分子印迹核壳 CdSe@SiO2/CD 作为 4-硝基苯酚传感的比率荧光探针

背景

由于硝基苯酚广泛用于生产除草剂、杀虫剂、合成染料和药物，因此它们是最丰富的环境污染物之一 [1]。特别是，4-硝基苯酚 (4-NP) 是毒性最强的取代硝基苯酚之一，即使在非常低的浓度下也对人类和野生动物具有致癌性和遗传毒性 [2]。事实上，美国环境保护署 (EPA) 已将 4-NP 列为优先污染物，并规定饮用水中 4-NP 的最大允许限量为 60 ng/mL [3]。因此，开发用于检测 4-NP 的灵敏且选择性的方法尤为重要。迄今为止，已提出多种分析方法来测定水中的 4-NP，包括色谱法 [4, 5]、电化学检测 [3, 6, 7]、化学发光检测 [8] 和荧光监测 [9,10 ,11]。量子点 (QD) 通常被用作荧光监测中的响应信号，并且由于其尺寸/组成依赖的光学和电子特性，也广泛用于光电化学制氢、光电器件和生物成像 [12,13,14]。用于测定痕量 4-NP 的荧光方法因其简单、快速和低成本而具有优势。然而，这些方法通常基于单个发光团荧光强度的变化，而这种变化很容易受到激发光强度 [15]、探针浓度 [16] 的波动以及荧光猝灭剂（如重荧光）的影响。金属离子 [17] 和活性氧 [18]。因此，基于比率荧光的策略可以被认为是优越的，因为它们通过两个或多个不同波段的自校准消除了大多数这些歧义[19]。有趣的是，与单发射量子点探针相比，许多比例荧光探针表现出显着增强的检测灵敏度，因此已广泛用于构建检测环境污染物的荧光探针，例如Hg ^{2+ 、硫化氢和二氧化硫 [20,21,22]。}

此外，分子印迹聚合物 (MIP) 是聚合物基质，可以定制以对目标分子表现出高选择性，通常用于分离、传感器和催化剂 [23, 24]。具有高灵敏度和选择性的荧光传感器的开发特别令人感兴趣，其中这些特性分别通过比率荧光和分子印迹策略得到保证。然而，关于这种用于测定痕量分析物的分子印迹双发射荧光传感器的报道有限[25, 26]。

因此，我们在此报告了基于 4-NP 和光致发光碳点 (CD) 之间的荧光共振能量转移 (FRET) 的用于敏感和选择性检测 4-NP 的分子印迹双发射荧光传感器的构建。在这种比率荧光传感器中，CdSe QD 将嵌入二氧化硅壳 (CdSe@SiO2) 中作为参考信号。我们预计二氧化硅涂层不仅由于其惰性和光学透明性而将保留 CdSe QD 的光致发光特性 [8]，而且还将防止有毒重金属 Cd 和 Se 的泄漏 [27]。此外，CdSe@SiO2 QDs 将进一步被有机硅烷功能化的 CDs（CdSe@SiO2/CDs）包围。作为一类新兴的荧光材料，CDs 因其成本低、无毒性、物理化学和光化学稳定性以及可调节的光致发光特性而备受关注 [28,29,30]。更具体地说，通过无水柠檬酸与氨基硅烷热解合成的有机硅烷官能化 CDs 保留了原始 CDs 的优点，并且可以通过简单的加热过程轻松固定在 CdSe@SiO2 上 [31]。此外，通过溶胶-凝胶分子印迹过程，模板分子可以很容易地固定在 CdSe@SiO2/CDs 的表面上 [32]。此外，在我们提出的系统中，由于制备的 CD 的发射光谱和 4-NP 的吸收光谱重叠，FRET 可以发生，这对 4-NP 的检测至关重要。最终，我们的目标是在使用 4-NP 作为模板在 CdSe@SiO2/CDs 表面制备印迹壳后制备分子印迹 CdSe@SiO2/CD 纳米杂化物（CdSe@SiO2/CDs/MIP）。然后通过透射电子显微镜 (TEM) 和光谱分析确定所制备传感器的形态、化学结构和光学特性。最后，将检验该传感器对4-NP的吸附能力、灵敏度和选择性。

