加载姜黄素的壳聚糖-牛血清白蛋白纳米颗粒可能增强阿尔茨海默病中的 Aβ 42 吞噬作用和调节巨噬细胞极化

介绍

阿尔茨海默病 (AD) 是一种神经退行性疾病，其特征是起病隐匿和认知能力下降。在组织病理学上，淀粉样蛋白 β (Aβ) 42 作为一种含有 42 个氨基酸的肽聚集成淀粉样蛋白 β 肽原纤维，其特征是 AD 中的细胞外“老年斑”，从而诱导神经元凋亡和突触丢失 [1,2,3] .通常，Aβ 42 单体在生理上是可溶的且无毒的，而其寡聚体在体外和体内毒性更大 [4, 5]。因此，通过清除 Aβ 42 单体来干预 Aβ 42 聚集被广泛认为是 AD 最合适的治疗靶点 [6,7,8,9]。众所周知，Aβ 肽可以通过与包括 TLR4 在内的几种 Toll 样受体 (TLR) 相互作用来触发小胶质细胞活化，并且它们还促进 CD14-、TLR4-或 TLR2 依赖性吞噬作用和 Aβ 42 的清除 [10, 11,12]。尽管小胶质细胞激活可以促进 Aβ 42 的清除，但小胶质细胞（一种单核巨噬细胞）可能过度激活并极化为 M1 表型（以释放潜在的神经毒性可溶性因子和促炎细胞因子为特征），从而导致导致神经元死亡并加剧 AD 的发展。相反，一些小胶质细胞属于经典活化 (M2) 表型，其特征是产生抗炎细胞因子；这些可改善 AD 中的认知功能障碍 [13,14,15,16]。因此，M1/M2型巨噬细胞的比例可显着影响AD的进展[17, 18]；此外，将促炎 M1 转化为抗炎 M2 巨噬细胞所需的上调将在 AD 的预防和治疗中显示出广阔的潜力。

姜黄素源自印度香料姜黄 (Curcumin longa)（姜的一种）的一种成分，是一种有效的抗炎剂，可以减轻炎症，甚至可能在治疗 AD 中发挥作用 [19]。近年来，据报道姜黄素具有抗淀粉样蛋白、抗炎、抗氧化和金属螯合特性，可能具有潜在的神经保护作用 [20, 21]。姜黄素通过抑制 Toll 样受体 4-丝裂原活化蛋白激酶 (TLR4-MAPK)/NF-κB 通路来调节巨噬细胞极化 [22,23,24]。然而，姜黄素较差的稳定性和生物利用度限制了其临床应用。此外，血脑屏障（BBB）的存在也阻止了姜黄素在AD治疗中的渗透[25,26,27]。

为了增强药物从血液到大脑的运输，表面用肽 [28] 和抗体 [29] 功能化的纳米颗粒 (NPs) 有助于药物穿过 BBB，并且可以通过其他主动运输机制显着提高 NPs 的 BBB 渗透效率而不是简单的被动扩散 [30]。壳聚糖 (CS) NPs——一种与 Aβ 结合的纳米载体——可以渗透 BBB 并且是非免疫原性的 [31]。此外，在人体循环血浆中发现血清白蛋白的浓度为 50 g/L，它无毒且免疫系统耐受性良好 [32, 33]。还有报道称，牛血清白蛋白 (BSA) 衍生的纳米颗粒具有缓释特性，可延长药物的半衰期，从而降低给药频率并提高患者依从性 [34]。因此，我们使用 CS 和 BSA 作为两种生物材料来制备负载姜黄素的 CS-BSA NPs，以实现最佳的 BBB 渗透。研究姜黄素对Aβ42吞噬作用、炎性细胞因子分泌及TLR4-MAPK/NF-κB通路调控的影响，进一步证实姜黄素对巨噬细胞极化的分子机制。

