由于纳米颗粒/药物相互作用导致的金纳米颗粒在小鼠体内的毒性导致急性肾损伤

介绍

纳米技术在二十一世纪发挥着越来越重要的作用，纳米材料是纳米技术进步的基础。纳米粒子制造的最新发展有助于在全球范围内使用创新的纳米材料 [1, 2]。纳米材料的直径为 100 nm 或更小，示例包括金、银、二氧化硅、铂和二氧化钛纳米粒子，以及富勒烯和碳纳米管 [3, 4]。这些材料可能会应用于电子存储技术、基因/再生医学和电子设备，是 21 世纪新兴产业的基础 [5]。然而，PM2.5等纳米粒子会造成严重的环境污染、哮喘等呼吸系统疾病和缺血性心脏病[6]。此外，汽车排放的柴油颗粒可通过进入大脑和生殖器官产生生物效应[7]，纤维细颗粒如石棉诱发间皮瘤，工业纤维纳米材料如碳纳米管可能对人体健康产生负面影响[8、9]。因此，关于纳米粒子的生物学效应仍有许多未知数。

金 (Au) 具有低电离倾向和高稳定性，自古以来就被用作装饰用途的贵金属。最近开发的金纳米粒子由于其特有的光学特性而被广泛应用于医学和工程应用 [10, 11]，其优异的光电特性使其在有机太阳能电池、传感器探针和导电材料中得到应用 [12, 13] .金纳米粒子在化学工业中用作丙烯酸树脂合成的催化剂。与铂纳米颗粒相比，它们还表现出优异的氧化 CO 的低温催化活性，因此可用作废气净化催化剂。金纳米粒子的进一步应用有望在未来得到进一步的应用，但关于金纳米粒子的毒性及其与药物潜在相互作用的研究很少。

随着研究人员探索纳米粒子的安全性、药理学和药代动力学，纳米技术领域正在扩大。二氧化硅纳米粒子已被证明会引起细胞毒性、肝毒性和胎盘损伤 [14, 15]，而碳纳米管可诱发肺间皮瘤 [16]。然而，人们对纳米颗粒与药物之间相互作用产生的药理作用知之甚少。在这项研究中，我们研究了直径为 10、50 和 100 纳米的金颗粒（分别为 GnP10、GnP50 和 GnP100）对小鼠的毒性，以阐明它们在哺乳动物中的安全性。此外，我们研究了这些纳米颗粒对百草枯（PQ，一种众所周知的肝毒素和肾毒素）[17]、顺铂（CDDP，一种广泛使用的抗肿瘤剂）[18、19] 和 5-氨基水杨酸的毒性的影响。酸（5-ASA，一种常见的抗炎药）[20]。

结果与讨论

我们首先使用 Zetasizer 测量金纳米颗粒的粒径，然后使用透射电子显微镜观察颗粒（图 1a、b、c）。 GnP10、GnP50 和 GnP100 纳米颗粒的平均直径分别为 15.7 ± 7.0、53.3 ± 14.2 和 97.0 ± 27.1 nm（补充图 1）。此外，金纳米粒子在通过电子显微镜测量时会聚集，但在给予小鼠时不会聚集。此外，我们通过 ICP-MS 测量了金离子浓度，但没有检测到离子（数据未显示）。金纳米粒子的表面用柠檬酸改性以增加纳米粒子对水的亲和力，但这种改性没有表现出其他功能。

金纳米粒子的超微结构。 GnP10 的电子显微照片 (a ), GnP50 (b ) 和 GnP100 (c ) 纳米粒子

我们通过尾静脉向小鼠施用 4 mg/kg 的最大剂量来检查 GnP 是否表现出肝毒性和肾毒性。当单独施用金纳米颗粒时，未观察到肝毒性或肾毒性（图 2）。单独施用 GnP10、50 和 100 的小鼠的 ALT 和 AST 值（图 2a、b）与对照值相似，BUN 和 Cr 值也是如此。单次给予小鼠 GnP 不会引起肝脏或肾脏损伤，也不会引起心脏、肺或脾脏损伤（补充图 2），表明单独给予小鼠金纳米粒子是无毒的。

金纳米粒子对顺铂诱导的毒性的影响。小鼠腹膜内注射顺铂 (CDDP)，浓度为 0（空心柱）或 100 μmol/kg（实心柱），同时静脉注射赋形剂或金纳米颗粒（4 mg/kg）。在注射后 24 小时，肝酶丙氨酸转氨酶（ALT；面板 a ) 和天冬氨酸氨基转移酶 (AST; panel b ), 和血浆尿素氮水平 (BUN; panel c ) 和肌酐（Cr；面板 d ) 使用市售试剂盒测定（参见“生化分析”部分）。数据表示为平均值 ± 平均值的标准误差 (SEM; n =4）。显着差异 (*P <0.05, **P <0.01) 媒介物治疗组和 CDDP 治疗组之间

