基于局部表面等离子体共振的金纳米生物传感器能够诊断人类布鲁氏菌病，介绍一种快速且经济的方法

介绍

布鲁氏菌是生长缓慢的革兰氏阴性球杆菌，属于布鲁氏菌科 [1]。布鲁氏菌包括兼性细胞内细菌，可感染多种家养和野生动物 [2]。近年来布鲁氏菌新种的发现极大地扩大了其属。目前该属共有十二种，其中四种包括布鲁氏菌属。羊驼 ，B。流产 ，B。猪 , 和 B.犬 是人类发病的主要原因[3]。 B.羊驼 被认为是人类中毒性最强的物种[3]。尽管布鲁氏菌病不会导致人死亡，只是人与人之间传播的一个特例，但世界范围内人类布鲁氏菌病的持续流行会导致严重的公共卫生问题和经济损失，从而导致动物生产力下降。重要的是，布鲁氏菌病在人类中的潜在弱化和该病复杂的治疗方案使这些细菌成为生物战的候选药物[4, 5]。

人类布鲁氏菌病被称为“错误疾病”[6]，因为它的临床表现是非特异性的，并且与许多其他疾病重叠；因此，诊断的实验室证实对于正确治疗患者至关重要 [7, 8]。虽然培养、血清学检测和核酸扩增检测可以诊断布鲁氏菌病，但这些方法有很多局限性。在培养中，作为金标准，延迟患者正确诊断和治疗的主要限制是潜伏期长。先进的自动化血培养系统（例如 Bactec 和 BacTAlert 系统）可以检测布鲁氏菌病的急性病例，但它们需要 5 至 7 天的孵育时间，甚至需要延长对长期样本进行盲传代培养的孵育和性能 [9]。缺乏特异性和假阳性结果，尤其是在反复接触布鲁氏菌的个体中，是血清学检测的主要局限性 [9, 10]。尽管它们通过核酸扩增测定法对疾病具有极好的敏感性、特异性、安全性和快速诊断，但由于患者长期坚持阳性生物分子检测结果，这些方法的临床重要性及其有限的治疗意义尚不清楚已完全恢复 [9, 11]。因此，有必要设计一种方法来克服上述所有测试的局限性，同时增强其优势。

具有低检测限的生物传感设备的改进已成为生物标志物检测研究的重要组成部分，因为在过去十年中，大量研究致力于寻找适当的程序来提高生物传感中不同检测平台的灵敏度 [12, 13] .生物传感器用于通过从包括生物成分的相互作用中产生信号来检测和量化分析物。最近，光学传感器灵敏度的提高与生物分子相互作用的无与伦比的特异性相结合，导致了许多不同的光学生物传感器的发展 [14]。由于应用的简便性、对低温的敏感性和可靠的信号生成（通过响应生物相互作用的吸收带红移证明），基于纳米粒子独特光学特性的测试对于检测生物标记物具有成本效益。 15,16,17]。这些检测方法使用分子的生物物理特性（如分子量、电荷和折光率）来监测特定分子的活性。表面等离子体共振是一种由表面电子在暴露于入射光后集体振荡引起的现象，该现象已被用于快速轻松地检测表面结合的生物分子 [18, 19]。 SPR 由两种主要方法组成，本地化 (LSPR) 或传播 (PSPR) [20, 21]。其中，基于局域表面等离子体的光学生物传感器因其巨大的应用潜力而得到了显着的发展[12, 22]。该技术来自导电纳米粒子的表面电子（比入射光波长短）与导带中入射光与表面电子相互作用时产生的光波之间的相互作用 [23, 24]。与其他类似平台相比，基于局部表面等离子体共振的生物传感器具有几个优点（例如，表面等离子体共振），例如具有更短的电磁场衰减长度，对由温度变化引起的体折射率变化不敏感或周围介质，以及被自由传播的光激发的能力 [12]。因此，在纳米生物传感器技术中，基于LSPR的纳米生物传感器被认为是检测生物分子最有力的工具之一。

