直接在丝网印刷电极上制造的微流体装置，用于 PSA 的超灵敏电化学传感

背景

微流体系统是操纵小体积（10 ⁻⁹ 到 10 ⁻¹⁸ L) 尺寸为数十至数百微米的通道内 [1]。该技术在生物医学、环境监测和食品安全分析等方面显示出巨大的潜力。特别是，微流体装置 (MFD) 通常表现出以下优势，包括占地面积小、减少试剂消耗、并行检测多个样本、提高可靠性、灵敏度以及高度和大规模集成 [2,3,4]。

电化学传感器已广泛集成并与采样、流体处理、分离和其他工程检测场景相结合 [5]。电化学传感器在生物分子检测中的应用前景广阔，因为电化学传感器具有许多优点，例如高灵敏度和选择性、可靠的重现性、连续现场分析的简单使用、最少的样品制备、相对较低的成本和短时间响应。电化学系统可以轻松集成到微流体系统 [6, 7] 中，这与传统分析平台 [8,9,10] 相比具有优势，例如易于样品制备、出色的灵敏度和多功能性以及去除笨重的光学元件 [11, 12].

在这项研究中，一种简单、廉价且通用的策略用于制造电化学传感 MFD，使用市售的丝网印刷电极进行即时诊断。开发的设备被定义为 CASPE-MFDs（市售的基于丝网印刷电极的微流体设备）。首先使用标准光刻法对聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 微流体通道进行图案化，然后通过将 PDMS 微流体通道直接粘合在市售丝网印刷电极上来制造 CASPE-MFD（图 1）。直接使用丝网印刷电极，并使用溶胶-凝胶方法涂上一层薄薄的玻璃[13]。随后，PDMS 微流体通道在其表面进行等离子体处理后结合到电极上。 CASPE-MFD 能够量化生物体液中各种分析物的浓度，例如磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 和血清样品。 CASPE-MFD 用于证明使用计时电流法 (CA) 和方波伏安法 (SWV) 检测和量化 PBS 缓冲溶液和人血清样品中的前列腺特异性抗原 (PSA) 生物标志物。该装置中 PSA 的检测显示出高灵敏度，PSA 的检测限 (LOD) 为 0.84 pg/mL (25.8 fM)。 LOD 比商业化验的 0.1 ng/mL 临床检测限高 100 倍以上 [14]，并且优于其他设备 [3, 15, 16]。 CASPE-MFD 便携、使用简单，并且有可能集成其他组件，如样品制备和分离系统。

一 由 SU-8 光刻图案化的 PDMS 微流体通道的制造过程。 b 市售丝网印刷电极微流体装置的制造工艺。 CASPE-MFD 包括 PDMS 微流体通道、两个印刷金电极作为工作电极和对电极，以及一个印刷银电极作为伪参考电极。 c 一种市售的丝网印刷电极微流控装置

材料和方法

化学试剂和材料

前列腺特异性抗原 (PSA) 和多克隆抗 PSA 抗体辣根过氧化物酶 (HRP) 购自 Petsec Energy Ltd。生物素化抗 PSA 抗体、链霉亲和素磁珠、牛血清白蛋白和对苯二酚购自 Fisher Scientific。 Tween-20、过氧化氢（H2O2；30%）和二茂铁羧酸来自 Sigma-Aldrich。 SU-8 2075 购自 MicroChem Corp。聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 预聚物和固化剂购自 Dow Corning。将所有免疫试剂溶解在来自 KD Medical Solutions 的 1x pH 7.4 PBS 缓冲溶液中。所有化学试剂均采用Millipore Milli-Q净水系统超纯水制备。

仪器

荧光显微镜在 Olympus U-CMAD3 (Olympus, Japan) 上进行。 μCSPE 设备由等离子体清洁器 PDC-32G（Harrick Plasma，美国）制造。所有电化学测量均由 CHI 760B (CHI, China) 使用传统的三电极系统进行，该系统由两个印刷金电极分别作为工作电极和对电极，以及一个印刷银电极作为伪参比电极（图 1） ).

