圆形金纳米粒子：粒径和浓度对拟南芥根系生长的影响

背景

如今，现代化学和工程制造了大量纳米物体，以提高物质的实用性，不仅在特殊应用中，而且在日常消费产品中也越来越多。纳米结构材料，即纳米颗粒 [1, 2]、纳米棒 [3]、纳米管 [4]、非织造纳米织物 [5]，当它们站立或附着在不同类型的载体上时，在几乎所有工业应用领域都显着提高了产量从化妆品 [6] 和医疗保健 [7]，到生物工程 [8, 9]，再到能量转换应用 [10] 和催化剂 [3]。虽然在这些产品中加入纳米材料可以提高它们的性能，但它们在使用寿命结束时的分解为合成 NP 进入环境提供了几个关键点。特别是工程化的 NPs，已广泛用于催化剂、紫外线防护染料稳定剂、纺织工业中的抗菌剂或保健品和化妆品（特别是金、银、铂和钯等高化学惰性的纳米粒子）必须应特别注意，因为它们可能在环境中积累多年几乎没有变化，从而在植物吸收时触发迄今为止未知的过程。关于贵金属纳米粒子 (NMNPs)，关于银纳米粒子 (AgNPs) 对水芹（Arabidopsis thaliana）幼苗的影响已经发表了一些开创性的工作。 )，表明非常低浓度的 AgNPs (<1 ppm) 可能对幼苗有毒 [11]。 20 到 80 nm 的 AgNPs 明显阻碍了生长，它们的植物毒性取决于浓度和粒径。当初级根暴露于 AgNPs 时，观察到根尖（帽和小柱）变成浅棕色。棕色尖端归因于 AgNPs 本身或与细胞壁材料或根尖产生的次生代谢物的吸附。但具体机制尚未阐明。

尽管已经有一些研究解决了 NPs 在环境中的作用 [12]，但那些针对金纳米粒子 (AuNPs) 的研究仍然很少见 [13]。如果可用，大多数已发表的纳米毒理学数据都集中在哺乳动物细胞毒性 [14,15,16] 或对动物和细菌的影响 [17,18,19,20]，只有少数研究考虑了工程化的毒性NPs 到植物。此外，到目前为止，NMNPs 与植物和其他与植物细胞具有相似性的生物体（如藻类）的相互作用研究很少，这意味着 NMNPs 暴露对植物细胞的一般后果仍不清楚 [11]。缺乏这些数据导致对NMNPs如何在不同食物链层次中的转移和积累的理解存在缺陷。

在这项工作中，我们报告了金纳米粒子对植物生长的影响，特别是对 A 的初级和侧根发育的影响。拟南芥 存在不同大小的颗粒时。 AuNPs 是在生物友好的协议下通过湿法合成的，不使用稳定剂，生产球形纳米颗粒，精确控制其尺寸和尺寸分布。在植物处理之前，AuNPs 已通过广泛的分析方法（AAS、ICP-MS、DLS 和 TEM）进行彻底表征。

实验

材料、仪器和程序

金纳米粒子是由 Batús 等人发表的稍微修改过的程序合成的。 [20]。简而言之，将 149 mL 水在 250 mL 双颈圆底烧瓶中加热，直到它开始回流。然后，随后加入 1 mL 0.33 M 柠檬酸钠和 0.945 mL 10 mg/mL 四氯金酸 (III) 钾水溶液。 30分钟后，停止加热，让反应混合物冷却。在所有制备实验中，均使用 Milli-Q 水（25°C 时为 18.2 MΩ）。

用于A 的根分析。拟南芥 , 合成的三种不同尺寸（10、14 和 18 nm）的 AuNP 以 5000g 离心 1 小时，将颗粒浓度提高到 2000 毫克/升的极限值。