总之，一方面，以实验室为基础的策略仍然是布鲁氏菌病诊断的主要依据。另一方面，当前的临床方法面临许多限制。因此，提出一种可以克服现有技术缺点的新替代方法被认为是治疗方案的主要组成部分之一。因此，本研究旨在引入一种快速、方便、廉价、安全且灵敏的基于 LSPR 的纳米生物传感器来检测生物样品中的抗布鲁氏菌抗体，以诊断布鲁氏菌病。为此，将牛羊和牛羊的脂多糖 (LPS) 包覆在金纳米粒子 (GNP) 上，并评估了该技术的特异性、敏感性、阳性预测值 (PPV) 和阴性预测值 (NPV)通过比较与血清培养测定所获得的结果。此外，目前的研究还进行了酶联免疫吸附测定来测量抗布鲁氏菌抗体（IgM 和 IgG）和标准试管凝集试验，以评估当前设计的技术与传统方法相比检测布鲁氏菌病的能力。

方法

细菌培养和 LPS 提取

B 的平滑应变。羊驼 和 B.流产 在Luria-Bertani培养 [3] 琼脂。在下一步中，收获细菌并使用改良的热酚水法提取 LPS [25]。为了确认提取的 LPS 的质量，应用了硝酸银染色的十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，Sigma-Aldrich，St. Louis，Missouri，USA）。使用 1,9-二甲基亚甲蓝（Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA）使用 鼠伤寒沙门氏菌 进行 LPS 定量 作为标准。为了评估蛋白质和核酸污染，使用了 Bradford 方法和 260 nm 处的吸光度。

球形金纳米粒子的合成

金盐 (HAuCl4) 的化学还原用于合成金纳米颗粒，这是一种在室温下快速、廉价和绿色合成金纳米颗粒的方法 [26]。根据所述方法，将 15 mg 柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，St. Louis，Missouri，USA）溶解在 50 ml 蒸馏去离子水中，并保持在冰浴中并在磁力搅拌器 (150 RPM) 上混合.同时，加入 600 µl 金盐溶液 (17.3 mM)。随后，添加 1.2 ml 硼氢化钠溶液 (20 mM)。在类似条件下将溶液混合 2 小时，然后保持在 4°C 以备后用。根据先前的研究，在这种类型的合成中，柠檬酸钠同时充当还原剂（驱动 AuIII 还原为 Au0）、封端剂（静电稳定金纳米粒子胶体溶液）和 pH 介体（改变 Au 的反应性）参与反应的物种）。在该测定中，从 HAuCl4 的黄色溶液生成红色溶液表明金的形成为零氧化态。

使用扫描电子显微镜 (SEM) 研究金纳米粒子的形态，并使用 Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK) 评估尺寸分布。散射角为 90º 的动态光散射 (DLS) 被用作测量粒径的基本原理。 Zetasizer Nano 使用波长为 633 纳米的激光。使用这种技术，可以测量由布朗运动引起的粒子的扩散，并通过斯托克斯-爱因斯坦关系将其转换为尺寸分布 [27]。还应用 Zeta 电位来确定纳米颗粒的表面电荷。纳米颗粒的吸收光谱由Cary 500 UVeviseNIR（紫外可见近红外）分光光度计（Varian，Australia）记录。

纳米探针（生物传感器）的构建

金纳米粒子的羧化

金纳米粒子涂有巯基乙酸接头，用于制备 GNP 表面以装载 LPS。简而言之，将 1 ml TGA 溶液 (1 mM) 与 1 ml 金纳米颗粒溶液混合并在室温下保持 24 小时。为了分离涂覆的金纳米颗粒，将溶液以 12,000 g 离心 15 分钟。之后，使用双蒸去离子水进行两次洗涤以去除多余的 TGA。最后，采用分光光度法对GNPs表面巯基乙酸的包覆情况进行评估。

优化金纳米颗粒上的硫乙醇酸涂层

TGA 的涂覆在不同时间完成，包括 12、18、24、36 和 48 小时，以优化 TGA 在金纳米颗粒上的涂覆率。随后，测量光密度并绘图以获得最佳孵育时间。

LPS 与 TGA 改性金纳米颗粒的共价连接

为了刺激 TGA 的羧基和 LPS 的胺基之间的共价连接，羧基被 EDC（最流行的生化偶联零长度交联剂）和 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 分子激活 [28]。沉淀的金纳米粒子悬浮在 0.1 mM EDC/NHS 溶液中，并在室温下孵育 30 分钟。在下一步中，添加 2 ml 含有 0.05% Tween-20 (PBST) (pH 7.4) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。剧烈涡旋后，将纳米颗粒以 12,000 RPM 离心 15 分钟。离心后，除去上清液后加入LPS溶液。随后，将混合物在超声波浴中孵育 10 分钟，然后在室温下孵育 3 小时。之后，加入 2 ml PBST 并剧烈涡旋，然后以 12,000 RPM 离心 15 分钟，去除上清液。最后，然后将纳米探针重新悬浮在 500 µl PBS 中，并通过分光光度计测量 LSPR 光谱。在确认 LPS 附着在金纳米粒子上后，将溶液保持在 4°C 以进行进一步研究。图 1 显示了 TGA 修饰的金纳米粒子合成和 LPS 附着的化学相互作用方程。