方法

材料

四乙氧基硅烷 (TEOS)、Triton X-100 和石油醚购自天津科米欧化学试剂有限公司（中国天津）。环己烷、4-NP、己醇、氢氧化铵（25wt%）、无水乙醇、甲苯和异丙醇购自光复化学试剂有限公司（中国天津）。 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）和无水柠檬酸购自阿拉丁化学试剂有限公司（中国上海）。所有试剂均为分析纯，无需进一步纯化即可直接使用。羧基修饰的 CdSe/ZnS QD（CdSe QD）购自武汉嘉源量子点技术开发有限公司（中国武汉）。所有水均使用 Sartorius Arium® Pro VF 水净化系统（18.2 MΩ 电阻率）净化。

CdSe@SiO2 的合成

在强力磁力搅拌下将环己烷 (7.7 mL)、Triton X-100 (1.77 mL)、正己醇 (1.8 mL) 和 CdSe QD 溶液（400 μL，8 μM）混合。在成功形成反向微乳液后，引入 TEOS (50 μL) 和氢氧化铵溶液 (200 μL，25 wt%)。然后将反应系统密封并在 25°C 下继续搅拌 24 小时。此后，加入异丙醇 (36 mL) 破乳，所得沉淀物用乙醇洗涤数次，直至在上清液中检测不到荧光信号。在每次洗涤过程中，对颗粒分散体进行离心，然后去除上清液并将沉淀物重新分散在乙醇中。最后将沉淀物超声分散于甲苯中。

有机硅烷功能化 CD 的合成

通过无水柠檬酸和 APTMS 的热解制备有机硅烷功能化的 CD。在典型的实验中，将 APTMS (10 mL) 加热到 185 °C，此时在剧烈搅拌下快速加入无水柠檬酸 (0.5 g)，并将所得混合物在 185 °C 下保持 1 分钟。此后，将溶液冷却至 25°C，通过使用石油醚 (× 5) 以 1:1 的体积比萃取来纯化获得的深绿色产物。提取液的下层是制备的有机硅烷官能化 CD。获得了大约 2 mL 的功能化 CD。

MIP 和 NIP 涂层双发射 CdSe@SiO2/CD 纳米杂化物的合成

将一部分新鲜制备的有机硅烷官能化 CD（10 微升）添加到含有 CdSe@SiO2（5 毫克）的甲苯（25 毫升）混合物中。在回流下在 113°C 下加热搅拌 12 小时后，将所得混合物离心，将含有 CdSe@SiO2/CD 纳米杂化物的沉淀物分散在乙醇 (2mL) 中，然后将 4-NP (0.2mg)添加。然后使系统在搅拌下在 25°C 下反应 2 小时。此后，将 TEOS (25 μL) 和氢氧化铵 (25 μL) 注入混合物中，使其在 25°C 下再反应 5 小时。最后，所得产物经过三个沉淀/离心循环并用乙醇洗涤以除去任何过量的反应物。将所得纳米杂化物分散在乙醇中以备进一步使用。

还使用非印迹聚合物涂层（NIP-coated）CdSe@SiO2/CD纳米杂化物进行了对照实验，这些纳米杂化物是使用上述方法制备的，但没有添加模板分子。

CdSe@SiO2/CD/MIP 和 CdSe@SiO2/CD/NIP 纳米杂化物对 4-NP 的吸附能力

在搅拌下将 4-NP (0.1 mg) 添加到 CdSe@SiO2/CD/MIP 和 CdSe@SiO2/CD/NIP 纳米杂化物 (1 mL, 1.5 mg/mL) 的单独溶液中。 120 分钟后，对溶液进行离心（12,000 rpm，15 分钟），并通过 400 nm 的 UV-vis 测量确定上清液中的 4-NP 浓度。然后使用方程计算 MIP 涂层和 NIP 涂层纳米杂化物的吸附容量（\（Q \））。 1.

