

Comparative schemes illustrating the immunofluorescence (a ) and flow cytometry protocols used in this study (b ）。 In immunofluorescence, AuNPs may be applied in 30-min incubation protocols as fluorescence-enhancing agents, providing faster results with comparable fluorescence levels to the traditional ALEXA protocol, which makes NP1 a suitable protocol for cancer diagnose. Time was counted from the antigen retrieval to the end of the second incubation. In flow cytometry, although the ALEXA marking was higher than that of the AuNPs, the N1 protocol with AuNPs allowed a greater saving of reagents as well as reduced the time required for the technique from 4 to 1 h

Moreover, we demonstrated MIF and COX-2 primary antibody-conjugated gold nanoparticles can be arranged on the surface of M2 macrophage as a fast alternative to analyze the immune profile of inflammation-induced cancer tissues by flow cytometry. Although the standard protocol is laborious, the intensity of marking to both the primary antibodies was higher than primary antibody-conjugated gold nanoparticles. However, the primary antibody-conjugated gold nanoparticles needed less reagents and the time saving was higher as seen in the standard protocol (4 h) and in primary antibody-conjugated gold nanoparticles N1 protocol (1 h) (Fig. 7b). These results suggest that M2 macrophages can be targeted with primary antibody-conjugated gold nanoparticles either to diagnosis or therapy.

The time saving, the specificity, and the low cost provided by NP1 are especially important in cancer diagnosis, when fast and accurate results are highly required. It is important to highlight that, although the models adopted for this work were based on inflammation diseases, the inflammation markers used in this study are highly cancer-correlated and AuNPs provide multiple possibilities for application in clinical research and diagnosis.

Conclusions

All nanoparticle protocols tested showed similar fluorescent intensities to those observed in standard IF, extending the application of AuNPs, not only in research, but also in clinical diagnostics. When diluted with ALEXA, AuNPs allow greater dilutions with acceptable fluorescence intensity. More importantly, AuNPs can be used in faster protocols (e.g., 30-min incubation protocols), completely substituting ALEXA and providing a way to develop further technologies that will improve cancer diagnose and other diseases. We believe that these findings will contribute to advance research and diagnostic procedures that utilize IF methods as well as widen the applications of AuNPs in biotechnology.

缩写

A1:

ALEXA standard protocol

A2:

ALEXA modified protocol

ALD:

Alcoholic liver disease

ALEXA:

Alexa Fluor® 488®

AuNP:

Gold nanoparticles

BSA:

Bovine serum albumin

COX-2:

Cyclooxygenase-2

FC:

Flow cytometry

FI:

Fluorescence imaging

IF:

Immunofluorescence

MDA:

Malondialdehyde

MIF:

Macrophage migration inhibitory factor

NP1:

Nanoparticles protocol 1

NP2

Nanoparticles protocol 2

NP3:

Nanoparticles protocol 3

SPR：

表面等离子体共振

UC:

Ulcerative colitis