A.拟南芥 哥伦比亚 (Col-0) 种子（从美国 Lehle 种子获得）用 30% (v /v ) 漂白溶液 10 分钟，然后用无菌水冲洗 5 次。将无菌种子播种在含有 1/2 Murashige-Skoog (MS) 培养基和 1% 植物琼脂 (pH 5.8) 的琼脂平板上。为了同步种子萌发，琼脂平板在 4°C 下保持 2 天。 A.拟南芥 植物在垂直方向的平板中在 22°C 的生长室中生长 5 天，浓度为 100 μmol m ^{- 2} s ^{− 1} 长日条件下的光照强度（16 小时/8 小时光/暗循环）。

将 5 天大的类似大小的幼苗转移到含有 1/16 MS 培养基、不同浓度的 AuNP（0、1、10 和 100 毫克/升）和 1% 植物琼脂的琼脂平板（每平板 20 株）中（ pH 值 5.8）。高压灭菌后将 AuNP 添加到培养基中。作为对照，还研究了柠檬酸钠缓冲液的作用。标记根的长度，并在接下来的 5 天内种植幼苗。主根和侧根长度增量均采用JMicroVision 1.2.7软件测量。

分析方法

制备的AuNPs溶液通过原子吸收光谱(AAS)、质谱电感耦合等离子体(ICP-MS)、动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征。

制备的 NP 的浓度通过 VarianAA880 设备（Varian Inc.，USA）使用 AAS 测定，使用 242.8 nm 波长的火焰雾化器。该方法测定的典型浓度不确定度小于3%。

使用连接到自动进样器的 Agilent 8800 三重四极杆质谱仪（安捷伦科技公司，日本），使用带有质谱检测器 (ICP-MS) 的电感耦合等离子体来确定源自未反应的 Au 源化学品的 Au 离子的浓度。将 AuNPs 胶体溶液移入 1.5 mL 疏水微管中并以 30000g 离心 在 Eppendorf 5430 离心机上离心 1 小时。离心后，使用移液器和 ICP-MS 分析小心去除 0.3 mL 上清液。使用配备蠕动泵的 MicroMist 装置进行样品雾化。纯缓冲溶液（2.2 mM 柠檬酸钠）用作空白样品。测量的不确定度小于3%。

TEM 图像使用 JEOL JEM-1010（JEOL Ltd.，日本）在 400 kV 下操作测量。将一滴胶体溶液放在滤纸上涂有无定形碳薄膜的铜网格上。除去过量的溶剂。在将样品放置在样品架上之前，将样品风干并在干燥器中保持在真空下。粒径由TEM显微照片测量并通过考虑至少500个颗粒计算。

粒度分布由 Zetasizer ZS90 (Malvern Instruments Ltd., England) 在粒度分布的 DLS 方案中测定，配备有用于信号检测的雪崩光电二极管。二极管泵浦固态激光器（50 mW，532 nm）用作光源。测量在室温下在聚苯乙烯比色皿中进行。

结果与讨论

纳米粒子表征

AuNP 的尺寸和尺寸分布由 TEM 和 DLS 分析确定。结果汇总在表 1 中，以及在 NPs 合成后立即通过 AAS 确定的 AuNP 浓度和通过 ICP-MS 确定的残留 Au 离子浓度。从这些数据中可以明显看出，我们的合成方案提供了尺寸分布非常窄的尺寸控制良好的 Au 纳米颗粒。在这里，我们使用了 Batús 等人发表的改进方法。 [20] 用于合成尺寸和形状控制的柠檬酸盐稳定的 AuNP。开发的协议允许基于通过表面催化还原 Au ³⁺ 扩大预先合成的 AuNPs 的目标尺寸扩展 同时有效抑制二次成核。

王等人。 [21] 发现在 A 的 3 天水培暴露期间。拟南芥 到 Ag ⁺ 和 AgNPs (5 nm) 在相同浓度下，Ag ⁺ 中的 Ag 浓度下降得更快 -处理的溶液比在 AgNP 中的溶液，表明 Ag ⁺ 的吸收更快 离子。因此，我们特别注意尽量减少 Au 离子对结果失真的可能影响。将合成的 AuNP 离心至极限浓度 2000 毫克/升，并用 MS 培养基稀释至所需浓度（1、10 和 100 毫克/升）。在此程序之后，通过 ICP-MS 确定含有 100 mg/L AuNP 的溶液中残留 Au 离子的浓度（见表 1）。显然，离心对残留金离子的存在（与合成溶液（表 1，AAS）相比浓度降低了两个数量级）和柠檬酸盐缓冲液本身的含量都有积极影响。