LPS 附着在金纳米颗粒上的化学相互作用。 A TGA 分子，B EDC + NHS相互作用，和C LPS 与 TGA 修饰的金纳米粒子的共价连接。数字 1：纳米颗粒； 2号：LPS

优化 LPS 浓度

为了最大限度地提高 LPS 与活化的 TGA 羧基的结合，通过评估作为 LPS 浓度（100、150、200、300 和 560 µg /ml) 在一定量的金纳米粒子中。

纳米探针检测抗 LPS 抗体

将 100 µl 稀释样品（在 PBS 中 1:50）与 200 µl 生物传感器混合并通过移液混合。在下一步中，在室温下孵育 30 分钟后，将生物传感器以 12,000 g 离心 15 分钟。最后，将生物传感器悬浮在 200 µl PBS 中，并如前所述测量吸光度。为了验证纳米生物传感器的功能，还从市售的 ELISA 试剂盒（Pishtazteb Zaman，Iran）中提供了阳性和阴性对照。

道德声明

人类血清的使用得到了伊朗法萨法萨医科大学伦理委员会的批准 (IR.FUMS.1396.324)。血清捐献者的身份被编码并且没有透露给参与这项研究的任何人。此外，所有程序均按照国家法规的道德准则进行。此外，所有样本均来自签署书面知情同意书的受试者。

评估设计方法的功能

提供了包含 20 个病例（真阳性）和 20 个对照（真阴性）的 40 个样本来评估设计方法的功能。因此，将本研究中设计方法的性能与培养结果进行了比较。此外，可用的商业试剂盒（Pishtaz Teb，德黑兰，伊朗）用于评估 IgM 和 IgG 抗体的血清水平。根据制造商的方案（特异性：99.85%，灵敏度：99.4%）进行样品制备和抗体评估。此外，还对所有血清样品进行了标准管凝集试验，以与基于 LSPR 的方法进行比较并验证其性能。为了评估设计方法的性能，将基于 LSPR 的方法获得的结果与上述常规测试进行比较，并根据以下常用公式计算灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值：

统计分析

通过评估建议的测试、LSPR 纳米传感器和参考标准测试、培养和一些常规测试（包括 ELISA 和 SAT）的一致性，将本研究作为经典的诊断性能实验进行分析，以确定它们识别目标疾病的能力.通过对照（真阴性）血清的平均值加上两次标准偏差值（2SD）计算截止值。执行 Kolmogorov-Smirnov 检验以确定正态性并评估数据分布。基于揭示参数分布的正态性结果，使用方差分析检验来比较组。所有统计分析均使用 GraphPad Prism for windows version 8 和 SPSS for windows version 9 进行。

结果

脂多糖提取分析

SDS-PAGE 显示 LPS 提取的产量约为所用细菌湿重的 1%。此外，核酸浓度为LPS浓度的 ≤ 0.2%。重要的是，布拉德福德方法证明没有任何蛋白质污染。

金纳米粒子的表征

纳米颗粒的尺寸分布决定了生物传感器的质量。根据之前的研究，纳米粒子必须具有特定的尺寸。在这方面，纳米颗粒的适当小尺寸导致合适的胶体稳定性、高表面积与体积比以及高结合率的快速移动导致与生物靶标相互作用的高亲和力、高灵敏度和高选择性。此外，纳米颗粒必须尽可能大，以允许颗粒表面存在各种配体并获得多价相互作用 [29,30,31]。正如顾等人。据报道，纳米颗粒大小与生物靶点大小的可比性在蛋白质相互作用中尤为重要[32]。根据抗布鲁氏菌抗体的大小为 2-5 nm [33]，本研究制备了平均大小为 10 nm 的金纳米粒子，并通过 Zetasizer NanoZS90 仪器进行了纳米粒子尺寸分布的测定，该仪器使用了波长为 633 nm 的激光。该技术受益于 Stokes-Einstein 方程，该方程可以将布朗运动引起的粒子扩散转化为尺寸分布。根据图 2，GNP 以 10 纳米的尺度均匀分布。 Zeta 电位值揭示了有关 GNP 的表面电荷和稳定性的详细信息。颗粒带负电，它们的 zeta 电位约为 - 28 mV。此外，表 1 显示了 GNP 的最大吸收波长。用分光光度计测量可见光和紫外波长，最大吸光度为 530 nm。我们使用 Turkevich 方法生产金纳米粒子。该方法的优点是制备金纳米粒子，其生产工艺简单、成本低廉，能够控制纳米粒子的尺寸，胶体稳定性合适[34]。