其中 C 0 和 C t分别为吸附前后4-NP的浓度，V 是溶液的体积，W 是纳米杂化物的质量。

特征化

使用在 200 kV 加速电压下运行的 JEM-2100 透射电子显微镜（JEOL Ltd.，Akishima，Japan）进行高分辨率 TEM（HRTEM）。傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱在 Nicolet Magna IR-560 FTIR 光谱仪（Nicolet Co., Madison, WI, USA）上进行 20 次扫描，分辨率为 4 cm ^{- 1} .使用 Cary Eclipse 荧光分光光度计 (Agilent Technologies, Inc., USA) 在 1 cm × 1 cm 石英池中获得荧光测量值。 UV-vis 光谱在 TU-1810 系列分光光度计（浦肯野通用仪器有限公司，北京，中国）上使用具有 1.0 cm 光程的石英池进行。

4-NP 的荧光检测

向制备的 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米杂化物的乙醇溶液（1 mL，1.5 mg/mL）中加入另一份乙醇（2 mL）和所需量的 4-NP。溶液中 4-NP 的终浓度通过简单的计算得到。充分混合后，10 分钟后测量荧光强度，并在 350 nm 激发波长和 10 nm 激发/发射狭缝下记录荧光光谱。关于孵育时间，根据已报道的比率荧光探针[33, 34]工作中采用的孵育时间设置为10分钟。由于本工作使用超纯水代替缓冲溶液，本工作的检测pH值约为7.0，与报道的工作[10]中检测4-NP的优化工作pH值一致。

结果与讨论

在制备用于 4-NP 检测的比率荧光传感器之前，我们首先检查了各种材料的发射和吸收光谱。在检查 CdSe QD 和 CD（附加文件 1：图 S1）的发射光谱后，很明显这两种物质之间没有发生干扰，它们的发射最大值分别在 460 和 615 nm 处观察到。此外，观察到 4-NP 的吸收光谱和 CD 的发射光谱之间的重叠（附加文件 1：图 S2）表明 FRET 可能发生在这些物种之间，从而导致 CdSe@SiO2/ 455 nm 处的 CD/MIP 纳米杂化物。此外，CdSe QD 和 CD 表现出相当的最佳激发波长（即 350 nm），因此这些物种适合构建用于检测 4-NP 的比率荧光传感器。因此，CdSe QD 作为参考信号，而 CD 作为响应信号。因此，在CdSe QDs的荧光强度保持恒定的情况下，可以在4-NP猝灭CDs时检测到比率荧光响应。

用于制备分子印迹比率荧光传感器的合成路线在方案 1 中说明。最初，CdSe QD 使用改进的反微乳液法 [35] 用二氧化硅壳包被，以防止 CdSe QD 与外部溶剂并通过调整二氧化硅壳的厚度来控制 CdSe QD 和 CD 之间的距离 [36]。随后，获得的 CdSe@SiO2 QDs 用有机硅烷功能化的 CDs 装饰，以促进 CdSe@SiO2 和 CDs 通过硅氧键连接，并增强 CDs 与分子印迹二氧化硅基质之间的相互作用 [37 ]。这导致成功构建了所需的核壳结构双发射比率荧光纳米杂化物。此外，通过氨水溶液催化的 TEOS 溶胶-凝胶缩合反应，CdSe@SiO2/CD 纳米杂化物被二氧化硅印迹膜包裹 [38]。这种修改是必要的，以防止 CD 从基质中泄漏并保持对模板分子的优越渗透性 [37]。通过溶剂洗脱去除模板分子后，形状、大小和电子或氢键需求互补的空腔保留在基质中，从而确保选择性识别和与目标分子的协同结合 [39]。这最后一步产生了目标分子印迹双发射荧光传感器。

