利用自分解SiO₂纳米颗粒开发精确溶酶体pH传感器

摘要

溶酶体酸性pH与自噬密切相关；因此精确了解溶酶体pH变化将提供更多自噬过程和状态信息。然而迄今仅能指示相对宽范围pH变化，从未实现精确溶酶体pH检测。本研究基于具有特定合成参数的自分解SiO₂纳米颗粒系统建立内体/溶酶体pH指示剂。中空结构纳米颗粒中心浓缩亚甲蓝（MB）在pH 4.0-4.8呈敏感释放，恰为溶酶体pH范围。建立了光学密度（OD）值与pH值线性相关，用于6种不同细胞系溶酶体pH检测。此外，通过该系统成功精确检测黑色中孔硅（BPSi）NP内吞前后溶酶体pH平均变化，阐明BPSi内吞后自噬终止机制。因此，基于自分解纳米颗粒的腔内pH指示剂可提供新方法和策略，更好了解溶酶体pH，进而指示自噬过程或其他重要代谢信号细节。

引言

溶酶体作为大分子最终去向，由低pH激活的水解酶降解大分子[1]。液泡型H⁺-ATP酶（v-ATPase）[2]将质子从细胞质泵入溶酶体腔维持溶酶体酸性pH，保持~60种水解酶活性[3]。此外，近期文献报道溶酶体酸性pH与自噬密切相关[4]，精确了解溶酶体pH变化将提供更多自噬过程和状态信息。基于我们研究和文献回顾，胺阳性带电纳米颗粒内吞可能增加内体/溶酶体pH变化，如伯胺和仲胺PEG修饰纳米颗粒或颗粒表面亲水修饰[5,6]。

胺纳米颗粒内吞诱导的pH升高将显著增加转录因子EB（TFEB）核定位[7]，不仅导致途径转录上调，还引起溶酶体功能障碍，最终导致自噬通量阻断[7-9]。TFEB调节自噬，其过表达导致培养细胞自噬体产生显著增加。

因此，为预测自噬过程和细节，精确测量溶酶体pH及其变化至关重要。迄今，从内体/溶酶体pH指示文献综述[10]和商业检测内体/溶酶体pH值产品来看，仅能指示相对宽范围pH变化，从未实现精确溶酶体pH检测。因此，为了解自噬深层细节，建立精确腔内pH变化检测方法是重要途径。

基于我们自分解SiO₂纳米颗粒先前经验，本研究建立精确pH指示剂实现腔内pH变化检测。SiO₂纳米颗粒在可调尺寸和生物相容性方面有优势[11]。通过设定特定合成参数，建立的自分解SiO₂ pH指示剂可在pH 4.0-4.8敏感释放载药亚甲蓝（MB），恰为溶酶体pH范围。此外，MB释放呈现与pH值变化线性相关（方案1）。随后在细胞水平测试pH指示剂可行性，引入6种不同细胞系，成功测定BPSi NPs内吞前后溶酶体平均pH变化，阐明BPSi内吞后自噬终止机制。因此，基于自分解纳米颗粒的腔内pH指示剂可提供新方法和策略，更好了解溶酶体pH，进而指示自噬过程或其他重要代谢信号。

MB@SiO₂测量活细胞溶酶体pH示意图

材料与方法

材料部分

硅化钠（NaSi）和Si晶圆（直径20 cm，p+ (100)，0.01-0.02 Ω cm）分别由SiGNa Chemistry Inc.和Ocmetic Inc.提供。溴化铵（NH₄Br，99%）、溴化钠（NaBr，99%）、甲苯（无水，99.8%）、盐酸（HCl，37%）、MB、正硅酸乙酯（TEOS）购自Sigma-Aldrich。0.5 kDa甲氧基-PEG-硅烷和2 kDa甲氧基-PEG-硅烷分别购自Fluorochem Ltd.和Laysan Bio Inc.。RPMI 1640培养基由Life Technologies提供。胎牛血清（FBS）购自天航生物技术。碳酸氢钠、硫酸链霉素、青霉素G、HEPES、溶菌酶溶液、CellLight早期内体-GFP、LysoTracker™ Red DND-99、Pierce® BCA蛋白测定试剂盒、增强化学发光、pHrodo™ Red转铁蛋白偶联物、活细胞成像溶液、Trizol试剂购自Thermo Fisher Scientific。乙醇和氨水由国药提供。BioRT Master HiSensi cDNA第一链合成试剂盒购自杭州伯尔技术有限公司。RIPA裂解液购自心脏生物技术有限公司。P62、TFEB、β-actin抗体购自Proteintech Group, Inc.。LC 3B抗体由Abcam提供。2-(4-吡啶基)-5-((4-(2-二甲氨基乙基-氨基甲酰基)甲氧基)苯基)恶唑（PDMPO）由Yeasen Biotech有限公司提供。

