金纳米颗粒调节人肝微粒体中睾酮代谢：尺寸、表面化学性质与蛋白质冠效应

摘要

金纳米颗粒-蛋白质冠复合物可通过改变理化性质，改变细胞色素P450（CYP）介导的睾酮（TST）代谢。本研究考察了纳米颗粒尺寸、表面化学性质及人血浆蛋白质冠（PC）对混合人肝微粒体（pHLM）中睾酮代谢的影响。研究了分别修饰支聚乙烯亚胺（BPEI）、硫辛酸（LA）或聚乙二醇（PEG）的20-40 nm和80 nm金纳米颗粒，包括裸露颗粒和带蛋白质冠的颗粒。在pHLM中，40 nm裸露AuNPs抑制了五种羟基化睾酮代谢产物的生成，而80 nm颗粒作用较弱。蛋白质冠在很大程度上减弱了这些抑制作用。有趣的是，裸露AuNPs增加了雄烯二酮的生成。在单供体HLM中观察到个体差异；大多数AuNPs在非抑制浓度下抑制睾酮代谢，而PC-PEG-AuNPs刺激雄烯二酮生成。这些发现凸显了AuNPs作为潜在内分泌干扰物通过调节睾酮代谢的作用，并为筛选其他纳米材料提供了框架。

引言

金纳米颗粒因其独特的光学和物理特性，广泛应用于药物递送、诊断和消费品（参考文献1-3）。暴露于生物流体时，AuNPs迅速吸附蛋白质形成蛋白质冠，改变表面化学性质、蛋白质构象及下游生物学反应，包括细胞毒性、细胞摄取和CYP酶活性（参考文献4-7）。体外研究显示AuNPs对人肝细胞、C3A肝癌细胞系和精子细胞有毒性（参考文献6-8），但蛋白质冠的存在可根据表面化学性质减弱或增强这些效应（参考文献6-7）。蛋白质冠形成还干扰各种细胞类型的细胞摄取，无论纳米颗粒尺寸或电荷如何（参考文献6-12）。

肝脏中的CYP酶代谢内源性和外源性化合物。多种药物、杀虫剂和纳米颗粒可干扰类固醇激素合成和代谢，导致生理功能改变（参考文献13-17）。睾酮（TST）是主要雄激素，也是CYP3A4的底物，后者将其羟基化为6β-OH-TST。CYP3A4进一步催化生成2β-OH-TST、15β-OH-TST、16α-OH-TST和16β-OH-TST，而CYP2D6通过去烷基化将睾酮转化为雄烯二酮（AD）（参考文献17, 19, 27）。先前研究表明，裸露和带蛋白质冠的AuNPs调节广谱CYP酶，包括CYP1A2、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4（参考文献6, 7, 20-21）。AgNPs也抑制HLM中CYP3A4活性（参考文献22）。BPEI和LA修饰的AuNPs降低C3A细胞中CYP3A4活性，但蛋白质冠减弱此效应（参考文献7）。体内研究显示，小尺寸AuNPs在肝脏和脾脏富集，改变肝脏Cyp1a1和Cyp2b表达（参考文献23）。基于这些发现，本研究探讨蛋白质冠如何影响AuNPs的尺寸、电荷和表面化学性质对pHLM和单供体HLM中CYP介导的睾酮代谢的影响。

材料与方法

化学试剂

睾酮、其代谢产物和¹³C₃标记睾酮购自MilliporeSigma（美国密苏里州圣路易斯）。其他试剂购自Steraloids或MilliporeSigma。LC-MS级溶剂购自Fisher Scientific；超纯水由Merck Synergy® UV-R系统制备。

人肝微粒体

混合HLM（pHLM，来自200名供体，100男100女）和单供体HLM购自Corning Inc.（美国北卡罗来纳州夏洛特）。供体特异性CYP活性详见补充表S1。

金纳米颗粒合成

购自nanoComposix的Biopure™ 40 nm和80 nm AuNPs，分别修饰BPEI、LA或PEG。核心合成采用K₂CO₃还原HAuCl₄·3H₂O，经老化和切向流过滤（TFF）。表面修饰：加入LA（0.2:1 w/w）或PEG（0.5:1 w/w），经TFF和无菌过滤。BPEI表面通过EDC/NHS化学将LA羧基与BPEI氨基连接制备；未结合BPEI经TFF和离心去除。

蛋白质冠制备

混合人血浆（n=5）与40 nm或80 nm AuNPs以55%血浆体积比在37°C振荡孵育（250 rpm，1 h）。PC-AuNPs经离心（20,000×g，20°C，20 min）收集，用PBS洗涤三次，重悬于PBS中供表征。

物理化学表征

动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）测量粒径、分散指数和Zeta电位。在去离子水、PBS和微粒体孵育缓冲液（pH 7.4）中，于0 min和45 min（37°C）测量。TEM样品在Tecnai G2 Spirit BioTWIN（120 kV）下观察。UV-Vis光谱用Spectra Max i3读数仪记录。

体外睾酮代谢实验

确认睾酮（10 µM）在1.3-9.3 mg/mL微粒体蛋白浓度下、60 min内线性代谢。pHLM与睾酮及不同浓度裸露或带PC的AuNPs（0-571 µg/mL）孵育。反应用或不含NADPH（0.25 mM NADP，2.5 mM葡萄糖-6-磷酸，2 U/mL脱氢酶）启动，37°C下45 min后用4%磷酸终止。上清经离心、-20°C保存，经LC-MS/MS处理。单供体HLM同法处理，AuNPs浓度10 µg/mL。