SEM下金纳米粒子的结构。金纳米粒子的均匀分布在图中得到了很好的体现

纳米生物探针的表征

如上所述，这项研究使用 TGA 分子将金纳米粒子与 LPS 连接，导致 530 nm 处的 LSPR 峰值略微下降 4.55%。此外，本研究进行了多次孵育，以确定对金纳米粒子的最大 TGA 粘附。根据图 3 所示的结果，TGA 与 GNP 孵育 24 小时导致金纳米粒子表面的 TGA 涂层最大。

优化金纳米粒子上巯基乙酸的涂层。如图所示，尽管相邻时间延长，但孵育 24 小时后吸光度没有显着变化。因此，选择 24 小时作为在 GNP 上包被巯基乙酸的最佳时间。 Y - 轴显示 530 nm 处的吸光度强度（纳米颗粒的最大吸光度）。实验一式三份进行。数据表示为平均值 ± SEM。 a.u.：吸光度单位

关于 LPS 优化浓度的确定，本研究调查了 100、150、200、300 和 560 ug/ml 的浓度。如图 4 所示，随着浓度的增加，吸光度降低。结果表明，本研究选择300 ug/ml浓度的LPS包覆TGA修饰的GNPs表面，增加LPS浓度后吸收峰强度没有明显降低。

优化 LPS 浓度。随着LPS浓度的增加，吸光度显着降低。然而，当 LPS 浓度增加超过 300 毫克/毫升时，LSPR 吸光度没有显着降低。因此，选择上述浓度作为优化浓度。 Y - 轴显示 530 nm 处的吸光度强度（纳米颗粒的最大吸光度）。实验一式三份进行。数据表示为平均值 ± SEM。 a.u.：吸光度单位

纳米生物探针功能的评估

由于 LSPR 技术是一种表面敏感的光学方法，它可以通过抗体与金纳米粒子之间的静电相互作用引起的 LSPR 吸收峰变化的图像来检测抗 LPS 抗体与金纳米粒子表面抗原之间的相互作用。抗原。为了确认生物传感器的正确功能，本研究制备了由滴度为 1:80 的抗布鲁氏菌 LPS 抗体和阴性对照组成的阳性对照，并在与对照孵育后记录了生物传感器的 LSPR 谱。如图 5 所示，与阴性对照孵育不影响 LSPR 的吸光度。然而，与阳性对照孵育会导致 LSPR 最大吸光度发生变化，以前称为红移。因此，抗布鲁氏菌抗体与LPS抗原的结合限制了光在纳米探针表面的发生率。

存在阳性和阴性对照时 LSPR 纳米探针的峰值。对照由市售ELISA试剂盒提供

确定截止值

为此，本研究根据培养和临床观察从真阳性和阴性受试者中获得了 40 份血清。如图 6 所示，真阴性样本（对照）的红移平均值为 1.70 nm，与真阳性患者显着不同（P 值 <0.001）。此外，结果表明 4.38 nm 的红移应用作截止值。有趣的是，只有5%的对照出现红移高于临界值，所有患者的红移均高于临界值，表明该方法的性能是可以接受的，临界值的确定是可靠的。

真正患者和对照受试者血清中的 LSPR 峰值红移。在感染个体血清中出现的抗体之间发生相互作用时，发生了与对照相比显着不同的红移。此外，该图展示了对于定义截止点非常重要的 SD 和 2SD 值。每个样品一式三份进行实验。 P 值 <0.05 被认为是显着的

生物传感器功能验证

在前面的步骤中，本研究引入了一种快速且廉价的方法来识别样品中的抗布鲁氏菌抗体。然而，验证新方法的功能是必要的。为此，本研究根据培养结果对阴性和阳性样品的血清中的标准管凝集试验、抗IgG和抗IgM水平进行了一系列子研究。如表 2 所示，当前方法的灵敏度低于单独使用 SAT 的灵敏度。重要的是，基于 LSPR 的方法的特异性显示出最可接受的结果，为 100%。与特异性相似，当前方法的阳性预测值高于其他常规测试（100%）。最终，基于SAT、IgG、IgM和LSPR方法的NPV分别为90%、90%、81%和86%。