研究目的、设计与设置

本研究旨在：（1）探索BPSi纳米颗粒对HepG2细胞自噬影响，（2）找出溶酶体pH值变化影响自噬的潜在机制，（3）建立可精确测量溶酶体pH的精确溶酶体pH指示剂，（4）指示pH波动对自噬影响。为实现上述目的，我们采用转录组测序实验探索BPSi纳米颗粒喂养后HepG2细胞转录组基因变化，并通过RT-qPCR和Western实验验证。荧光染料如PDMPO用于测量BPSi喂养后HepG2细胞溶酶体pH变化。为精确测量溶酶体pH，我们开发了具有10个参数的MB@SiO₂纳米颗粒，通过DLS和HR-TEM等实验测试这10种纳米颗粒表征。在不同pH溶液和HepG2细胞中测试10系列自分解纳米颗粒系统MB负载效率和释放动力学。为验证纳米颗粒进入细胞后细胞内定位，进行细胞TEM实验和活细胞共聚焦显微镜。最后测量喂养BPSi后6种细胞溶酶体pH变化，验证MB@SiO₂纳米颗粒测量溶酶体pH变化普适性。

BPSi纳米颗粒合成

BPSi纳米颗粒按我们先前方法[12]制备，由合作者（Wujun Xu，东芬兰大学应用物理系）提供。在Ar气氛手套箱中研磨BPSi、NaSi、铵盐和NaBr（NaSi:NH₄Br:NaBr=1:4:4，w/w/w）。在N₂气氛管式炉中240°C反应5 h（方程1）。冷却至室温后，所得微粒分别用0.5 M HCl和1.0 M HF溶液纯化。微粒在乙醇中1000 rpm球磨15 min，通过调节离心速度收集所需直径BPSi纳米颗粒。

NaSi + NH₄Br → NaBr + NH₃ + Si/H + H₂ (1)

通过动态光散射实验研究纳米颗粒直径分布和表面电荷。所有NPs经轻微超声处理（5 s使其均匀分散，超声清洗器SB-5200DT，宁波科晟生物技术有限公司）灭菌后分散培养基，引入细胞前即刻进行。

10系列自分解纳米颗粒系统建立

10系列自分解纳米颗粒按我们先前报道方法[13-16]合成，修改参数。典型工艺：将一定量MB首先加入乙醇（75 mL）与氨水溶液（25%，3.4 mL）混合液，随后加入一定量TEOS。搅拌24 h后洗涤3次干燥获得系列自分解MB@SiO₂ NPs。MB和TEOS添加量见表1。NPs₁.₀/₁₀₀中1.0/100指合成纳米颗粒时MB和TEOS用量，即1.0 mg MB和100 μL TEOS。NPs₁.₅/₁₀₀等含义与此一致。

细胞培养

为测试基于自分解纳米颗粒pH指示剂效率和普适性，选特定肿瘤源癌细胞系测试。选择肝癌、肺癌、结肠癌、黑色素瘤细胞系为研究对象。人结肠癌细胞HCT116、HCT8、HCT15；人肝癌细胞HepG-2；人肺癌细胞A549；小鼠黑色素瘤细胞B16在RPMI 1640培养基（Life Technologies）中培养，补充10%失活FBS、2.0 g/L碳酸氢钠、0.1 g/L硫酸链霉素、0.06 g/L青霉素G、5.958 g/L HEPES。细胞在标准细胞培养箱37°C、5% CO₂、湿润大气中维持。

