桔梗皂苷（桔梗）用于金和银纳米颗粒的绿色合成

背景

随着可持续性问题的日益增加，绿色化学已成为许多研究领域的焦点。由于这些方法的可持续性，在金属纳米粒子 (MNP) 的合成中使用天然产物引起了相当大的兴趣。 MNP 已在材料化学、生物学和医学中显示出多种应用 [1,2,3,4]。 MNPs通常通过金属离子还原反应通过化学方法合成。化学还原反应通常需要有毒和有毒化学品，例如硼氢化钠，以合成 MNP。目前，天然产物可以替代有毒化学品的使用，并具有以下优势： (i) 合成过程减少了有毒化学废物； (ii) 绿色合成战略保护我们的健康和全球环境； (iii) 该战略实现了整体的可持续举措； (iv) 通过结合两种材料（天然产物和 MNPs）的协同活性可以预期增加的生物相容性，这对体外和体内系统非常有益； (v) 该战略具有成本效益且易于扩大规模；最后，(vi)绿色合成过程可以通过一锅反应进行。

AuNPs已广泛应用于催化、药物递送、化学和生物传感、成像、光热疗法和光动力疗法等领域[1, 5,6,7,8]。在各种应用中，在化学反应中作为催化剂的应用是一个逐渐发展的领域。为了探索 AuNP 的新催化应用，通常采用在过量硼氢化钠存在下将 4-硝基苯酚 (4-NP) 还原为 4-氨基苯酚 (4-AP) 的模型反应。使用 4-NP 到 4-AP 还原反应作为模型反应的原因之一是反应进程可以通过紫外-可见分光光度法直接跟踪。如果没有最终产品 (即 4-AP) 的纯化和鉴定, 反应混合物中吸光度变化的观察足以证明反应进程。据报道，AgNPs 具有强大的抗菌活性。特别是，与大量对应物相比，AgNPs 的高表面积与体积比有利于发挥抗菌活性。以软膏、乳膏和凝胶形式存在的AgNPs已被用于治疗烧伤[9]。

多种天然产物，包括氨基酸、肽、真菌、细菌、植物提取物、藻类、多糖和酵母，已被用于绿色合成 [10, 11]。植物提取物已被有效地用作合成 AuNPs 和 AgNPs 的绿色还原剂 [11, 12]。在多种植物提取物中，具有生物和药理活性的中药在MNPs的绿色合成中具有很大的吸引力。

在本报告中，桔梗皂苷（Platycodon grandiflorum ,桔梗)被用于合成AuNPs和AgNPs。桔梗作为中药的药理活性包括镇咳、免疫刺激、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、抗肥胖、保肝、镇痛、增强认知、抗胆碱能和抗组胺活性[13]。已知桔梗的化学成分含有碳水化合物、蛋白质、脂质和三萜皂苷[14]。三萜皂苷属于一大类化合物，以 30 个碳的四环或五环构型排列，具有多个羟基和糖基，导致分子的一端亲水，另一端疏水[15]。桔梗皂苷的苷元是具有两条侧链的齐墩果烷型三萜。一个葡萄糖单元通过醚键连接到三萜的 C-3 位，不同的糖基通过 C-28 位的酯键连接。共轭糖基由 D-葡萄糖、D-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖和 D-阿糖组成 [16]。在桔梗皂苷中，桔梗素D（PD，图1）是桔梗的标志化合物之一。虽然PD是三萜皂苷的主要成分之一，但桔梗中总皂苷含量约为2%。因此，我们开发了桔梗苷 E 和桔梗素 D3 向桔梗苷 D 的酶转化，并成功地从桔梗水提物中获得了富含 PD 的部分 [16, 17]。

桔梗D的结构

在本报告中，富含 PD 的部分被用作合成 AuNPs 和 AgNPs（以下称为 PD-AuNPs 和 PD-AgNPs）的绿色还原剂。合成的反应进程和每个纳米颗粒样品的表面等离子体共振 (SPR) 由紫外可见分光光度法跟踪。通过显微方法观察尺寸和形态，包括高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）和原子力显微镜（AFM）。获得高分辨率 X 射线衍射 (HR-XRD) 图案以揭示晶体结构。获得傅里叶变换红外 (FT-IR) 光谱以阐明参与两种纳米颗粒合成的官能团。在过量硼氢化钠存在下，通过 4-NP 还原为 4-AP 来评估 PD-AuNPs 的催化活性。此外，为了从 AFM 高度图像中精确识别纳米级几何形状，我们开发了一种可以增强表面几何形状的曲率相关演化方案 [18]。使用主曲率流的表面演化方程在相应的主方向上平滑并增强了 AFM 图像。主曲率直接根据离散 AFM 高度数据的一阶和二阶导数计算得出。卢等人。研究了曲率流对形态特征的影响，结果表明，虽然平均曲率流会产生不需要的新形态特征，但在主曲率流下不会产生特征点[19]。