据报道，二氧化硅纳米颗粒、纳米粘土或聚苯乙烯纳米颗粒与药物或化学品共同给药可引起肝肾损伤 [14, 21, 22]。因此，我们将金纳米粒子与 PQ（一种肝肾毒素）或药物 CDDP 或 5-ASA（会导致不利的肝肾毒性作用）共同给药。图 2 显示了金纳米粒子与 CDDP 相互作用的结果。 GnP10或GnP50和CDDP的共同给药增加ALT并诱导肝损伤（图2a），GnP10和CDDP的共同给药增加BUN和Cr，诱导肾损伤（图2c，d）。然后我们研究了 GnP 和 5-ASA 之间的相互作用，5-ASA 是一种广泛使用的抗炎药，会导致肝肾损伤。 GnP10 或 GnP50 与 CDDP 的共同给药增加了 ALT 并诱导了肝损伤（图 3a），而与 5-ASA 共同给药增加了 BUN 和 Cr 并诱导了肾损伤（图 3c、d）。接下来，我们研究了 GnP 和 PQ 之间的相互作用，PQ 是一种广泛使用的农药，会导致肝肾损伤。 GnP10 和 PQ 的共同给药增加了 BUN 和 Cr 水平并诱导了肾损伤（图 4c、d）但没有引起肝损伤（图 4a、b）。测试的最小金颗粒 GnP10 与 CDDP、5-ASA 或 PQ 的共同给药导致本研究中观察到的最高 ALT、BUN 和 Cr 值。当与 CDDP、5-ASA 或 PQ 共同给药时，10 倍大的 GnP100 颗粒不会引起肝或肾损伤。这些结果表明，当直径小于 100 nm 的颗粒与 CDDP、5-ASA 或 PQ 共同给药时，GnP 是有毒的。

金纳米粒子对 5-氨基水杨酸诱导的毒性的影响。给小鼠腹膜内注射 0（空心柱）或 500 mg/kg（实心柱）的 5-氨基水杨酸 (5-ASA)，同时静脉注射赋形剂或金纳米颗粒 (4 mg/kg)。注射后 24 小时，血清中肝酶丙氨酸转氨酶 (ALT; a ) 和天冬氨酸氨基转移酶 (AST; B)，以及血尿素氮 (BUN; c) 的血浆水平 ) 和肌酐 (Cr; d ) 使用市售试剂盒测定（参见“生化分析”部分）。数据表示为平均值 ± 平均值的标准误差 (SEM; n =4）。显着差异 (*P <0.05, **P <0.01) 媒介物和 5-ASA 治疗组之间

金纳米粒子对百草枯诱导毒性的影响。给小鼠腹膜内注射 0（空心柱）或 50 mg/kg（实心柱）的百草枯 (PQ)，同时静脉注射赋形剂或金纳米颗粒 (4 mg/kg)。注射后 24 小时，血清中肝酶丙氨酸转氨酶 (ALT; a ) 和天冬氨酸氨基转移酶 (AST; b ), 和血浆尿素氮水平 (BUN; c ) 和肌酐 (Cr; d ) 使用市售试剂盒测定（参见“生化分析”部分）。数据表示为平均值 ± 平均值的标准误差 (SEM; n =4）。显着差异 (*P <0.05, **P <0.01) 媒介物治疗组和 PQ 治疗组之间

GnP10 与 CDDP、5-ASA 或 PQ 共同给药后的肾苏木精和伊红观察结果（图 5）显示肾小管损伤，表明诱发了急性肾损伤。接下来，我们测量了血清中的 IL-6 和 TNF-α，以研究 GnP10 诱导的急性肾损伤的根本原因。图 6 显示了 GnP10 与 CDDP、5-ASA 或 PQ 共同给药后 3 小时的血清 IL-6 水平。在单独使用 GnP10 的组中未检测到 IL-6，但当 GnP10 与 CDDP、5-ASA 或 PQ 共同给药时，观察到 IL-6 增加。在任何组中均未检测到 TNF-α（数据未显示）。这些结果表明IL-6参与了GnP10和CDDP、5-ASA或PQ诱导的急性肾损伤。

金纳米粒子处理小鼠肾组织的组织学分析。在静脉注射后 24 小时仅施用 GnP10 (a )、带有 CDDP 的 GnP10 (b )、GnP10 与 5-ASA (c )，以及带有 PQ 的 GnP10 (d )，收集组织，用 4% 多聚甲醛固定，切片，苏木精和伊红染色。箭头表示肾脏损伤部位

通过ELISA测量的血清中的IL-6水平。小鼠接受了含有 CDDP、5-ASA 或 PQ 的 GnP10 的 IV 注射。在给药后 3 小时测量细胞因子水平。值是平均值 ± 标准误差 (SE; n =4)

我们研究了金纳米粒子和药物共同给药对副作用（即肝肾损伤）的影响。与 CDDP、5-ASA 或 PQ 共同给药时，最小粒径 GnP10 会引起肾脏和肝脏损伤。我们还将 GnP10 与对乙酰氨基酚、链霉素或四环素共同给药于小鼠，并没有观察到肝脏或肾脏损伤（数据未显示）。我们之前报道过，二氧化硅纳米颗粒会导致肝损伤，具体取决于粒径 [23]，而聚苯乙烯纳米颗粒在与药物共同给药时可能会诱发肝损伤，具体取决于粒径 [24]。夏等人。据报道，较小的金纳米粒子在体外更具遗传毒性[25]。综上所述，金纳米颗粒随着粒径的减小与药物相互作用而变得具有剧毒。