10系列自分解纳米颗粒系统表征

所有系列纳米颗粒形貌用HR-TEM配STEM模式表征，Si分布用EDS元素映射研究。纳米颗粒尺寸分布用ImageJ软件随机选取STEM图像计算纳米颗粒直径分析。纳米颗粒zeta电位和多分散性指数（PDI）通过动态光散射（DLS）研究，在特定pH值系列缓冲液中测量。数据用SPSS15.0分析，统计结果呈均值±标准差。

10系列自分解纳米颗粒系统MB负载效率与释放动力学研究

为研究MB负载效率和释放动力学，首先建立系列浓度MB标准曲线。用UV-Vis光谱在660 nm（单体MB λmax）处测定MB吸收。MB负载效率按下式计算：MB负载效率（%）（封装MB量/总输入MB量）。

在纯水和不同pH缓冲液（pH 4.0、6.86、9.18）及溶菌酶溶液（Thermo Scientific™ #90082）中研究10系列纳米颗粒MB释放。还研究特定时长不同pH缓冲液中MB释放动力学。研究660 nm处OD值和MB释放百分比随时间函数。

详细MB释放研究按以下方案：将10系列纳米颗粒分别溶解于15 mL标准pH 4.0、6.86、9.18缓冲液及溶酶体溶液；在37°C叠加振荡器上释放。随后15天每天收集1 mL各样品，12000 rpm离心10 min。上清液和沉淀在200-800 nm测定吸收光谱。

此外，在pH 4.1-5.5范围含溶菌酶溶液精确pH缓冲液中用相同方案研究MB释放。设定特定时间点（6 h、12 h、24 h）为观察时间点。记录各样品660 nm吸收值。各时间点分别计算各pH溶液吸收线性关系和残差平方和。

为检测细胞中MB释放谱，HepG-2细胞在75 cm²培养瓶培养，细胞增殖至培养瓶70%时喂养NPs（300 μg/mL）。每30 min收集细胞。反复冻融细胞彻底释放细胞内MB。细胞裂解液12000 r/min离心10 min。获得上清液测定660 nm吸光度计算总释放MB量。本研究选HepG2细胞为研究对象，因其快速增殖可最小化所有10测试组间差异。

10系列纳米颗粒细胞共定位及6种细胞系释放性能

细胞TEM研究纳米颗粒在内体/溶酶体共定位，遵循标准细胞TEM方案。细胞以1×10⁶ cells/flask强度接种培养24 h使细胞贴壁。10系列纳米颗粒同浓度（100 μg/mL）培养基中与细胞共孵育12 h和24 h。用PBS洗涤3次去除多余纳米颗粒，2.5%戊二醛溶液固定超1天。固定细胞洗涤后用1%四氧化锇水溶液染色1 h，随后PBS洗涤3次、双蒸水2次。进行经典细胞TEM方案[17,18]，收集90 nm厚切片供TEM观察。用NPs₆/₁₀₀和NPs₇.₅/₈₀在6细胞系研究MB释放随pH值函数。记录MB释放OD值和释放百分比供数据分析。

MB@SiO₂纳米颗粒细胞内摄取研究

活细胞共聚焦显微镜评估MB@SiO₂纳米颗粒细胞摄取和细胞内命运。HepG-2细胞早期内体染色（CellLight早期内体-GFP，BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific C10586，激发/发射~488/510 nm）16 h。随后细胞以100 μg/mL纳米颗粒浓度孵育NPs₆/₁₀₀（MB激发/发射：640/650-700 nm），特定时间间隔（2 h、2.5 h、3 h、5 h、6 h）。成像前用LysoTracker™ Red DND-99（Thermo Fisher Scientific L7528，激发/发射：577/590 nm）染色溶酶体40 min。移除染色液，PBS洗涤细胞2-3次。用Nikon A1R共聚焦显微镜成像。