方法/实验

材料和仪器

根据我们之前的报告 [16, 17]，通过酶促转化制备了来自桔梗水提取物的富含 PD 的部分。氢氯金酸三水合物 (HAuCl4·3H2O)、硝酸银、硼氢化钠和 4-硝基苯酚购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。 Shimadzu UV-2600（Shimadzu Corporation，Kyoto，Japan）跟踪纳米颗粒的 SPR 和 4-NP 还原反应的进展。使用在 300 kV 下运行的 JEM-3010 仪器获取 HR-TEM 图像以研究产品的尺寸和形态（JEOL，东京，日本）。为了获得 HR-TEM 图像，从 Ted Pella (Redding, CA, USA) 购买了碳涂层铜网格（碳类型 B，300 目）。使用轻敲模式操作 Dimension® Icon® 仪器以获得 AFM 图像（Bruker Nano，Santa Barbara，CA，USA）。对于样品加载，云母（V-1 级，25 毫米 × 25 毫米长，0.15 毫米厚）从 SPI Supplies Division of Structure Probe（West Chester, PA, USA）获得。优质高分辨率轻敲模式硅探针（RTESP AFM 探针，MPP-11100-10）购自 Bruker Nano（美国加利福尼亚州圣巴巴拉市）。为了阐明晶体结构，使用配备有 Cu Kα 辐射源（λ =0.154056 nm）（Bruker，Karlsruhe，Germany）的 Bruker D8 Discover 高分辨率 X 射线衍射仪。在 20° 至 90°（2θ 标度）范围内获得 HR-XRD 图案。制备 KBr 颗粒以使用 Nicolet 6700 光谱仪在 400 ~ 4000 cm ^-1 波数范围内获得 FT-IR 光谱 （赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。对于 HR-XRD 和 FT-IR 分析，使用 FD5505 冷冻干燥机制备粉末样品（韩国首尔 Il Shin Bio）。

PD-AuNPs 和 PD-AgNPs 的绿色合成

合成了 1 mL PD-AuNP 样品，最终浓度为 PD 富集级分 (0.05%) 和 HAuCl4·3H2O (0.2 mM)。将反应混合物在环境温度下温育 5 分钟。合成了 1 mL PD-AgNPs 样品，最终浓度为 PD 富集级分 (0.01%) 和 AgNO3 (0.8 mM)。将反应混合物在 80°C 烘箱中温育 3 小时，并在环境温度下进一步温育 21 小时。在 300 到 700 nm 范围内获得了紫外-可见光谱。

增强型 AFM 图像的曲率相关演化以精确测量尺寸

以下曲率流动方程与实验AFM高度数据一起使用，以精确测量尺寸并有效计算纳米颗粒的数量。

\( {\Phi}_{,t}\left(x,y,t\right)=\beta \sqrt{1+{\Phi}_{,x}^2+{\Phi}_{,y }^2=\beta \left|\nabla \Phi \right|} \)，其中表面 S ={(x , y , z ) :z =Φ(x , y , z )}。

如果 β 选择取决于主曲率，这个演变过程称为“曲率流 。”当 β 被选为主曲率之一，相应的流动称为κ 我 流 (i =1,2)。主曲率流使图像在相应的主方向上变得平滑。

PD-AuNPs 的催化活性

对于催化活性，PD-AuNP 的合成如下：将富含 PD 的部分（0.1%，500 μL）与去离子水（480 μL）混合，然后加入 HAuCl4·3H2O（10 mM，20 μL）。将反应混合物涡旋 10 秒并在环境温度下避光孵育 24 小时。在水性体系中存在过量硼氢化钠的情况下，使用 4-NP 到 4-AP 的还原反应评估 PD-AuNPs 的催化活性。 4-NP 溶液（900 μL，0.5 mM）与去离子水（650 μL）混合。向该溶液中加入新鲜制备的硼氢化钠 (1.65 mL, 10 mM)。接下来，添加新合成的 PD-AuNP（800 μL）。对于催化活性，反应混合物的最终浓度如下：4-NP（0.113 mM，1 当量）、硼氢化钠（4.13 mM，36.5 当量）和 PD-AuNP（0.04 mM，0.354 当量） .用紫外-可见分光光度法在 200 到 700 nm 范围内在环境温度下监测反应进程 720 s。

