姜黄素负载壳聚糖-牛血清白蛋白纳米颗粒增强Aβ42清除并调节巨噬细胞极化治疗阿尔茨海默病

摘要

阿尔茨海默病（AD）仍是老年人主要神经退行性疾病，但血脑屏障（BBB）、差的淀粉样蛋白-β（Aβ）清除和慢性神经炎症限制有效疗法。我们设计壳聚糖（CS）-牛血清白蛋白（BSA）纳米颗粒（NPs）将姜黄素——一种强效抗炎和抗淀粉样变性多酚——递送至大脑。姜黄素负载CS-BSA NPs达95.4%包封率、143.5 nm平均直径、-10.8 mV负表面电荷，确保稳定性和有利BBB渗透性。体外BBB模型显示NPs 3小时穿透率60.2%，远高于游离姜黄素（29.8%）。细胞摄取研究显示RAW 264.7巨噬细胞内姜黄素水平增强，进而增加Aβ42吞噬。机制上，NPs抑制TLR4-MAPK/NF-κB轴，下调促炎因子（TNF-α、IL-6），将巨噬细胞从神经毒性M1向保护性M2表型转化。研究表明姜黄素负载CS-BSA NPs增强Aβ42清除同时调节神经炎症，为AD治疗提供有前景的纳米药物平台。

引言

AD以进行性认知衰退和细胞外Aβ42纤维沉积为标志。单体Aβ42生理上良性，但低聚聚集体高度神经毒性并驱动疾病进程。靶向Aβ42聚集并促进清除是治疗核心策略。小胶质细胞作为脑驻留巨噬细胞，通过Toll样受体（TLRs）识别Aβ并吞噬肽段。然而慢性激活极化小胶质细胞为促炎M1表型，加剧神经元损伤。促进向抗炎M2表型转化已成为可行的疾病修饰方法。

姜黄素源自姜黄（Curcuma longa），具抗淀粉样变、抗氧化、螯合金属特性。可通过抑制TLR4-MAPK/NF-κB信号级联调节巨噬细胞极化。不幸的是，姜黄素溶解度差、代谢快、BBB渗透性有限，限制临床应用。

纳米颗粒载体可克服这些障碍。CS为阳离子生物相容多糖，能与阴离子蛋白如BSA形成稳定复合物。BSA血浆丰富、非免疫原，赋予纳米颗粒持释特性。结合CS和BSA，我们制备姜黄素负载NPs，优化BBB穿透和靶向递送至小胶质细胞。

材料

CS（脱乙酰度80%，~400 kDa）购自海信生物制品有限公司。BSA（Sigma-Aldrich）、姜黄素（大连美仑生物技术）、FITC标记Aβ42（中国肽业公司）商业购买。RAW 264.7（小鼠单核-巨噬细胞）和hCMEC/D3（人脑微血管内皮）细胞系在含10%胎牛血清和抗生素的DMEM中培养。LPS（1 μg/ml）用于极化RAW 264.7为M1表型，模拟AD中小胶质细胞激活。

姜黄素负载CS-BSA NPs制备

CS溶于0.1%乙酸（0.5 mg/ml）。姜黄素（0.05 mg/ml于100 μl DMSO）混入CS溶液磁力搅拌。随后滴加BSA溶液（1.0 mg/ml），形成乳光悬液经静电相互作用凝聚成固体纳米颗粒。动态光散射和TEM表征粒径、zeta电位、形貌。体外释放在磷酸缓冲液（pH 7.4）37°C评估，包封率（EE）按EE% = (W_total - W_free)/W_total × 100%计算，W_total为初始姜黄素量，W_free为上清液量。

MTT法细胞凋亡评估

空白CS-BSA NPs（0-2.0 mg/ml）与RAW 264.7（M1）和hCMEC/D3细胞孵育24 h，MTT法评估细胞毒性。

体外BBB模型穿透研究

经TEER>300 Ω的hCMEC/D3单层细胞培养于Transwell插入件。向上室加入游离姜黄素或姜黄素负载CS-BSA NPs（等效姜黄素100 μg/ml）。37°C孵育3 h后，测下室姜黄素荧光强度（激发425 nm，发射530 nm）。相对荧光比（RFR%）量化穿透效率。应用内吞抑制剂（氯丙嗪、染料木素、细胞松弛素D、叠氮化钠）阐明转运机制。