微流控芯片制造

使用标准光刻法对 PDMS 微流体通道进行图案化。简而言之，用混合溶液 (H2SO4/H2O2 =7/3) 冲洗然后用超纯水清洗的硅片，涂上 SU-8 2075 光刻胶。然后将晶片在 65 °C 下烘烤 7 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 40 分钟以去除溶剂，并通过光掩模将其暴露在紫外线下 15 秒。将整个系统在 65 °C 下烘烤 5 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 15 分钟以稳定聚合。通过将硅晶片浸泡在 SU-8 显影剂中并用异丙醇和去离子水洗涤来去除未聚合的光刻胶。将 PDMS 预聚物溶液和固化剂 (10,1) 的混合物浇铸在预先描述的硅片上，在 65 °C 下固化 2 h，然后剥离 [17]。

使用溶胶-凝胶方法将市售的印刷电极涂上一层玻璃。简而言之，将四乙氧基硅烷 (TEOS)、MTES、乙醇和水以 1:1:1:1 的比例充分混合，并超声处理 5 分钟。将混合物置于 65 °C 的烘箱中过夜。在玻璃涂层之前，将电极放置在 80 °C 的热板上 5 分钟，然后使用刷子涂抹前体混合物以避免混合物侵入电极表面。涂抹后将电极在室温下干燥。然后将PDMS芯片和玻璃覆盖的电极用O2等离子体处理30 s并相互粘合。

计时电流实验

计时电流实验在含有 4.5 mM 氢醌和 0.1 mM 过氧化氢溶液的 1× pH 7.4 PBS 中以 - 2.0 mV 步进电位（相对于银伪参考电极）进行，并生成 PSA 浓度从 0 开始的校准曲线到 10 ng mL ⁻¹ .简而言之，我们注射了 50 μL 的 0.2 mg mL ⁻¹ 以 50 μL min ⁻¹ 的速率将磁珠偶联的抗 PSA 抗体用于 μCSPE 装置 , 并使用 100 μL pH 7.4 PBS 以 50 μL min ^-1 的速率彻底洗涤 .此外，50 μL 封闭缓冲液（0.05% (v /v ) Tween-20 和 2% (w /v ) PBS 中的牛血清白蛋白 (BSA)) 以 10 μL min ^-1 的速率注射 并在37 °C条件下孵育30 min，用100 μL pH 7.4 PBS以50 μL min ^-1 的速度彻底洗涤 .然后以10 μL min ^-1 的速率注入50 μL不同浓度的PSA 在37 °C孵育30 分钟，然后用100 μL pH 7.4 PBS以50 μL 分钟 ^-1 的速度彻底洗涤 .此外，以10 μL min ^-1 的速率注射50 μL HRP偶联的抗PSA抗体（1:1000稀释） , 在 37 °C 下孵育 30 分钟，并使用 100 μL pH 7.4 PBS 以 50 μL min ^-1 的速率彻底洗涤 .最后，我们以50 μL min ^-1 的速率注入50 μL的1×pH 7.4 PBS，其中含有4.5 mM氢醌和0.1 mM过氧化氢溶液 .在峰值电流稳定后，我们将三个电流测量值取平均值并计算相应的标准偏差。最后，在 4 mV 的恒定电位下实施计时电流法，每组重复八次。为了确保 CASPE-MFD 在电化学实验过程中始终处于最佳状态，使用循环伏安法在新鲜制备的 0.5 M H2SO4 溶液中在 0.5 到 1.5 V 的电位范围内扫描 10 个循环，从而激活 CASPE-MFD 的电极.呈现了清洁多晶金的典型伏安特性。然后用超纯水和PBS溶液洗涤CASPE-MFD。

结果与讨论

制备 CASPE-MFD

均匀分布用于研究 CASPE-MFD 的效用。将荧光微珠溶液以 5 μL/min 的流速注入 CASPE-MFD 的通道中，可见 CASPE-MFD 的每个角落都充满了荧光微珠溶液，没有形成气泡在设备中（图 2）。将流速提高到100 μL/min以证明CASPE-MFD的稳健性，表明该装置适用于分析物检测。

一 用于拍摄荧光图像的丝网印刷光电极。 b CASPE-MFD 的荧光图像。我们使用光电极作为模型荧光图像来证明工作区域充满染料并且 CASPE-MFD 中没有气泡。 c 荧光图像局部放大图