分子印迹聚合物包覆双发射CdSe@SiO2/CD纳米杂化物的制备过程示意图

CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米杂化物的制备和表征

在成功制备后，对所获得的 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米杂化物的形态结构和光学性质进行了详细研究。如图 1a、b 所示，CdSe QD 成功地封装在二氧化硅壳中。然而，在 CdSe@SiO2/CD 纳米粒子的 HRTEM 图像中无法观察到 CD（图 1c、d），因为制备的 CD 是无定形纳米粒子，没有明显的晶格条纹 [40, 41]。此外，图 1a-f 中显示的图像证实，所制备的 CdSe@SiO2、CdSe@SiO2/CD 和 CdSe@SiO2/CD/MIP 物质是均匀的球形纳米粒子，平均直径为 46.7 ± 2.5、53.6分别为 ± 2.7 和 66.4 ± 2.0 nm（附加文件 1：图 S3）。这种平均直径的增加与 CdSe@SiO2 纳米颗粒上 CD 和二氧化硅印迹膜的逐层沉积相吻合。在被二氧化硅印迹层封装后，CdSe@SiO2/CD 纳米杂化物的表面变得粗糙，这可能是由于该层的不均匀生长。由于溶胶-凝胶法是一种广泛使用的构建具有可调厚度的二氧化硅印迹膜的方法[42]，因此相应地确定制造的印迹层的厚度以促进 FRET 的发生。实际上，包含施主 (CD) 和受主 (4-NP) 的压印层测得 ~ 12.8 nm，足以让 FRET 轻松发生 FRET [43, 44]。

制备的混合纳米粒子的表征。 CdSe@SiO2 (a , b ), CdSe@SiO2/CD (c , d ), 和 CdSe@SiO2/CD/MIP (e , f ) 纳米粒子。和 FTIR 光谱 (g ）CdSe@SiO2（曲线A）、CdSe@SiO2/CDs（曲线B）、CdSe@SiO2/CDs/MIP（曲线C）和4-NP（曲线D）

为了确认每个阶段后化学改性成功，记录并比较了 CdSe@SiO2、CdSe@SiO2/CD 和 CdSe@SiO2/CD/MIP 产品的 FTIR 光谱。如图 1g 所示，所有三个 FTIR 光谱都在 1091 和 468 cm ^{− 1} 处显示了特征 SiO2 峰 ，分别对应于 Si-O-Si 的对称伸缩振动和 Si-O 的反对称伸缩振动。此外，与 CdSe@SiO2 的 FTIR 光谱相比，CdSe@SiO2/CD 纳米颗粒的 FTIR 光谱包含三个额外的峰，即 -C=ONR 在 1648 cm ^{− 1} 的伸缩振动 , C–H 在 2940 cm ^{− 1} 的伸缩振动 ，以及在 1400–1460 cm ^{− 1} 处的特征 –NH2 峰 ，源自氨基修饰的 SiO2 壳 [45]。此外，4-NP、CdSe@SiO2/CD 和 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米粒子的光谱比较证实 4-NP 压印是成功的，因为存在对应于面外弯曲的峰=C–H (860–800 cm ^{− 1} ) 和 –NO2 的不对称伸缩振动（1550 和 1300 cm ^{− 1} ) 在 4-NP 和 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米粒子的光谱中。

然后在去除模板分子之前和之后记录制备的 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米粒子的荧光发射光谱（图 2a），并且 CD 的荧光在 4-NP 存在下被显着淬灭。此外，通过洗涤和随后的洗脱去除模板分子后，CDs 的荧光得到恢复，并且在 350 nm 的激发波长下没有观察到与 CdSe QDs 的发射带重叠。可见，分子印迹的比率荧光传感器具有良好分辨的双发射特性，适用于4-NP的比率检测。