材料

脱乙酰度为 80% 且分子量约为 400 kDa 的 CS 购自海欣生物制品有限公司（中华人民共和国宁波）。 BSA 购自 Sigma-Aldrich Co.（St. Louis, MO, USA），姜黄素购自大连美伦生物科技有限公司（中华人民共和国大连）。 FITC-β-淀粉样蛋白 (1-42) 购自中国多肽有限公司（中华人民共和国杭州）。其他购买的化学品为分析级，购自 Sigma-Aldrich 公司。巨噬细胞系 RAW 264.7（小鼠白血病单核细胞巨噬细胞系）和脑微血管内皮细胞系（hCMEC/D3）作为模型人类血脑屏障，由中国科学院上海细胞生物学研究所，上海（中华人民共和国）建立。两种细胞都保持在 37°C 的温度和 5% 的 CO2 气氛中，在补充有 10%（体积/体积）热灭活胎牛血清和抗生素（100 U/mL青霉素和 100 毫克/毫升链霉素）。据报道，用脂多糖 (LPS) 处理的 RAW 264.7 细胞概括了在以 AD 为代表的神经退行性疾病中观察到的小胶质细胞的各个方面 [35, 36]。因此，进一步应用脂多糖（LPS；1 μg/ml）将巨噬细胞系RAW 264.7细胞极化为M1表型，以模拟AD中的小胶质细胞。

加载姜黄素的 CS-BSA NP 的制备

根据我们之前的报告 [37]，在静电相互作用下，带正电的 CS 可以与带负电的 BSA 共轭形成 NPs。制备方法如下：用0.1%醋酸溶解CS，得到0.5 mg/mL CS溶液，然后在CS溶液中加入100 μL含有0.05 mg/mL姜黄素的DMSO，在磁力作用下充分混合。在室温下搅拌。作为适量的BSA溶液，将1.0 mg/mL缓慢滴入CS和姜黄素的混合物中；此时，乳光现象出现，CS-BSA NPs进一步凝聚成固体颗粒。此外，还研究了纳米颗粒的尺寸、多分散性、zeta 电位和形态。使用先前报道的方法 [37] 估计了 NPs 的体外药物释放。姜黄素在NPs中的包封率(EE, %)通过下式计算。

\( \mathrm{EE}\%=\frac{W_{\mathrm{total}}-{W}_{\mathrm{free}}}{W_{\mathrm{total}}}\times 100\% \ )

W 总量是最初添加的姜黄素的量，W free是上清液中姜黄素的残留量。

MTT 评估细胞凋亡

为了确定 CS-BSA NPs 对细胞凋亡的安全性，使用 MTT 测定来评估细胞活力。根据我们之前研究的方案，使用不同量的空白 CS-BSA NP 在 37°C 下处理 RAW 264.7 细胞（M1 表型）和 hCMEC/D3 细胞 24 小时以进行进一步分析。

使用体外 BBB 模型的渗透研究

使用脑微血管内皮细胞系 hCMEC/D3 的单层 transwell 培养是一种常见的体外 BBB 模型，用于研究 NPs 的脑传递。将 hCMEC/D3 细胞混合物（总体积为 0.5-1.0 mL）添加到 12 孔 transwell 板上室的插入物中，用于单层细胞培养，跨内皮电阻> 300 Ω；将 pH 值为 7.4 的 PBS 添加到下室中。将游离姜黄素和载有姜黄素的 CS-BSA NP 悬浮液置于上室中，在设置为 37°C、5% CO2 的培养箱中连续培养 3 小时。之后，游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NP 被转移到细胞中并进入下室。通过检查姜黄素的荧光强度，使用酶标仪（Synergy-2；BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）检测渗透的 NP 的定量，姜黄素在 425 nm 激发并在 530 nm 发射。相对荧光比 (RFR, %)，代表 NPs 的渗透率，通过确定下室中渗透的加载姜黄素的 CS-BSA NPs 的荧光强度与最初添加的姜黄素的荧光强度的比率来计算 -在上室加载 CS-BSA NP。不同的内吞抑制剂，例如 10 μg/mL 的氯丙嗪（抑制网格蛋白介导的摄取）、1 μg/mL 的染料木黄酮（小窝蛋白介导的摄取）、细胞松弛素 D（30 μM，巨胞饮作用）和 20 μg/mL 的钠叠氮化物（一种能量抑制剂）用于确定各种渗透机制中涉及的各种内吞途径。通过比较抑制剂处理的纳米颗粒与非抑制剂处理的纳米颗粒的渗透率，确定相对渗透率。