还通过循环伏安图研究了制造过程，如图 3 所示。二茂铁羧酸用作模型氧化还原活性化合物，图 3a 显示了氧化还原峰值电流与不同电位扫描速率的关系。 CV 曲线的氧化还原峰表现出典型的可逆电化学反应，其中反应速率由电活性物质向电极表面的扩散控制。峰值阴极电位 (E pc) 和峰值阳极电位 (E pa)为62 mV，接近二茂铁氧化还原对的理论值59 mV。此外，峰值电位的位置不随电位扫描速率和阳极峰值电流 (i pa) 大约等于阴极峰值电流 (i pc) 在 10 到 350 mV/s 的范围内。可逆行为与本体溶液中的信号对应（附加文件 1：图 S1A），这表明没有发生副反应，并且正如预期的那样，电子转移动力学足够快以维持氧化还原的表面浓度- 能斯特方程所需值的活性物质。图 3b 显示阳极峰值电流 (i pa) 和阴极峰值电流 (i pc) 与扫描速率的平方根成正比，这意味着典型的扩散控制过程 [18]。此外，在 CASPE-MFD 中测量的电流非常接近散装溶液中的电流值（附加文件 1：图 S1B），这表明设备中的分析不会牺牲其灵敏度。

一 0.5 mM 二茂铁羧酸在 0.1 M KCl 水溶液 (pH 7.0) 中在 CASPE-MFD 中在不同扫描速率下的循环伏安图（沿 y 上升） -axis)：10、25、50、80、100、150、200、250、300 和 350 mV/s。 b 阳极 (i pa) 和阴极峰值电流 (i pc) 与方形扫描速率。两条线分别代表带有回归方程的线性曲线：Y (i pa) =0.9932X − 0.2563 (R ² =0.9996, n =8); 是 (i pc) =− 0.9384X − 0.1774 (R ² =0.9996, n =8)

CASPE-MFD 在 PSA 检测上的性能

最近的报告表明，4-10 ng/mL 范围内的前列腺特异性抗原 (PSA) 浓度通常表明存在前列腺癌的可能性很高 [19]。因此，选择 PSA 作为评估制备的 CASPE-MFD 性能的目标（图 4）。图 4a 显示制备的 CASPE-MFD 可以直接插入便携式电化学工作站。如图 4c 所示，使用磁铁将磁珠偶联的抗 PSA 抗体固定在金电极（工作电极）的表面。然后将 PSA 抗原注入制备的 CASPE-MFD 的微流体通道中，并与固定在工作电极上的抗 PSA 抗体结合。接下来，将 HRP 修饰的抗 PSA 抗体与 PSA 抗原结合。采用计时电流法检测对苯二酚和过氧化氢产生的电化学信号。

一 整个检测装置。注射泵用于将溶液注入 CASPE-MFD，电化学工作站用于检测电化学信号。 b CASPE-MFD 用于检测 PSA。免疫磁珠缀合的抗PSA抗体通过入口注入溶液，并使用磁铁捕获磁珠。 c CASPE-MFD 检测 PSA 抗原的示意图。使用磁铁将免疫磁性珠缀合的抗 PSA 抗体固定在工作电极上。将 PSA 抗原注入 CASPE-MFD 并与抗 PSA 抗体结合。然后将 HRP 修饰的抗 PSA 抗体与 PSA 抗原结合。采用计时电流法检测对苯二酚和过氧化氢产生的电化学信号

与其他电流测量技术相比，计时电流法提供了更好的信噪比 [20,21,22,23,24]，并且使用机械夹在电极上的薄流体板比分析更能抵抗振动更大体积的溶液。对于法拉第扩散受限电流，电流-时间响应由 Cottrell 方程描述。

其中 n 是电子数，F 是法拉第常数 (96,485 C/mol)，A 是电极面积 (cm ² ), D 是扩散系数 (cm ² /s) 和 C 是浓度 (mol/cm ³ ).