制备的混合纳米粒子的荧光。 一 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米粒子在去除模板分子之前（黑线）和之后（红线）和 b 的荧光发射光谱 在去除 4-NP 后，它们的光稳定性分散在乙醇中。 c CdSe@SiO2/CD/MIP 和 CdSe@SiO2/CD/NIP 纳米杂化物的吸附能力。 d CdSe@SiO2/CDs/MIP 和 CdSe@SiO2/CDs/NIP 分别与 4-NP 的荧光强度图。 （Fb0 和 Fb 代表 CdSe@SiO2/CDs/MIP 和 CdSe@SiO2/CDs/NIP 在 455 nm 处在不同量 4-NP 存在和不存在下的荧光强度）

然后通过以 2 分钟的间隔重复测量 CdSe@SiO2/CD/MIP 系统的荧光来评估传感器的荧光稳定性。如图 2b 所示，在 615 nm 处 120 分钟内没有观察到荧光强度的显着变化，从而表明探针的长期光稳定性 [46]。此外，CD 的荧光强度在 455 nm 处保留了其原始响应的> 95%，并且预计这种轻微降低不会对 4-NP 的测定产生显着影响。因此，这些结果表明分子印迹层有效地锚定在CdSe@SiO2/CD纳米颗粒的表面，并且CDs和CdSe QDs得到了很好的保护。

4-NP的特异性和选择性检测

为了研究 CdSe@SiO2/CD/MIP 和 CdSe@SiO2/CD/NIP 纳米杂化物的结合亲和力，使用 4-NP 模板进行了吸附测试。如图 2c 所示，CdSe@SiO2/CD/MIP 和 CdSe@SiO2/CD/NIP 对 4-NP 的吸附容量分别为 9.1 和 1.58 mg/g。分子印迹纳米杂化物的这种优异吸附能力可归因于在印迹过程中形成了 4-NP 特有的空腔。此外，CdSe@SiO2/CD/NIP 纳米杂化物的较差吸附能力可能是由于缺乏识别位点以及源自 4-NP 和表面 –NH2 基团之间氢键相互作用的非特异性吸附的主导作用造成的。有机硅烷功能化CDs的研究[8].

对于任何给定数量的 CD 供体，可以通过调整供体和受体之间的光谱重叠或通过在 10 nm 范围内调整供体周围受体的数量来控制荧光猝灭效率 [47]。在这种情况下，对于 CdSe@SiO2/CD/MIP 和 CdSe@SiO2/CD/NIP 纳米杂化物，FRET 可能发生在 CDs 和溶液中 4-NP 之间，距离 CDs 10 nm，这可能导致相当的淬火效率。然而，利用分子印迹层的优势，CdSe@SiO2/CD/MIP纳米杂化物的吸附能力得到有效提高（图2c）；因此，与 CdSe@SiO2/CD/NIP 纳米杂化物相比，在 CD 的 10 nm 范围内可以获得更多数量的 4-NP 分子，这使得 FRET 能够在更大程度上发生。因此，通过比较 CdSe@SiO2/CD/MIP 和 CdSe@SiO2/CD/NIP 与不同浓度 4-NP 的荧光响应，研究了分子印迹纳米杂化物的特殊识别。如图 2d 所示，随着 4-NP 浓度的增加，(F b0 -F b )/F b0 CdSe@SiO2/CD/MIP 和 CdSe@SiO2/CD/NIP（即荧光猝灭效率）均增加。在上面的表达式中，F b0 和 F b 代表 CdSe@SiO2/CD/MIP（或 CdSe@SiO2/CD/NIP）物质在 455 nm 处在不同浓度 4-NP [48] 存在和不存在下的荧光强度。此外，通过比较两条曲线的线性斜率（即猝灭常数），我们可以得出结论，模板分子对 CdSe@SiO2/CD/MIP 的荧光猝灭作用比 CdSe@SiO2/ CD/NIP 在相同的 4-NP 浓度下，进一步表明 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米杂化物对 4-NP 具有优异的特异性识别和结合亲和力 [9, 49]。