转录组测序评估BPSi喂养后基因表达变化

对照组和BPSi处理组总RNA用Trizol试剂按标准操作程序提取。用NanoDrop ND-2000分光光度计检测测序实验初始总RNA样品质量。通过质控总RNA用于后续测序实验。通过下一代测序进行基因表达比较。所有测序程序由BGI-深圳公司（中国深圳）用BGISEQ-500平台执行。测序原始数据质控判定是否适合后续分析。如通过，基于基因表达水平进行基因定量分析，对选定样本间差异表达基因进行基因本体论（GO）功能显著富集分析。

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证TFEB-CLEAR基因网络激活

对照组和BPSi处理组培养HepG-2细胞总RNA用Trizol试剂提取，用BioRT Master HiSensi cDNA第一链合成试剂盒（杭州伯尔技术有限公司）随机引物逆转录为cDNA。cDNA用Applied Biosystems™ 7500实时PCR系统（Applied Biosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA）以actin为参考对照扩增TFEB-CLEAR基因网络进行定量PCR。定量RT-PCR引物见表S4。

Western Blot验证BPSi喂养后自噬激活

对照组和不同浓度BPSi处理组细胞蛋白用RIPA裂解液（心脏生物技术有限公司）提取。加入蛋白酶抑制剂于RIPA裂解液冰上预冷。预冷PBS洗涤细胞3次。彻底倒尽液体，培养皿冰上放2 min。加入400 μl RIPA裂解液覆盖整个培养皿表面，移液管多次吹打，冰上孵育30 min，期间多次摇晃培养皿彻底裂解细胞。裂解细胞液转移至1 ml EP管，13,000 rpm、4°C离心10 min。所得上清液水浴煮沸10 min置-20°C备用。用Pierce® BCA蛋白测定试剂盒（Thermo scientific）定量蛋白浓度。

含25 μg总蛋白细胞提取物直接进行SDS-PAGE电泳转膜。膜用5%脱脂奶粉封闭，用识别P62（Proteintech #18420-1-AP）、TFEB（Proteintech #13372-1-AP）、LC 3B（Abcam #ab192890）、β-actin（Proteintech #20536-1-AP）一抗孵育。根据一抗来源物种选择二抗，用增强化学发光（Pierce）或Bio-Rad ChemiDoc XRS+凝胶成像系统（Bio-Rad，USA）检测。用ImageJ软件密度分析定量BPSi组P62、TFEB、LC 3B相对β-actin标准化条带强度，数据为三次独立实验均值±标准差。

共聚焦显微镜下PDMPO和pHrodo™ Red转铁蛋白偶联物测量细胞pH

PDMPO研究

1×10⁵ HepG-2细胞无菌共聚焦板过夜培养，BPSi纳米颗粒100 μg/mL浓度喂养。次日免疫荧光染色前，载玻片0.01 M磷酸缓冲盐水（PBS，pH 7.4）洗涤三次，加入1 μM PDMPO染料（Ex/Em=329/440）。PBS洗涤三次后，细胞用新鲜RPMI-1640培养基孵育，荧光显微镜（Nikon A1R，日本）配CCD相机观察，5 min内拍照，按Chen等[19]程序计算溶酶体蓝/绿荧光强度比。

pHrodo™ Red转铁蛋白偶联物研究

HepG-2细胞同样方式共聚焦板铺板贴壁24 h，冰上放置10 min。冷Live Cell Imaging溶液含20 mM葡萄糖和1% BSA洗涤细胞。加入25 μg/mL pHrodo™ Red转铁蛋白偶联物（Ex/Em=560/585 nm）于Live Cell Imaging溶液，37°C孵育20 min，Live Cell Imaging溶液洗涤细胞。共聚焦显微镜观察。用ImageJ软件进行显微图像强度定量分析。

细胞溶酶体pH检测

A549、HepG-2、HCT8、HCT15、HCT116、B16细胞在75 cm²培养瓶培养，增殖至培养瓶70%时喂养NPs，6 h后收集细胞。反复冻融细胞彻底释放细胞内MB。细胞裂解液12000 r/min离心10 min。获得上清液测定660 nm吸光度计算总释放MB量。将NPs₆.₀/₁₀₀标准pH下吸光度比较获得各细胞pH值。