Gnp10 与顺铂、5-ASA 或 PQ 的共同给药增加了 IL-6 水平（图 6）。 IL-6 未因单独施用 GnP10（图 6）或单独施用 CDDP、PQ 或 5-ASA（数据未显示）而升高。之前有报道称 IL-6 参与诱导肝 [26] 和急性肾 [27, 28] 损伤。我们认为 Gnp10 诱导 IL-6，进而诱导肝肾损伤，但潜在机制尚不清楚。鲍扎等人。据报道，IL-6 通过诱导肝细胞中的转录因子来诱导肝损伤 [29]。了解细胞特异性转录因子在 IL-6 诱导的肝肾损伤中的作用，需要进一步研究金纳米粒子的细胞毒性机制。

最近，金纳米粒子作为用于药物递送系统的功能性生物材料引起了人们的关注 [30]，并且正在积极开展使用金纳米粒子治疗癌症的研究。例如，安塞尔莫等人。据报道，PEG 包覆的二氧化硅金纳米粒子在吸收光和热溶解实体瘤时会增加局部温度 [31]，表明金纳米粒子是用于癌症治疗的有前途的材料。然而，我们发现抗癌药物顺铂与金纳米颗粒之间的相互作用会引起肾损伤（图2），表明金纳米颗粒在癌症治疗中的应用需要研究其与药物共同给药时的安全性。

结论

总之，Gnp10 在与 CDDP、PQ 或 5-ASA 共同给药时会导致肾脏损伤。 GnP50 仅在与 5-ASA 共同给药时才会引起肾损伤，而 GnP100 则不会。我们证明了金纳米粒子会导致肾脏损伤，并且由于与化学物质或药物的相互作用，这种影响会协同加剧。需要基于这些数据进行进一步研究，以充分阐明拟用于诊断或治疗用途的纳米颗粒的毒理学特征。

材料和方法

材料

直径为 10、50 和 100 纳米的柠檬酸盐配体封端的金颗粒悬浮液购自 NANOCOMPOSIX, INC.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。使用 Zetasizer（Sysmex Co.，Kobe，Japan）和 TEM JEOL JEM-1011 透射电子显微镜分析颗粒的尺寸分布。平均直径为 15.7 ± 7.0、53.3 ± 14.2 和 87.0 ± 27.1 nm（图 1，补充图 1）。水悬浮液 (1 mg/mL) 在使用前通过超声彻底分散并用水稀释。通过 ICP-MS 检测金纳米颗粒悬浮液中电离金的存在，没有检测到电离金。对于每个实验，将相同体积的每种悬浮液注射到小鼠中。颗粒的几何尺寸通过TEM表征。将百草枯（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）、顺铂和 5-氨基水杨酸（Wako Pure Chemical Industries，Osaka，Japan）溶解在盐水中并储存在 - 20 °C 直至使用。所有试剂均为研究级。

动物

八周龄 BALB/c 雄性小鼠购自 Funabashi Farm Co., Ltd.（日本千叶）。将动物维持在受控环境中（温度 23 ± 1.5 °C；光照 12 小时光照/黑暗循环），可自由获取标准啮齿动物食物和水。在开始实验之前给小鼠1 周的适应期。实验方案符合帝京平成大学药学研究生院的伦理指南，由日本实验动物科学协会的动物实验指南汇编而成。

生化分析

血清丙氨酸转氨酶 (ALT)、血清天冬氨酸转氨酶 (AST)、血尿素氮 (BUN) 和肌酐 (Cr) 使用市售试剂盒 (Wako Pure Chemical Industries) 根据制造商的方案进行测量。简而言之，将收集的血清 (10 mL) 与 1 mL 的 A 色试剂（含有脲酶）混合，并在 37 °C 下孵育 15 分钟。加入 1 mL 的 B 色试剂后，将样品在 37 °C 下孵育 10 分钟。在 570 nm 波长处测量吸光度。使用酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒（BioSource International，CA，USA）分析白细胞介素 (IL)-6 和 TNF-α。所有分析均严格按照制造商的说明进行。

组织学分析

给药后24 h，处死动物，取出肝脏，用4%多聚甲醛固定。处理切片后，薄组织切片用苏木精和伊红染色进行组织学观察。

统计分析

使用 Statcel 插件表格，3rd Excel 软件（EMS 出版有限公司，埼玉，日本）进行统计分析。所有数据均表示为平均值 ± 平均值的标准误差 (SEM)。使用 Dunnett 检验确定对照组和实验组之间的显着差异； P 小于 0.05 的值被认为是显着的。

数据和材料的可用性

不适用。

缩写

ALT：

丙氨酸氨基转移酶

AST：

天冬氨酸氨基转移酶

BUN：

血尿素氮

PQ：

百草枯

Cr:

肌酐