加载姜黄素的 CS-BSA NPs 的细胞摄取

使用共聚焦激光扫描显微镜（FluoView FV10i；Olympus Corporation，Tokyo，Japan）观察 RAW 264.7 细胞（M1 表型）中装载姜黄素的 CS-BSA NP 的分布和位置。将 hCMEC/D3 细胞混合物（总体积的 0.5–1.0 mL）添加到 12 孔 Transwell 板上室的插入物中，用于单层细胞培养，跨内皮电阻> 300 Ω。 RAW 264.7 细胞（M1 表型）接种在下室。将游离姜黄素和加载姜黄素的 CS-BSA NP 悬浮液放入上室，在设置为 37°C、5% CO2 的培养箱中连续培养。在预定的时间间隔内，通过共聚焦激光扫描显微镜检测姜黄素发出的绿色荧光，观察游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NPs 在 RAW 264.7 细胞（M1 表型）中的细胞分布。

检测游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NPs 诱导的 Aβ 42 吞噬作用

将全生长培养基中的 RAW 264.7 细胞（M1 表型）接种在 12 孔板中（1 × 10 ⁵ 细胞/孔）并在 37°C 下用游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NPs 处理 24 小时。为了去除未内化的姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NP，使用蒸馏水在短时间内洗涤细胞两次。发现姜黄素和载有姜黄素的CS-BSA NPs完全从培养基中去除，蒸馏水洗过的细胞形态完整，没有细胞爆裂，因此没有明显的蒸馏水细胞诱导低渗透压的风险被观测到。最后，将溶解在 PBS (pH 7.4) 中的游离 FITC 标记的 Aβ 42 添加到板中以连续孵育 3 小时。 FITC 标记的 Aβ42 对 RAW 264.7 细胞（M1 表型）的吞噬作用通过检测 FITC 发出的绿色荧光来表示。使用共聚焦激光扫描显微镜（FluoView FV10i; Olympus Corporation）进一步研究细胞内Aβ42的吞噬作用和细胞内的定位。

蛋白质印迹分析

为了探索姜黄素介导的巨噬细胞极化的可能分子机制，我们检查了促炎细胞因子的表达水平，如肿瘤坏死因子 (TNF)-α 和白细胞介素 (IL)-6，以及 ERK、JNK 的磷酸化水平、p38 和 NF-κB 通过蛋白质印迹进一步研究姜黄素对 TLR4-MAPK/NF-κB 信号通路的特异性作用。

结果

加载姜黄素的 CS-BSA NP 的表征

使用 Zetasizer (Nano ZS90; Malvern Instruments, Malvern, UK) 和透射电子显微镜 (TEM) (Jeol, Tokyo, Japan) 在加速电压为200 kV。图 1 中显示的结果表明，CS-BSA NP 的平均尺寸分​​别为 143.5 nm，负 zeta 电位为 - 10.8 mV，多分散性为 0.021。观察到负载姜黄素的 CS-BSA NPs 呈球形且单分散。将得到的含有姜黄素负载的 CS-BSA NPs 的悬浮液离心得到上清液，以确定姜黄素的吸光度，并根据标准曲线计算上清液中游离姜黄素的含量。 NPs 中姜黄素的包封率 (EE, %) 为 95.4%。就纳米颗粒的药物释放过程而言，负载姜黄素的 CS-BSA 纳米颗粒在 pH 值为 7.4 的介质中显示出双相释放模式。大约 11.3% 的药物在前 3 小时内释放，这表明当 NPs 在到达 BBB 之前进入血液循环时，姜黄素被很好地保护并包裹在 NPs 的核心中。此外，一些药物从 NP 中泄漏并在前 3 小时内释放到血液中。大多数载有姜黄素的 CS-BSA NPs 可以在 BBB 周围转运并增强脑周围的药物浓度。