统计分析

用SPSS15.0软件进行统计分析，独立组采用双因素方差分析（ANOVA），多重比较用Tukey HSD法。统计显著性基于P<0.05。

结果与讨论

首先检测细胞喂养双PEG功能化黑色多孔硅纳米颗粒（BPSi NPs，由合作实验室提供[12]）时差异基因表达。Zeta电位从-18.5变至+2.8 mV也表明表面双PEG化成功（图S1a）。BPSi纳米颗粒平均直径156 nm（图S1b）。基于差异基因表达聚类热图（图S2），选取2倍以上差异表达基因进一步研究。引入GO和KEGG分析差异基因。GO富集气泡图（图1a）中，选取代谢和溶酶体相关基因包括吞噬溶酶体组装、吞噬作用、异源代谢过程进一步分析。显著增加TFEB-CLEAR[17]相关基因表达。RT-PCR结果（图1b）验证基因测序结果，TFEB-协调溶酶体表达调节（CLEAR）通路基因显著增加，如CTSD、CTSF、TFEB、MFN1、LAMP2、TPP1。这些基因标记在溶酶体通路上（图S3）。其表达高于对照组且有统计学意义（P_BPSi VS Control<0.05）。TFEB正向调节溶酶体基因表达，控制溶酶体数量，促进溶酶体底物细胞降解。

BPSi喂养后HepG-2细胞自噬激活。a 转录组测序差异表达基因GO富集气泡图。b RT-qPCR验证BPSi处理后TFEB-CLEAR基因网络基因变化。c BPSi处理后P62、TFEB、LC3B II/I蛋白表达。d 对照组相对BPSi处理组P62、TFEB、LC3B II/I蛋白标准化条带灰度强度。数据呈均值±标准差

此外，TFEB调节自噬，其过表达因TFEB基因主要功能诱导溶酶体生物合成促进自噬发生[20]，导致培养细胞自噬体产生显著增加。Western blot分析验证细胞喂养BPSi NPs时自噬是否发生。Western测试目的进一步确认TFEB表达增加和BPSi喂养后细胞自噬发生。LC3B和P62蛋白均为自噬标志物。自噬发生时，微管相关蛋白1A/1B-轻链3B（LC3B）II/I表达增加。p62为将被自噬降解囊泡受体，也是清除泛素化蛋白聚集体受体，自噬发生时其表达减少。因此Western实验测量这些蛋白表达。

Western blot结果（图1c,d）显示TFEB（P_80 μg/ml VS control=0.000008）、LC3B II/I（P_80 μg/ml VS control=0.000297）、p62（P_80 μg/ml VS control=0.000016）蛋白显著上调。TFEB和LC3B II/I蛋白上调指示自噬激活[18]，推测BPSi内吞促进自噬发生。然而，p62蛋白本应在自噬过程中下调，因其载体蛋白性质将内体运至溶酶体最终降解。本研究p62显著上调指示内体-溶酶体融合过程中降解终止[21]，可能因内体/溶酶体囊泡pH升高。因此BPSi内吞可能先诱导自噬发生，再因酰胺碱性增加内体/溶酶体pH值抑制自噬过程。

为证实BPSi内吞导致内体/溶酶体pH增加特性，研究采用两种商业pH荧光探针：pHrodo™ Red转铁蛋白偶联物（Thermo Fisher #P35376）和RatioWorks™ PDMPO。

pHrodo™ Red作为商业细胞内pH指示剂，中性pH下弱荧光，pH下降荧光增强。本应量化细胞质pH范围9-4，pKa~6.5，激发/发射560/585 nm。从6细胞系测定可获定性结论：BPSi NPs内吞能增加内体/溶酶体pH值，因红色荧光信号减弱（图S4、S5）。但按产品操作方案重复实验多次，因无强度与pH值相关性建立，难对不同细胞系喂养BPSi NPs前后pH确切降低值定量分析。