为了量化 NP 多分散性，我们进行了 DLS 测量，该测量对最终形成的颗粒聚集体的存在非常敏感（图 1）。在该测量中，即使是少量聚集的 NPs 也会导致相应峰在相当高的直径处占主导地位，尤其是在强度加权尺寸分布中（见图 1 中的插图）。幸运的是，没有检测到颗粒团聚，因此，尺寸评估的可信度可能仅受球形近似值的影响 [22]。尽管有这个缺点，但与 TEM 相比，DLS 测量提供了统计上更显着的粒度分布整体图，因为它一次评估了整个样品体积。由于制备的 NP 主要为圆形（见图 2），DLS 衍生的尺寸与 TEM 获得的尺寸非常一致（表 1）。在 TEM 图像（图 2，10 nm）中可见的明显颗粒团聚体更有可能是由 TEM 测量中去除溶剂的必要性引起的，而不是胶体溶液本身中单个颗粒的互连。

不同尺寸 AuNPs 水溶液的动态光散射分析（数字加权尺寸分布）。插图显示“原始”强度加权数据。数字是指平均粒径，单位为nm

制备的一组 AuNP 的 TEM 图像。请注意，图片放大倍数因特定 NP 尺寸而异

适应植物生物学条件的纳米粒子溶液

由于 AuNPs 在植物生长培养基（MS 培养基）中的强烈聚集趋势，常用于植物体外生长 [23]，我们必须优化这两种组分的相互比例以避免 NPs 聚集，同时保持植物生长的可接受条件。测试了不同稀释度的 MS。 AuNPs 的聚集很容易通过颜色的变化（从红色到紫色的转变）可见。由于合成的 AuNP 的初始浓度较低（约 30 毫克/升，见表 1），不足以进行生物实验，因此有必要通过离心来增加 NP 浓度。通过此程序，我们将粒子浓度提高到 2000 毫克/升的极限值。然后将此类 NPs 溶液稀释至最终浓度，这也降低了我们实验中柠檬酸盐缓冲液的浓度。用于A 的生长实验。拟南芥 ，我们在 1/16 MS 培养基中稀释 AuNP。在这种培养基中可检测到最小的 NPs 聚集，与 1/2 MS、1/4 MS 和 1/8 MS 相比，NPs 更加稳定，植物生长几乎没有改变。 AuNPs 在最终溶液中的浓度由 AAS 确定。由于植物生长实验是在体外（在无菌条件下）进行的，因此也研究了灭菌程序对 NPs 的影响。常用的高压灭菌（121°C，20 分钟）制备的生长培养基会导致所研究的 NP 完全聚集。因此，这个程序不适合我们的实验。最终将NPs加入约60°C的高压灭菌琼脂培养基中作为替代程序，其中未检测到NP聚集并且灭菌过程仍然有效。