结果与讨论

PD-AuNPs 和 PD-AgNPs 的绿色合成

首先，对于 AuNPs 和 AgNPs 的合成，反应完成很容易通过溶液的可见颜色变化来确定。 PD-AuNP 的颜色为酒紫色，SPR 为 536 nm（图 2a）。在 427 nm 处观察到呈黄色的 PD-AgNPs 的 SPR（图 2b）。图 2 中的数码照片显示了 PD-AuNPs（左，a）和 PD-AgNPs（右，b）的溶液，它们是根据上一节中描述的程序合成的。这些颜色变化使纳米颗粒中传导电子的振荡频率与入射辐射的频率相匹配。因此，紫外-可见光谱提供了足够的信息来确定 AuNPs 和 AgNPs 的反应完成及其特征 SPR 带。从图 2 所示的紫外-可见光谱可以看出，富含 PD 的部分起到了还原剂的作用，产生了两种纳米颗粒。

紫外-可见光谱。 一 PD-AuNPs 和 b PD-AgNPs

HR-TEM 图像

纳米颗粒的可视化是识别重要信息的关键步骤，包括尺寸、形态和分散状态。如图 3 所示，PD-AuNP 呈球形，平均直径为 14.94 ± 2.14 nm。对于 PD-AuNPs 和球形也观察到了小三角形和其他多边形形状。球形的平均直径是从 HR-TEM 图像中的 103 个离散纳米粒子测量的。尺寸分布的高斯直方图如图 3d 所示。最常观察到的 PD-AuNPs 的大小在 14 ~ 15 nm 的范围内。如图 3a 所示，PD-AuNPs 分散良好，没有任何聚集，这表明富含 PD 的部分也起到了封端剂（或稳定剂）的作用。图 4 中还观察到球形 PD-AgNPs。与 PD-AuNPs 的分散状态相似，PD-AgNPs 的分散状态非常好，平均直径为 18.40 ± 3.20 nm（图 4d）。随机选择来自 HR-TEM 图像的一百个离散纳米粒子以获得平均直径。最常观察到的 PD-AgNPs 尺寸在 17 ~ 18 nm 范围内。

一 –c HR-TEM 图像和 d PD-AuNPs 的大小直方图。比例尺代表 a 100 纳米，b 10 纳米和 c 5 纳米

a–c HR-TEM 图像和 d PD-AgNPs 的大小直方图。比例尺代表 a 100 纳米，b 20 纳米和 c 5 纳米

原子力显微镜图像

AFM 图像与上一节中描述的 HR-TEM 图像得到了很好的证实。在图 5 中观察到 PD-AuNP 的球形形态。在 2D 高度（图 5a）和 3D 高度（图 5d）图像中，较亮的纳米颗粒具有更高的高度。除了地形信息，相位图像通常检测表面结构，区分软/硬区域，并映射材料中的不同成分。如 2D 相位图像（图 5b）所示，球形 PD-AuNP 被很好地可视化。此外，3D 幅度误差图像（图 5c）显示球形形态。进行了截面分析，结果显示在图 5e 中。分析图 5a 中的 A-B 线，测得两个 PD-AuNP 的高度分别为 10.44 和 10.47 nm。

PD-AuNPs 的 AFM 图像和截面分析。 一 2D 高度（1 μm × 1 μm）。 b 2D 相（2.5 μm × 2.5 μm）。 c 3D 幅度误差（1 μm × 1 μm）。 d 3D 高度（1 μm × 1 μm）。 e a中A-B线的剖面分析

球形 PD-AgNP 在 2D 高度图像中清晰可见（图 6a）。从 2D 相（图 6b）和 3D 相（图 6c）图像中，我们观察到了关于两种不同组分（PD-AgNPs 和还原剂）的详细信息。颜色鲜艳的球形材料（即 PD-AgNPs）比深色成分保持相对更高的硬度。颜色较深的成分来自还原剂（即富含 PD 的部分）。 PD-AgNPs 的球形形态也​​从 3D 幅度误差图像中得到证实（图 6d）。还进行了截面分析并显示在图 6e 中。分析图 6a 中的 A-B 线，测得两个 PD-AgNPs 的高度分别为 7.46 和 10.35 nm。