PDMPO作为指示BPSi内吞后pH值变化更好方案，引入比率成像技术定量测量pH。PDMPO[2-(4-吡啶基)-5-((4-(2-二甲氨基乙基-氨基甲酰基)甲氧基)苯基)恶唑]为酸向双激发双发射pH探针。低pH发强绿荧光，高pH发强蓝荧光。这种独特pH依赖性荧光使PDMPO成为pKa=4.47酸性细胞器理想pH探针。PDMPO选择性标记活细胞酸性细胞器（如溶酶体），两个不同发射峰可用比率测量监测活细胞pH波动。但我们仍失败测量6细胞系BPSi喂养前后pH值。图S6结果显示所有6细胞系BPSi喂养前后无显著差异。虽建立蓝/绿比值与pH值相关性（图S7），pH 4-5非线性相关导致PDMPO方法在BPSi喂养前后内体/溶酶体定量分析失败。

从上述两商业pH指示剂数据，首先证实我们推测：PEG修饰纳米颗粒PEG链上酰胺因碱性可使内体/溶酶体pH增加。但无精确pH变化定量分析（0.1 pH范围），仍无法建立自噬状态与内体/溶酶体pH值相关性，自噬预测失败。

基于我们自分解纳米颗粒先前研究[13,14][15,22]，保持75%乙醇中氢氧化铵浓度不变，调整MB和TEOS浓度。设定两系列TEOS量为100 μL和80 μL，获得不同壳厚和孔径。设定十系列MB量获得不同中心空腔结构尺寸和MB负载效率。

方案中MB和TEOS添加量见下表1。

图2a,b显示两种TEOS浓度（100 μL和80 μL）下纳米颗粒尺寸随MB量增加而增加。相同MB浓度下，TEOS量增加粒径增大。此外，TEOS量增加壳厚增厚，元素映射证实（图2c）。纳米颗粒多分散性指数（PDI）和表面电荷见图S8和表S1。形貌研究预测：MB量增加负载效率提高导致释放谱加快，TEOS量增加释放减慢。需找出适当MB和TEOS浓度获得优化纳米颗粒系统，使MB释放谱与pH变化线性相关。

10种特定MB或TEOS量自分解纳米颗粒形貌表征。a STEM图像。b 纳米颗粒尺寸分布分析。c 10自分解纳米颗粒Si映射。所有图像比例尺100 nm。尺寸分析随机选取100纳米颗粒从STEM图像用ImageJ软件测量。数据呈均值±标准差

MB负载效率用UV-Vis光谱测定。首先用系列MB浓度（6.25-46.88 μg/mL）绘制标准曲线（图S9），方程为y=67.63x+0.10919，R²=0.9987。按上式计算获得10自分解纳米颗粒特定参数MB负载效率，详细数据见图S10。

研究不同pH溶液MB释放谱前，先研究纯水中释放谱。图S11、S12显示TEOS量80 μL所有纳米颗粒随时间增加MB释放增加，UV-Vis吸收反映。且随MB封装量增加，MB释放增长趋势更显著，释放速度更快。但TEOS量增至100 μL时，颗粒表面更致密，MB量3.0 mg以下14天释放几乎无增加趋势。MB量增至4.0 mg以上可观察到明显MB释放增加趋势。值得注意的是NPs₇.₅/₈₀和NPs₆.₀/₁₀₀参数随时间延长呈现稳固增长，前7天近似线性增加趋势，随后达平台期。

随后重点研究不同pH缓冲液中MB释放行为，弄清特定参数自分解纳米颗粒是否具有线性pH依赖MB释放。

首先在pH 4.0缓冲液进行MB释放实验。图S13显示相同TEOS量100 μL下，5纳米颗粒系统MB释放速度呈现相似趋势。TEOS量80 μL下（图S14），观察到与MB封装量正相关。

浓缩MB因浓度差扩散至周围溶液。较大浓度梯度导致更快MB释放。与纯水MB释放比较，发现酸性环境加速MB释放（图S13、S14对比图S11、S12），表明MB释放不仅由扩散驱动；酸性溶液中静电排斥也是重要驱动力，因MB带正电性质。按MB负载效率、MB标准曲线、测量稀释比计算各纳米颗粒参数释放百分比。释放百分比反映pH 4.0酸性溶液MB释放速度，结果（图3）显示仅NPs₇.₅/₈₀在pH 4.0溶液呈线性释放。其他特定MB和TEOS参数纳米颗粒系统显示相似释放趋势，释放百分比无线性增长。例外是NPs₆/₁₀₀，MB释放仅72 h达平台期，此阶段难判断该时长前MB释放能否线性增长。