姜黄素负载CS-BSA NPs细胞摄取

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估RAW 264.7（M1）细胞经Transwell系统暴露于游离姜黄素或姜黄素负载NPs后姜黄素细胞内分布。6、12、24 h间隔监测姜黄素绿色荧光。

游离姜黄素与姜黄素负载CS-BSA NPs诱导Aβ42吞噬检测

RAW 264.7（M1）细胞经游离姜黄素或姜黄素负载NPs预处理后，与FITC标记Aβ42共孵育3 h。CLSM荧光和流式细胞术定量吞噬作用。

Western blot分析

检测TNF-α、IL-6、TLR4表达水平及ERK、JNK、p38、IκBα、NF-κB磷酸化状态，阐明姜黄素负载NPs对TLR4-MAPK/NF-κB轴的影响。

结果

姜黄素负载CS-BSA NPs表征

动态光散射显示平均直径143.5 nm，zeta电位-10.8 mV，分散指数0.021。TEM图像确认球形单分散颗粒（图1）。包封率达95.4%。释放曲线显示3小时内初爆释放11.3%，随后48小时持续释放，表明循环中有效保护姜黄素。

体外BBB模型穿透

游离姜黄素穿透率为12.3%（1 h）、20.3%（2 h）、29.8%（3 h）。姜黄素负载NPs同一时间点分别达37.7%、45.6%、60.2%（图2）。内吞抑制实验显示NPs依赖能量依赖、小窝和大胞饮介导途径，而游离姜黄素主要经被动扩散进入细胞。

细胞毒性评估

MTT实验确认空白CS-BSA NPs在2.0 mg/ml浓度下对RAW 264.7（M1）和hCMEC/D3细胞无细胞毒性（图3）。

细胞摄取

CLSM成像显示姜黄素在RAW 264.7（M1）细胞内随时间积累。姜黄素负载NPs产生显著更高细胞内荧光，表明递送增强（图4）。

增强Aβ42吞噬

姜黄素（红）与FITC-Aβ42（绿）共定位显示姜黄素负载NPs增加RAW 264.7（M1）细胞内Aβ42存在，绿色荧光密度更高（图5）。提示细胞内姜黄素升高增强小胶质细胞吞噬能力。

Western blot分析

与未处理对照相比，LPS极化RAW 264.7（M1）细胞显示TNF-α、IL-6、TLR4表达升高，ERK、JNK、p38、NF-κB磷酸化增加。姜黄素负载NPs显著降低这些促炎标志物和信号事件，凸显其抑制M1极化能力（图6）。

讨论

结果确认CS-BSA纳米颗粒显著增强姜黄素跨BBB递送，主要经小窝和大胞饮介导途径。改善脑穿透转化为更高细胞内姜黄素浓度，进而增强小胶质细胞Aβ42吞噬并减轻淀粉样斑块病理负担。

姜黄素负载NPs抗炎效应体现为抑制TLR4-MAPK/NF-κB级联和下调TNF-α、IL-6、TLR4。这种细胞因子调控将巨噬细胞从神经毒性M1表型重极化为抗炎M2状态，这一治疗策略日益被认可用于AD疾病修饰。

综上，姜黄素负载CS-BSA NPs作为多功能纳米药物平台，同时解决药物递送、淀粉样清除和神经炎症——AD治疗的关键障碍。

结论

姜黄素负载CS-BSA纳米颗粒有效穿透BBB，增强细胞内姜黄素积累，促进小胶质细胞Aβ42吞噬。同时通过抑制TLR4-MAPK/NF-κB通路和促进M2巨噬细胞极化缓解神经炎症。这些属性共同凸显该纳米平台治疗阿尔茨海默病的前景。