PD-AgNPs 的 AFM 图像和截面分析。 一 2D 高度（1 μm × 1 μm）。 b 2D 相（1 μm × 1 μm）。 c 3D 相位（1 μm × 1 μm）。 d 3D 幅度误差（1 μm × 1 μm）。 e a中A-B线的断面分析

增强型 AFM 图像的曲率相关演化以精确测量尺寸

图 5 和图 6 分别显示了 PD-AuNP 和 PD-AgNP 的 2D 和 3D AFM 原始数据。从图中的当前高度图像。如图 5a 和 6a 所示，如果没有图 5b 和图 6b 中的相位信息，则很难精确识别纳米颗粒的边界。 3D 图像有助于识别纳米粒子的形态，但不提供纳米粒子的精确尺寸。因此，具有 κ 的曲率相关演化 2 流用于识别纳米颗粒和基板之间的谷线。如图 7 所示，使用步长 Δt =10 ⁻⁷ ，对 PD-AuNP（图 5a）和 PD-AgNP（图 6a）的 2D 高度数据进行了 500 个进化步骤。 κ 图 2 流精确地确定了代表 PD-AuNP（图 7a）和 PD-AgNP（图 7b）边界的主要谷线。蓝线和红线分别代表获得的谷线和脊线。从这些增强的图像中，从每个图像中选择了 30 个离散的纳米粒子进行尺寸测量。从增强的 AFM 2D 图像中，PD-AuNPs 的尺寸测量为 19.14 nm，PD-AgNPs 的尺寸测量为 29.93 nm。 AFM 图像的尺寸大于 HR-TEM 图像中测量的尺寸（PD-AuNP 为 14.94 nm；PD-AgNP 为 18.40 nm）。 AuNPs在AFM云母基板上的冷焊现象可以解释HR-TEM和AFM尺寸测量之间的尺寸差异[20]。

通过曲率相关演化增强 AFM 2-D 高度图像。 一 PD-AuNP。 b PD-AgNPs

HR-XRD 分析

需要 HR-XRD 分析来识别纳米颗粒的晶体结构。如图 8 所示，HR-XRD 分析显示 PD-AuNPs 和 PD-AgNPs 的布拉格反射，表明这两种类型的纳米颗粒都具有面心立方结构。 （111）和（200）平面分别出现在 PD-AuNP 中的 38.2° 和 44.4°（图 8a）。对于 PD-AgNPs，在 38.2°、44.4°、65.2° 和 78.0° 处的强衍射峰对应于晶体结构的（111）、（200）、（220）和（311）面（图 3）。 8b)。杂质用星号标记。 (111) 面在两种纳米粒子的 HR-XRD 图中最强，表明晶体的主要取向沿 (111) 面。接下来，通过使用 Scherrer 方程对两种纳米粒子的粗略尺寸进行估计。由于 (111) 峰强度最大，因此我们根据该峰估计了大小。 Scherrer 方程中每个术语的定义。 (D =0.89 × λ/W × cosθ) 如下：D 是粒径，θ 是 (111) 峰的布拉格衍射角，λ 是 X 射线波长，β 是 (111) 峰的半峰全宽 (FWHM)，以弧度表示。根据公式粗略估计，PD-AuNPs 为 11.05 nm，PD-AgNPs 为 12.54 nm。

HR-XRD分析。 一 PD-AuNP。 b PD-AgNPs

FT-IR 光谱

FT-IR 光谱提供了有关还原剂的哪些官能团参与 AuNPs 和 AgNPs 合成的重要信息。 PD 由三萜苷元和糖组成，形成糖苷（图 1）。三个 FT-IR 光谱如图 9 所示：富含 PD 的部分（图 9a）、PD-AuNP（图 9b）和 PD-AgNP（图 9c）。在 3421 cm ^-1 处出现了一条对应于富含 PD 的部分的 –OH 基团的宽谱带 （图 9a）。由于 -OH 基团的氢键，观察到一个宽带。该波段移至 3426 cm ⁻¹ 对于 PD-AuNP（图 9b）和 3407 cm ^-1 对于 PD-AgNPs（图 9c），表明羟基参与了合成。 1654 cm ⁻¹ 处的波段 和 1457 厘米 ⁻¹ 由于富含 PD 的部分中的芳族 C=C 键振动而出现（图 9a）。合成后，1654 cm ⁻¹ 处的波段 转移到较低的波数，例如 1633 cm ⁻¹ 对于 PD-AuNP（图 9b）和 1621 cm ^-1 对于 PD-AgNPs（图 9c）。 C-O 和 C-H 振动出现在 1035 cm ⁻¹ （图 9a），并且该波段移动到更高的波数，例如 1043 cm ^-1 对于 PD-AuNP（图 9b）和 1058 cm ^-1 对于 PD-AgNPs（图 9c）。从FT-IR结果来看，富含PD的馏分中的-OH、芳香族C=C、C-O和C-H官能团有助于合成。