制备的CASPE-MFD用于检测一系列分析物溶液中的PSA，浓度为0～10 ng mL ^-1 . CASPE-MFD 中 PSA 检测的计时电流响应如图 5a 所示。在含有4.5 mM氢醌和0.1 mM过氧化氢的pH 7.4 PBS中，峰值电流随着PSA浓度的增加而增加。如图 5b（蓝线）所示，峰值电流与 PSA 浓度在 0.001 至 10 ng/mL 范围内的对数值成正比，线性回归方程为 I (μA) =14.87 + 3.927 × log C PSA (ng/mL) (R ² =0.9985, n =8)。低检测限(0.84 pg/mL)和良好的线性关系表明制备的CASPE-MFD可用于实际应用中的PSA检测。此外，我们还在图 5c 中使用方波伏安法 (SWV) 检测到 CASPE-MFD 中不同浓度的 PSA。 SWV响应也与计时电流法结果一致。

一 不同浓度 PSA 抗原的计时电流曲线（沿 y -轴）：0、0.001、0.01、0.1、1 和 10 ng/mL，在 pH 7.4 PBS 缓冲液中含有 4.5 mM 氢醌和 0.1 mM H2O2 在 CASPE-MFD 中的溶液，在 - 2.0 mV 相对于银伪参考电极b CASPE-MFD 在 pH 7.4 PBS 缓冲液（蓝线）和人血清（红线）中的峰值电流和 PSA 抗原浓度之间的线性关系。蓝线的线性回归方程为Y =14.87 + 3.927 × X (R ² =0.9985, n =8)，红线的线性回归方程为Y =14.15 + 3.622 × X (R ² =0.9986, n =8)。 c 在 CASPE-MFD 中含有 4.5 mM 氢醌和 0.1 mM H2O2 溶液的 pH 7.4 PBS 缓冲液中各种浓度 PSA 抗原的方波伏安图（沿 y 上升） -轴）：分别为 0、0.001、0.01、0.1、1 和 10 ng/mL。 d 不同浓度PSA抗原对应的线性关系。线性回归方程为 Y =34.53 + 9.246 × X (R ² =0.9884, n =8)

使用 CASPE-MFD 选择性检测 PSA

为了验证我们的设备在实际样品中的可能应用，我们使用计时电流法分析了人血清样品中各种浓度的 PSA。附加文件 1：图 S2 中获得的结果表明，PSA 的峰值电流也随着含有 4.5 mM 氢醌和 0.1 mM 过氧化氢的人血清中 PSA 浓度的增加而增加。此外，相应的校准曲线如图5b（红线）所示，线性回归方程为I (μA) =14.15 + 3.622 × log C PSA (ng/mL) (R ² =0.9986, n =8)。很明显，两组之间几乎没有统计学差异，表明制备的 CASPE-MFD 能够在实际样品中起作用。此外，证明了CASPE-MFD对靶向PSA具有很好的选择性，可用于临床诊断前列腺癌。

结论

我们开发了一种简单、低成本、便携的商用丝网印刷电极微流体电化学传感。此外，我们还展示了我们的 CASPE-MFD 用于定量分析 PBS 缓冲液和人血清样品中 PSA 的应用。由于该装置直接在商业丝网印刷电极上制造，因此测量显示出良好的灵敏度和重现性。 CASPE-MFD 有五个优点：(i) 轻便、便携、多用途； (ii) 标准化； (iii) 重现性好，灵敏度和准确度高； (iv) 使用方便，不需要专业的医务人员或复杂的仪器； (v) 它允许将高密度检测系统集成到一个小型设备中。此外，使用微型恒电位仪可以使 CASPE-MFD 能够进行现场或家庭诊断。此外，商业电极和易于制造可以实现 CASPE-MFD 的标准化和产业化。因此，我们认为该平台可广泛用于床旁诊断，如小分子（钠、钾、氯、葡萄糖）、癌症标志物（B 型利钠肽或 BNP、肌钙蛋白 I）、细胞（CD4） , 和核酸（DNA、RNA）。

缩写

MFD：

微流控装置

CASPE-MFD：

丝网印刷电极微流控装置

PDMS：

聚二甲基硅氧烷

PSA：

前列腺特异性抗原

CA：

计时电流法

SWV：

方波伏安法

细节层次：

检测限

HRP：

辣根过氧化物酶

TEOS：

四乙氧基硅烷

MTES：

亚稳态转移发射光谱

BNP：

B型利钠肽