特定时长后10系列自分解纳米颗粒pH 4.0缓冲液MB释放百分比。所有实验三重复，数据呈均值±标准差

同时测试近中性和碱性缓冲液（pH 6.86和9.18）MB释放谱。图S15、S16、S17、S18结果显示溶液pH增至6.86 MB释放减缓；且随中心MB浓度增加，MB释放百分比降低。pH 9.18时，所有10特定参数纳米颗粒呈极慢MB释放（图S19、S20）；UV-Vis吸收或释放百分比趋势与pH 6.86缓冲液相似但释放百分比更低。显然自分解纳米颗粒仅酸性溶液呈MB释放线性增长。回顾内体/溶酶体pH为4-5，恰为特定MB/TEOS参数下MB随时间线性增长pH范围。因此更确信自分解纳米颗粒系统可为内体/溶酶体平均pH定量测定准确工具，为自噬状态确切pH值提供证据。

用特定自分解纳米颗粒作内体/溶酶体pH指示剂前提是：纳米颗粒整个测量过程在内体/溶酶体保持稳定。其次，测量进行时MB在内体/溶酶体平滑释放。

通过细胞TEM研究纳米颗粒内体/溶酶体共定位和6不同细胞系MB释放。细胞TEM结果显示，所有10系列纳米颗粒与HepG-2细胞孵育24 h后停留内体/溶酶体未逃逸（图4）。因图4用HepG2细胞直径约10-20 μm，MB@SiO₂纳米颗粒直径75-200 nm，低倍率图像难辨别纳米颗粒形貌（图S21）。也研究其他5细胞系纳米颗粒细胞内定位，随机选4纳米颗粒证明纳米颗粒被内体/溶酶体捕获（图S22）。所有参数纳米颗粒在其他5细胞系孵育24 h后显示中心空腔结构，指示MB释放。更精密观察下，注意到MB释放可能因不同空腔大小而异，指出（1）不同细胞内体/溶酶体pH不同（2）纳米颗粒MB释放对内体/溶酶体pH极敏感，特别是NPs₆/₁₀₀和NPs₇.₅/₈₀。图S23显示纳米颗粒喂养2 h后已实现内吞停留囊泡，随后逐渐在溶酶体积累。

10系列纳米颗粒与细胞孵育12 h和24 h后细胞TEM研究纳米颗粒内体/溶酶体共定位。TEM图像比例尺200 nm

随后评估pH值与OD值在pH 4.0-4.8相关性。图5和图S24结果显示，NPs₆/₁₀₀和NPs₇.₅/₈₀纳米颗粒系统MB释放在pH 4.0-4.8范围呈pH线性减少函数。

特定孵育时长6 h、12 h、24 h下NPs₆/₁₀₀和NPs₇.₅/₈₀ MB释放随pH值函数。两纳米颗粒系统6 h和12 h MB释放随pH值线性相关方程也计算。所有实验三重复，数据呈均值±标准差

随后按MB负载效率和喂养量将OD值转换为MB释放百分比。图S25显示前6 h，NPs₆/₁₀₀和NPs₇.₅/₈₀纳米颗粒系统MB释放百分比也呈pH值函数。分别计算6 h和12 h释放时长残差平方和和Pearson相关系数，残差平方和与线性拟合接近度负相关，Pearson相关系数绝对值越接近1线性越好。表S2、S3显示最高线性度为NPs₆.₀/₁₀₀纳米颗粒系统拟合，其次为NPs₇.₅/₈₀在6 h释放时。

此时我们因结果兴奋：精确监测pH值方法已建立，准确度≤0.1 pH值间隔。意味着有极大可能弄清内体/溶酶体pH值与自噬状态相关性，对更好研究自噬机制和预测自噬过程极具意义。图S26显示MB在HepG-2细胞孵育4 h后已达平台期。故选6 h为观察时间点。

随后仔细研究NPs₆.₀/₁₀₀在6细胞系中6 h纳米颗粒-细胞相互作用时长MB释放，含肝癌HepG-2、结肠癌HCT8、HCT15、HCT116、肺癌A549、肌黑色素瘤B16细胞系。