标准品与样品制备

一级标准品（1 mM）和内标（¹³C₃-TST）用甲醇配制。工作标准浓度0.01-200 µM。质控样品为0.01、0.05和0.1 µM。样品加内标，经Oasis PRIME HLB板提取、洗涤、洗脱、稀释，LC-MS/MS分析。

液相色谱-质谱分析

Waters UPLC HSS T3柱（2.1×50 mm，1.8 µm），流速600 µL/min。梯度：30% B至98% B，8.4 min。ESI+离子源，4000 V，150°C；解吸450°C。MRM转换见补充表S2。标准曲线0.001-20 µM。LOD和LOQ分别为0.001 µM和0.005 µM。

统计分析

学生t检验评估D_H和PDI差异。IC₅₀和EC₅₀用GraphPad Prism®的Hill方程计算。单因素方差分析配合Tukey HSD（p<0.05）评估AuNPs效应。Pearson相关分析CYP活性与代谢产物生成的关系。

结果与讨论

AuNPs理化性质

TEM证实除40 nm和80 nm PC-BPEI-AuNPs在PBS中显示聚集外，所有裸露和带PC的AuNPs均呈单分散。40 nm裸露BPEI-和LA-AuNPs及PC-PEG-AuNPs的D_H值在45 min内增加，而80 nm PC-LA-AuNPs减少。40 nm裸露和PC-PEG-AuNPs的PDI增加，裸露BPEI-AuNPs的Zeta电位随时间下降。这些变化与先前PC改变纳米颗粒尺寸、吸光度和形态的发现一致（参考文献6, 7, 10, 26）。

混合HLM中睾酮代谢

pHLM中检测到六种睾酮代谢产物（五种羟基化产物和AD）。裸露40 nm和80 nm AuNPs以剂量依赖方式抑制2β-OH-TST、6β-OH-TST和15β-OH-TST生成（IC₅₀：416-1113 µg/mL）。未抑制16α-或16β-OH-TST，除40 nm BPEI-AuNP在最高剂量轻微抑制16β-OH-TST。有趣的是，裸露AuNPs在高浓度下增加AD生成（40 nm BPEI-AuNP达4.3 pmol mg⁻¹ min⁻¹）。带PC的AuNPs基本消除这些抑制；PC也减弱了80 nm LA-AuNP对AD的刺激作用。总体而言，裸露AuNPs减少羟基化，有时增强去烷基化，蛋白质冠可减弱此效应。

单供体HLM个体差异

供体特异性CYP活性与代谢产物生成强相关：6β-OH-TST与CYP2C19（r=0.99, p=0.01）和CYP3A4（r=0.99, p=0.03）相关；AD与CYP4A11负相关（r=-0.98, p=0.04）。非抑制浓度下AuNPs在不同供体中差异性调节代谢产物，反映CYP多态性和表型（参考文献33）。尺寸、表面涂层和PC形成均显著影响代谢产物水平（p<0.0001）。例如，PC-PEG-AuNPs在供体HDC3中无论尺寸如何均激活AD生成。

结论

AuNPs，特别是裸露40 nm和80 nm颗粒，抑制混合HLM中睾酮羟基化并可刺激去烷基化。生物相关蛋白质冠的存在减弱这些效应，尤其是对阳离子BPEI-AuNPs。单供体HLM中，AuNPs效应取决于表面化学性质，随个体CYP活性变化，凸显AuNPs作为内分泌干扰物的潜力。这些结果为评估其他纳米材料对类固醇激素代谢的影响及识别易感亚群提供了框架。

数据与材料可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。

缩略语

11β-OH TST

11β-羟基睾酮

15β-OH TST

15β-羟基睾酮

16α-OH TST

16α-羟基睾酮

16β-OH TST

16β-羟基睾酮

2α-OH TST

2α-羟基睾酮

2β-OH TST

2β-羟基睾酮

6α-OH TST

6α-羟基睾酮

6β-OH TST

6β-羟基睾酮

AD

雄烯二酮

AgNP

银纳米颗粒

ANOVA

单因素方差分析

AuNP

金纳米颗粒

BPEI

支聚乙烯亚胺

CFS

氯吡硫磷

CYP

细胞色素P450

DEET

避蚊胺

D_H

流体动力学直径

DI

去离子水

DLS

动态光散射

EC₅₀

半最大激活浓度

EDC/NHS

1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺

ESI⁺

正电喷雾电离

HLM

人肝微粒体

HSD

Tukey诚实显著差异

IC₅₀

半最大抑制浓度

ISTD

内标

LA

硫辛酸

LC-MS/MS

液相色谱-串联质谱

LOD

检测限

LOQ

定量限

MRM

多反应监测

NADP

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸

NADPH

还原型NADP

naked

无蛋白质冠

NP

纳米颗粒

PBS

磷酸盐缓冲液

PC

人血浆蛋白质冠

PDI

多分散指数

PEG

聚乙二醇

pHLM

混合人肝微粒体

QC

质量控制

SWCNT

单壁碳纳米管

TEM

透射电子显微镜

TFF

切向流过滤

TiO₂

二氧化钛

TST

睾酮

UPLC TQD

超高效液相色谱-三重四极杆检测器