加载姜黄素的 CS-BSA NPs 的表征。 一 加载姜黄素的 CS-BSA NPs 的 TEM 图像。 b 获得的姜黄素负载 CS-BSA NP 的动态光散射 (DLS) 分析。 c 获得的姜黄素负载 CS-BSA NPs 的 Zeta 电位分析。 d 获得的负载姜黄素的 CS-BSA NPs 在 pH 为 7.4 的磷酸盐缓冲盐水中的体外释放曲线，在 37 °C 下 48 h

使用体外 BBB 模型的渗透研究

通过使用酶标仪（Synergy-2; BioTek Instruments）检查下腔中姜黄素的荧光强度来评估游离姜黄素和NPs的渗透率，并通过测定渗透姜黄素的荧光强度比来计算它们-在下腔室中加载的 CS-BSA NPs 与在上腔室中最初添加的加载姜黄素的 CS-BSA NPs 相同。结果（图 2）表明游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NPs 的渗透过程遵循时间依赖性模式，渗透率随时间增加。这表明游离姜黄素的渗透率为 1 小时 12.3%、2 小时 20.3% 和 3 小时 29.8%。与游离姜黄素相比，负载姜黄素的 CS-BSA NPs 的渗透效率提高，表现为渗透率增加；渗透率在 1 小时时增加到 37.7%，在 2 小时时增加到 45.6%，在 3 小时时增加到 60.2%。这表明游离姜黄素在穿透细胞时可能会遇到困难，并且对 BBB 的渗透性较差 [38, 39]。这一观察结果还表明，负载姜黄素的 CS-BSA NPs 可以有效促进药物渗透通过细胞，表明各种内吞途径所起的作用。内吞抑制试验表明，与以往报道一致[40]，游离姜黄素的渗透依赖于被动扩散，无论是否添加抑制剂，游离姜黄素的渗透效率均无明显变化。相反，NPs 的渗透率是能量依赖性的，叠氮化钠处理的相对渗透率为 55.6%。此外，小窝和巨胞饮作用主要介导了 NPs 的内吞途径。与非抑制剂处理相比，染料木黄酮和细胞松弛素D处理的细胞相对渗透率分别为67.8%和60.3%。

游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NPs 通过 hCMEC/D3 细胞的渗透机制分析。 一 游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NPs 渗透率的荧光光谱分析。结果表示为平均值 ± 标准偏差（n =3)。 *P <0.05, **P <0.01 与 1 小时时游离姜黄素的渗透率。 ^## P <0.01 与加载姜黄素的 CS-BSA NPs 在 1 小时的渗透率相比。 b 内吞抑制剂对游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NPs 渗透能力的影响。结果表示为平均值 ± 标准偏差（n =3)。 ^## P <0.01 vs 氯丙嗪处理后负载姜黄素的CS-BSA NPs的相对渗透率

MTT 评估细胞凋亡

空白 CS-BSA NPs 对 RAW 264.7 细胞 (M1) 和 hCMEC/D3 的细胞毒性作用通过 MTT 测定在体外进行评估。细胞用不同浓度的 CS-BSA NPs 处理，范围从 0 到 2.0 mg/mL。图 3 中的细胞活力测定表明，当用空白 CS-BSA NPs 处理时，RAW 264.7 细胞和 hCMEC/D3 细胞未观察到明显的细胞毒活性 [37]。

RAW 264.7 细胞 (M1) 和 hCMEC/D3 细胞在与不同量的裸 CS-BSA NP 孵育 24 小时后的存活率 (n =3)

NPs 的分布和细胞摄取

使用游离姜黄素和含有相同量姜黄素 100 μg/mL 的负载姜黄素的 CS-BSA NPs 处理 RAW 264.7 细胞 (M1)，并通过共聚焦激光扫描显微镜 (FluoView FV10i) 观察姜黄素的分布和细胞摄取；奥林巴斯）。从图 4 中可以看出，游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NP 的细胞内分布遵循时间依赖性模式，并且姜黄素的绿色荧光已在细胞内积累并分散在整个细胞质中。随着时间的推移，细胞内的绿色荧光强度增强。这表明细胞内游离姜黄素发出的绿色荧光非常微弱，表明大部分游离姜黄素没有被巨噬细胞系RAW 264.7吸收。由于 NPs 可能具有高效细胞内药物递送的潜力 [41, 42]，据观察，与用游离姜黄素处理的细胞相比，负载姜黄素的 CS-BSA NPs 显示出更高的荧光强度，表明 CS-BSA NPs 可以改善姜黄素的细胞摄取。在此，该观察表明CS-BSA NPs可以有效促进细胞内药物的积累。