表2显示我们以0.01 pH值精度清晰区分6癌细胞系内体/溶酶体，这是商业眼内pH指示剂套件无法做到的。

此外，重新评估HepG2细胞BPSi纳米颗粒培养前后内体/溶酶体pH值。得出结论：BPSi摄取显著增加内体/溶酶体pH值，从4.70±0.09升至5.59±0.05，完美阐释BPsi摄取诱导自噬初始后终止自噬通量原因。BPSi细胞内摄取使内体/溶酶体数量增加，与基因测序结果一致，自噬相关基因（TFEB-CLEAR）被激活。同时，内体/溶酶体pH值增加导致自噬终止与Western blot研究p62蛋白上调结果吻合。

讨论

纳米颗粒通常诱导细胞自噬[23]，研究显示中性或阴离子表面纳米颗粒自噬反应涉及自噬货物增强清除。相反，阳离子表面纳米颗粒细胞暴露导致TFEB通路转录上调，但也引起溶酶体功能障碍，最终导致自噬通量阻断[7]。我结果与这些先前结论一致。本研究通过转录组测序、RT-qPCR、Western实验发现HepG2细胞喂养BPSi纳米颗粒后自噬相关基因和蛋白表达增加。然而，自噬激活时自噬相关P62蛋白表达水平不降低。我们推测BPSi纳米颗粒表面PEG-胺升高溶酶体pH值，导致P62降解抑制。现有溶酶体pH指示剂无法验证猜测。为准确测量活细胞溶酶体pH，我们基于自分解纳米颗粒系统建立内体/溶酶体pH定性测定新方法。采用10特定MB/TEOS参数纳米颗粒系统获得优化pH敏感响应测量方法。内向外径向MB浓度梯度为MB释放主要驱动力。药物释放伴随载体分解同时进行，扩散控制机制驱动。此外，pH值降低氢离子浓度增加，增强静电相互作用促进内部MB比中性溶液释放更快[24]。优化中心空心纳米颗粒系统可释放中心浓缩MB为精确pH值线性函数，范围pH 4.0-4.8，恰为溶酶体pH。最终，基于自分解纳米颗粒定性pH指示剂，成功检测6细胞系溶酶体平均pH值。此外，通过该系统可定性区分HepG-2细胞BPSi纳米颗粒内吞前后溶酶体pH变化，阐明BPSi内吞后自噬发生随终止机制。自分解纳米颗粒系统为研究腔内pH值开辟全新途径，提供了解细胞信号和代谢新工具，进而为癌症治疗提供新方法[25,26]。

结论

本研究发现BPSi通过转录组测序促进细胞自噬，但纳米颗粒表面氨基可增加溶酶体pH抑制自噬流降解。因此溶酶体pH显著影响自噬阶段。精确获取溶酶体pH信息将促进自噬感知。然而现有荧光溶酶体pH指示剂仅能测定宽范围溶酶体pH；因此我们基于自解离系统建立精确溶酶体pH指示剂。调整MB@SiO₂合成参数，纳米颗粒负载MB释放与pH线性负相关。纳米颗粒进入细胞后主要停留溶酶体。通过测量细胞内MB释放量，按线性函数精确计算溶酶体pH值。建立的精确pH指示剂提供全新工具和方法论，精确研究溶酶体pH值并进一步获取更多自噬信息。

数据与材料可用性

本研究期间生成或分析所有数据均包含在本发表文章及补充信息文件中。

缩写

BPSi:

黑色中孔硅

FBS:

胎牛血清

GO:

基因本体论

HCl:

盐酸

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

MB:

亚甲蓝

NaBr:

溴化钠

NaSi:

硅化钠

NH₄Br:

溴化铵

NPs:

纳米颗粒

OD:

光学密度

PBS:

磷酸缓冲盐水

PDMPO:

2-(4-吡啶基)-5-((4-(2-二甲氨基乙基-氨基甲酰基)甲氧基)苯基)恶唑

RT-qPCR:

逆转录定量聚合酶链反应

TEOS:

正硅酸乙酯