纳米颗粒对拟南芥根系生长的影响 体外

模式植物，如双子叶植物 A。拟南芥 有可能帮助了解降低全球作物产量的胁迫因素，目的是确定可以提高胁迫条件下生存能力的基因 [24]。所有测试形式的 AuNPs 对侧根 (LRs) 都有显着影响。在 AuNP 处理的植物中，LR 的长度（图 3a）和数量（图 3b）都减少了。所有研究的粒径的 AuNP 的最高浓度 (100 mg/L) 导致 LR 长度减少至约 50%。在 18 nm AuNP 和最高浓度 (100 mg/L) 的情况下，LR 的数量减少到约 70%。当使用最高浓度的较小 AuNP（14 和 10 nm）时，观察到 LR 数量的减少略小（图 3b）。 AuNP 处理后初生根的长度也减少了（图 3c）。 10-nm AuNP 的负面影响是相当大的，尤其是在较高的颗粒浓度下。较大颗粒（14、18 nm）的影响要小得多，与用作对照的柠檬酸钠缓冲液的影响相似。大多数已发表的工程 NP 研究表明具有一定程度的植物毒性，尤其是在高 NP 浓度下。例如，柠檬酸盐包覆的 AgNPs 抑制了 A。拟南芥 2 周后幼苗根伸长率呈线性剂量反应，从 67 到 535 μg/L [25]。使用根伸长和种子萌发试验的其他几项研究表明，植物毒性受 NP 大小的影响。许多研究得出的结论是，纳米颗粒越小，它们的植物毒性就越大。然而，这种关于工程纳米材料的尺寸依赖性毒性的概括并不总是适用于植物和 NPs 类型的所有组合 [21, 25]。与此相反，单壁碳纳米管在 24 至 48 小时内对番茄、卷心菜、胡萝卜和生菜的根伸长产生积极影响 [26]。 Kumar 等人报道了 24 nm AuNPs 对种子发芽率和营养生长的积极影响。 [13].

AuNPs对a的影响 长度和 b 侧根数和c A 的主根伸长。拟南芥 幼苗。植物暴露于不同浓度（0.1、10 和 100 毫克/升）的 10、14 和 18 纳米 AuNP。数据是 19-20 株植物的平均值 + SD。 *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001； t 测试

在根生长实验中观察到 10 nm AuNP 对根毛生长的显着积极影响（图 4）。这种效果表现出强烈的浓度依赖性。增加 NP 浓度诱导更明显的根毛生长（图 4e）。在贫磷土壤中生长的根中经常观察到这种行为 [27]。在 14 和 18 nm AuNP 的情况下没有观察到类似的效果。与此相反，García-Sánchez 等人。 [28] 观察到，在 A 期间。拟南芥 用市售的 AgNPs 处理，抑制与 1 cm 植物根相关的许多根毛。使用 200 毫克/升的统一浓度处理溶液，在所有测试颗粒的情况下都观察到发根减少，无论它们的具体大小（10、20、40 和 80 纳米）如何。根毛大大增加了与土壤接触的根表面积，进入植物的大部分水分和养分通过它们被吸收。因此，它们的发育受到环境刺激和应激信号的显着影响[29]。

不同浓度的 10 nm AuNPs 对 A 中根毛生长的影响。拟南芥 幼苗。 一 控制，b –d 分别用 1、10 和 100 毫克/升 AuNP 处理的幼苗，以及 e 暴露于 100 mg/L AuNP 的植物诱导根毛生长的细节。比例尺对应于 1 cm

结论

我们已经通过在水环境中温和的双组分（柠檬酸钠 - 四氯金酸钾）还原成功制备了金纳米粒子，提供圆形、窄分布的粒子，并能很好地控制其最终尺寸。合成后离心可以达到所需的 NPs 浓度，并消除了离子和柠檬酸盐缓冲液对植物实验结果失真的影响。不同尺寸（直径为 10、14 和 18 纳米）和浓度（1、10 和 100 毫克/升）的 AuNP 对 A 根生长的影响。拟南芥 被调查。用更高颗粒浓度的 NPs 溶液处理后，侧根的数量和长度显着减少，无论它们的具体尺寸如何。在 10 nm AuNP 的情况下，观察到对初级根生长的负面影响。令人惊讶的是，最小的 AuNP（10 nm）明显诱导了根毛生长。总的来说，这项研究表明，植物直接暴露于 AuNPs 会显着导致植物毒性，并强调需要以生态负责任的方式处理含有 Au 纳米颗粒的废物和污泥。

缩写

AAS：

原子吸收光谱

AgNPs：

银纳米粒子

AuNPs：

金纳米粒子

DLS：

动态光散射

ICP-MS：

电感耦合等离子体质谱仪

LR：

侧根

MS：

村重和斯库格

NMNP：

贵金属纳米粒子

NP：

纳米粒子

TEM：

透射电子显微镜