RAW 264.7 细胞 (M1) 中游离姜黄素和加载姜黄素的 CS-BSA NPs 吸收 6 小时。姜黄素呈绿色荧光，表明游离姜黄素和负载姜黄素的 CS-BSA NPs 的细胞内位置。细胞核在 37°C 下用 Hoechst（蓝色）染色 15 分钟。比例尺为 50 μm，适用于所有图形部分

游离姜黄素和载有姜黄素的 CS-BSA NPs 诱导的 Aβ 42 吞噬作用

如图 5 所示，姜黄素在 550 nm 激发波长和 570 nm 发射波长下显示红色荧光。此外，它还在 FITC 的激发和发射波长处显示绿色荧光。因此，一旦姜黄素和 FITC 标记的 Aβ 42 被吞噬到 RAW 264.7 细胞 (M1) 中，它们都在 FITC 的激发和发射波长下显示出绿色荧光。在共定位实验中，红色荧光和绿色荧光（代表姜黄素）融合在一起，黄色圆点代表姜黄素在细胞内的存在和位置；一些绿点与红色荧光点不同，代表 FITC 标记的 Aβ 42 在 RAW 264.7 细胞 (M1) 中的存在和吞噬作用。观察到少量 Aβ 42 被小胶质细胞吞噬 [43]，这通过细胞内绿色荧光的细胞内观察得到证实。如图 5 叠加图所示，与游离姜黄素相比，更多的姜黄素黄色荧光点在细胞内积累，表明大量负载姜黄素的 CS-BSA NPs，如黄色荧光所示由于 NPs 和 RAW 264.7 细胞 (M1) 之间的相互作用，强度已经在细胞中积累。这会诱导更高的姜黄素细胞内浓度，导致 Aβ 42 的吞噬作用增加 [44]，表现为更高的绿色荧光强度。据推测，负载姜黄素的 CS-BSA NPs 诱导巨噬细胞极化，抗炎和神经保护作用有助于增强吞噬作用。

由游离姜黄素和加载姜黄素的 CS-BSA NPs 诱导的 Aβ 42 吞噬作用。比例尺为 50 μm，适用于所有图形部分

蛋白质印迹分析

为了探索姜黄素介导的巨噬细胞极化的可能分子机制，我们通过蛋白质印迹检测了 TNF-α、IL-6 和 TLR4 的总体水平以及 p38、ERK、JNK 和 IκBα 的磷酸化水平，以进一步研究姜黄素对TLR4-MAPK/NF-κB信号通路的特异性作用。

图 6 显示，与作为对照组的正常 RAW 264.7 细胞相比，RAW 264.7 细胞（M1 表型）释放出更多潜在的神经毒性可溶性因子和促炎细胞因子，其特征在于 TNF-α 和 IL-6 的表达水平较高，从而导致神经元死亡并加剧 AD 的发展。与对照和游离姜黄素相比，加载姜黄素的 CS-BSA NPs 似乎抑制了 M1 巨噬细胞极化，并在 RAW 264.7 细胞（M1 表型）中诱导了最低的 TNF-α 和 IL-6 表达。此外，加载姜黄素的 CS-BSA NPs 也降低了 TLR4 的表达，这调节了 M1 巨噬细胞极化和 ERK、JNK、p38 和 NF-κB 的磷酸化似乎降低。这表明负载姜黄素的 CS-BSA NPs 有效促进了姜黄素在细胞内的积累及其随后的细胞内浓度，从而增强了其对 TLR4-MAPK/NF-κB 信号通路的阻断作用，并进一步抑制了 M1 巨噬细胞极化。 <图片>