FT-IR 光谱。 一 富含 PD 的部分。 b PD-AuNP。 c PD-AgNPs

PD-AuNPs 的催化活性

绿色合成的 AuNP 已成功用作 4-NP 还原反应的催化剂 [21,22,23,24,25]。 PD-AuNPs 的催化活性是在硼氢化钠存在下使用 4-NP 到 4-AP 的还原反应来评估的。使用 4-NP 的还原反应来评估 AuNPs 催化活性的主要原因之一是它非常适合通过紫外-可见分光光度法对反应进行定性和定量监测。对于催化活性，反应混合物的最终浓度如下：4-NP（0.113 mM，1 当量）、硼氢化钠（4.13 mM，36.5 当量）和 PD-AuNP（0.04 mM，0.354 当量） .在过量硼氢化钠（相当于底物 4-NP 的 36.5 倍）的情况下，由于 4-硝基苯酚阴离子的形成，4-NP 在 400 nm 处表现出最大吸光度（数据未显示）。 4-硝基苯酚阴离子溶液颜色为黄色，不加催化剂不进行还原反应。在加入 PD-AuNP 作为催化剂之前，400 nm 处的吸光度没有变化。加入 PD-AuNP 后，400 nm 处的吸光度开始下降。有趣的是，同时出现了 300 nm 处的新峰，表明最终产物 4-AP（图 10a）。在过量硼氢化钠存在下，反应在 720 秒内完成。我们在反应过程中使用了过量的硼氢化钠以确保准一级动力学。从时间（秒）和 ln(C t /C 0 ) (C t ：时间 t 时 400 nm 处的 4-NP 浓度 , C 0 ：时间 0 时 400 nm 处的 4-NP 浓度 )，观察到线性关系，速率常数为 3.4 × 10 ^-3 /s（图 10b）。我们可以替换 C t 和 C 0 与 A t 和 A 0 , 分别, 其中 A t 是 t 时间在 400 nm 处的吸光度 , 和 A 0 是 0 时间在 400 nm 处的吸光度 .结果表明，在过量硼氢化钠存在下，PD-AuNPs能有效催化4-NP还原反应生成4-AP。

在 PD-AuNP 催化剂存在下，硼氢化钠的 4-NP 还原反应。 一 紫外可见光谱和b ln(C t /C 0 ) 作为时间的函数 (min)

在我们的实验室中，不同浓度的咖啡酸用于合成 AuNPs，并使用 4-硝基苯酚还原反应评估其催化活性 [26]。咖啡酸是植物中发现的次生代谢物和酚类化合物之一。结果表明，最低浓度的咖啡酸表现出最高的催化活性。此外，通过离心从原始胶体溶液中去除咖啡酸将催化活性提高了 6.41 倍。在当前系统中，观察到 PD-AuNPs 的速率常数为 3.4 × 10 ^-3 /秒。可能在通过离心合成 PD-AuNPs 后去除 PD 可以增加催化活性。这将是我们未来的工作之一。咖啡酸和 PD 都是植物的次生代谢产物，所得的 AuNPs 表现出优异的催化活性。因此，植物的多种次生代谢产物可以成为制备AuNP纳米催化剂的绿色还原剂的有效候选物。

结论

PD 是桔梗中主要的桔梗皂苷，已知具有有益的生物活性。在当前的报告中，富含 PD 的部分被用作合成 PD-AuNPs 和 PD-AgNPs 的绿色还原剂。 HR-TEM 和 AFM 图像提供了有关尺寸和形态的信息。两种纳米颗粒大多是具有面心立方结构的球形。采用依赖于曲率的演化来平滑和增强 AFM 图像，从而可以精确测量尺寸。 –OH、芳香族 C=C、C–O 和 C–H 官能团作为还原剂产生纳米颗粒。此外，PD-AuNPs 对 4-NP 还原反应显示出催化活性，表明 PD-AuNPs 可以在未来用作催化剂。植物代谢物具有自己宝贵的生物活性，与 NMP 的内在活性一起，经常表现出协同特性。因此，我们未来的工作之一包括通过体外和体内研究评估两种纳米颗粒的生物活性。综上所述，皂苷等植物代谢物在制备新型纳米材料中的应用和扩展将继续增加。