讨论

布鲁氏菌病可能被认为是牛、绵羊和山羊驯化后的第一种人类感染[35]。布鲁氏菌病是世界上最普遍的细菌性人畜共患病，全球每年诊断出 500,000 例新的人类疾病病例 [9, 36]。人类布鲁氏菌病的症状并不具有特异性，因为感染可能会影响身体的任何器官 [37]。尽管实验室检查结果仍然是疾病检测的可靠因素，但目前包括培养、血清学和核酸扩增检测在内的策略存在严重缺陷[9, 38,39,40]。因此，本研究试图引入一种新的基于LSPR的诊断方法，以消除其局限性。

近年来，局域表面等离子体共振已被用作生物传感器发展的基础。目前对金纳米粒子的研究优势和纳米技术的进步被认为是提高诊断性能的主要因素。 GNPs 独特的颜色和光学性质，由于其等离子体和可调效应，是这些颗粒与其他颗粒相比的两个突出和有益的特性 [12, 41]。

在这项研究中，LSPR 峰的红移被用作 LPS 抗原和抗布鲁氏菌抗体之间相互作用的指标。换句话说，与对照样品相比，病例样品血清中抗体的存在导致 LSPR 吸收峰显着红移，这可以被认为是布鲁氏菌病的指标。尽管对照样本和病例样本之间的红移存在显着差异，但这种差异无法量化血清中抗体的浓度，这可以被认为是该方法的严重局限性之一。但是，我们必须记住，一些常用方法，例如 ELISA 相关策略，通常被视为一个分界点 [42, 43]。

重要的是，这项研究通过评估各种参数将获得的结果与其他当前方法进行比较，从而验证了基于 LSPR 的技术的性能。第一个分析的参数是敏感性，它决定了患者布鲁氏菌病检测呈阳性的概率 [44]。正如 Yagupsky 等人。已经讨论过 [9]，被认为是当前金标准的血培养的敏感性降低，尤其是在慢性疾病和局部感染中。此外，这种方法还面临着其他严重的局限性，如实验室安全问题、细菌生长缓慢，而阳性结果是该病无可争辩的证据[45, 46]。与传统方法（如培养、SAT 和 ELISA 依赖性试剂盒）相比，这种基于 LSPR 的技术代表了可靠且具有竞争力的结果。同时，评估了特异性，即如果患者未感染，则检测结果为阴性的可能性 [45, 47]。 As results showed, compared to the other diagnostic strategy, the designed LSPR-based technique had the most significant outcome in terms of specificity. It is an important characteristic of this method because the previous studies had questioned the validity and specificity of serodiagnostic methods of human brucellosis since asymptomatic and self-limiting episodes of this infection occur in zoonosis endemicity areas [48,49,50]. However, like antibody-related methods, the current method resists the possible long-term persistence of anti-Brucella antibodies within the serum, even after complete recovery from brucellosis.

Similar to previous studies, positive predictive value was defined as the ratio of the true positive results to the sum of all positive results [51]. Similarly, the NPV was described as the ratio of the true negative results to the sum of all negative results [51]. Compared to conventional diagnostic strategies, the current designed method represented the most wonderful PPV outcomes, demonstrating its ability to distinguish between infected and non-infected individuals. In addition, the evaluation of the NPV results revealed the promising potential of the LSPR-based method to exclude non-patients from real patients.

结论

This study introduced a rapid, simple, low cost, reliable, and economical method for diagnosing brucellosis. Although there are some minor limitations, including the qualitative outcomes and the possibility of being positive in recovered individuals, the advantages discussed show that it has good capabilities compared to the current laboratory-based diagnostic procedures.

数据和材料的可用性

当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求向相应作者索取。

缩写

LPS:

Lipopolysaccharides

GNPs:

Gold nanoparticles

DLS:

Dynamic light scattering

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

SAT:

Standard tube agglutination test

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

PPV:

Positive predictive value

NPV:

Negative predictive value

PSPR:

Propagating surface plasmon resonance

SDS-PAGE:

Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis

SEM：

Scanning electron microscopy

TGA:

Thioglycolic acid

NHS:

N-hydroxysuccinimide

EDC:

N -(3-dimethylaminopropyl)-N ′-ethylcarbodiimide hydrochloride

PBS:

Phosphate buffer saline