用游离姜黄素和姜黄素处理后，RAW 264.7 细胞（M1 表型）中 TNF-α、IL-6、TLR4 的表达水平以及 ERK、JNK、p38 和核因子 (NF)-κB 的表达水平的蛋白质印迹分析加载 CS-BSA NPs

讨论

AD是最常见的神经退行性疾病之一，也是发达国家的主要死因。关于 AD 的治疗，BBB 阻止大多数外源性物质进入大脑的能力是阻止其使用的主要障碍。为了解决这个问题，我们设计了 CS-BSA NPs 来改善姜黄素通过 BBB 的运输。结果表明，与之前的研究[45]一致，游离姜黄素难以穿透细胞并穿过血脑屏障，从而导致较低的穿透效果。加载姜黄素的 CS-BSA NPs 可以有效地促进药物通过 BBB 的渗透，介导细胞膜穴样内陷和微胞饮作用介导的途径。 Aβ 聚集诱导的神经炎症是 AD 病理机制的关键因素之一 [46]。大脑中的 Aβ 水平由 Aβ 的产生和清除之间的动态平衡决定；因此，去除 Aβ 对于确定其在大脑中的水平也很重要。小胶质细胞的吞噬能力在预防 AD 中显示出重要的生理意义。小胶质细胞主要负责清除 Aβ 靶标，并倾向于主要聚集在 Aβ 42 的沉积区周围，从而进一步防止 Aβ 42 通过吞噬作用积累 [47, 48]。结果表明，负载姜黄素的 CS-BSA NPs 处理的 RAW 264.7 细胞（M1 表型）对 Aβ 42 的吞噬作用增加，Aβ 42 的积累和沉积减少，这可能会改善 AD 的发展。

小胶质细胞（M1 表型）释放潜在的神经毒性可溶性因子和促炎细胞因子，如 TNF-α 和 IL-6，从而导致神经元死亡并加剧 AD 的发展 [49]。发现M1巨噬细胞极化依赖于TLR4-MAPK/NF-κB信号通路的激活，阻断TLR4-MAPK/NF-κB信号通路可抑制M1巨噬细胞极化，促进M1型巨噬细胞极化到 M2 类型 [50]。我们的结果表明，姜黄素作为印度香料的一种成分，姜黄（姜黄素 longa）——一种生姜——是一种有效的抗炎剂，可以减少炎症，甚至可能在 AD 治疗中发挥作用。 CS-BSA NPs 是姜黄素高效 BBB 靶向渗透的有力工具。与游离姜黄素相比，负载姜黄素的 CS-BSA NPs 诱导吞噬作用，大量 Aβ42 被 RAW 264.7 细胞吞噬。此外，加载姜黄素的 CS-BSA NPs 诱导的 TNF-α、IL-6 和 TLR4 的蛋白表达水平低于游离姜黄素，并且 ERK、JNK、p38 和 NF-κB 的磷酸化也受到抑制。表明负载姜黄素的CS-BSA NPs可能通过阻断TLR4-MAPK/NF-κB信号通路抑制M1巨噬细胞极化，从而增强姜黄素诱导的巨噬细胞吞噬作用，从而促进姜黄素的抗炎和神经保护作用。

结论

我们的数据表明姜黄素可用作治疗 AD 的治疗剂。加载姜黄素的 CS-BSA NPs 通过增强姜黄素的 BBB 渗透和更高的细胞内药物浓度触发 RAW 264.7 细胞诱导的 Aβ42 吞噬作用。此外，负载姜黄素的 CS-BSA NPs 通过抑制 M1 巨噬细胞极化和阻断 TLR4-MAPK/NF-κB 信号通路来诱导抗炎和神经保护作用。总之，负载姜黄素的CS-BSA NPs证明了它们在增强AD治疗方面的潜力。

缩写

广告：

阿尔茨海默病

BBB：

血脑屏障

BSA：

牛血清白蛋白

CS：

壳聚糖

LPS：

脂多糖

NP：

纳米粒子

TLR：

Toll样受体