为了说明 CdSe@SiO2/CD/MIP 对 4-NP 模板分子的选择性，使用具有相似结构或光学特性的化合物（即苯酚、2-NP 和对苯二酚）进行了对照实验。如图 3 所示，荧光猝灭效率 ((F b0 -F b )/F b0 ) 的类似物比 4-NP 小，这可能是因为它们与 4-NP 相比具有不同的光学性质和化学结构 [9]。事实上，苯酚和氢醌的吸收光谱与 4-NP 显着不同，并且与 CD 的发射光谱没有重叠（数据未显示）。在 2-NP 的情况下，虽然其吸收光谱和化学性质与 4-NP 相似，但它与印迹 4-NP 位点的匹配不太完美，导致观察到的淬灭效率降低了三倍.这些结果表明本文制备的荧光传感器在类似物存在下对4-NP具有选择性，可进一步应用于4-NP的选择性检测。

制备的比率荧光探针的选择性。 CdSe@SiO2/CD/MIP 和 CdSe@SiO2/CD/NIP 纳米杂化物对 4-NP、苯酚、2-NP（2-硝基苯酚）和对苯二酚的 4.8 μg/mL 溶液的荧光响应

检测4-NP

最后，我们检查了添加不同数量的 4-NP 后 CdSe@SiO2/CD/MIP 荧光谱的变化。如图 4a 所示，455 nm 处的荧光强度对 4-NP 浓度高度敏感，随着 4-NP 浓度的增加而降低。此外，CdSe QDs 在 615 nm 处的荧光没有观察到明显变化，这表明封装在 SiO2 中的 CdSe QDs 适合用作参考信号。此外，如图 4b 所示，F 的图 b /F r 除了高相关系数 (R ² =0.985)。在这个表达式中，F b 和 F r 分别代表 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米杂化物在 455 和 615 nm 处的荧光强度。根据这些结果，检测限计算为 0.026 μg/mL (3δ/k )，这明显低于美国 EPA 规定的饮用水允许限值（即 60 ng/mL），从而表明我们的分子印迹比率荧光传感器具有实际应用的潜力。与之前报道的方法的线性范围和检测限相比（见表 1），很明显，在 4-NP 检测范围和检测限的背景下，我们的系统与报道的电化学和荧光方法相当或更好。此外，通过进一步量化和优化测定条件，如印迹层的厚度、CDs 与 CdSe QDs 的比例、模板与单体的比例、孵育时间、和 pH [10]。

4-NP的检测。 一 在 350 nm 激发波长下增加 4-NP 浓度获得的 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米杂化物的荧光光谱。 b 4-NP浓度对F比值的影响 r 到 F b 对于 MIP 涂层的 CdSe@SiO2/CD 纳米杂化物。采用 0.051、2.1、4.8、6.7、8.9、11.52 和 13.7 μg/mL 的 4-NP 浓度。 F b 和 F r 分别代表 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米杂化物在 455 和 615 nm 处的荧光强度

结论

总之，我们成功地制备了一种新型 4-硝基苯酚 (4-NP) 印迹核壳双发射（即比例）荧光传感器，用于灵敏和选择性检测 4-NP。这种新型传感器兼具比率荧光的高灵敏度和分子印迹聚合物 (MIP) 的高选择性。正如预期的那样，在 4-NP 存在下，碳点 (CD) 的荧光通过 4-NP 和光致发光 CD 之间的荧光共振能量转移 (FRET) 猝灭，而 CdSe 量子点的荧光强度存在于这一制度保持相对稳定。因此，该传感器被证明是可靠和快速检测 0.051 至 13.7 μg/mL 浓度范围内的 4-NP 的有效平台，检测限特别低，为 0.026 μg/mL。此外，所开发的 CdSe@SiO2/CD/MIP 纳米杂化传感器的简单性、可靠性、高选择性和高灵敏度证明 MIP 和比率荧光的组合允许制备用于检测痕量或超痕量分析物的荧光传感器.