生物相容性纳米颗粒递送系统增强顺铂-四环素联合化疗抗肿瘤疗效

摘要

联合化疗是临床肿瘤治疗的标准策略。研究证实四环素（Tet）与顺铂（CDDP）联用呈现显著协同抗癌活性，但不可避免的副作用限制了其治疗浓度。鉴于两药理化性质和药代动力学差异，本研究采用改进双乳液法将两药共载于纳米载体中。纳米颗粒（NPs）由聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）与羟基端聚己内酯（HO-PCL）混合制备，使亲水性CDDP和疏水性Tet同时定位于NPs内部，实现低干扰、高稳定性共递送。荧光显微镜图像揭示NPs可同时递送亲水和疏水药物进入细胞。体外不同肿瘤细胞系及肿瘤组织实验显示肿瘤抑制率和细胞凋亡率显著提高。体内实验观察到NPs组抗肿瘤疗效优越且副作用减轻。¹⁸FDG-PET/CT成像显示NPs组肿瘤代谢活性降低更显著。结果表明PEG-PCL嵌段共聚物NPs可作为联合化疗的有前景载体，兼具可靠疗效与微小副作用。

引言

随着肿瘤综合治疗发展，铂类化合物在多种癌症治疗中占重要地位，其中顺铂（CDDP）临床应用最广。目前CDDP联合肿瘤免疫治疗对非小细胞肺癌（NSCLC）等恶性肿瘤仍显示良好效果。然而化疗药物往往以不可接受的毒性为代价实现抗肿瘤活性，因此寻找能降低毒性、增强化疗疗效的治疗药物一直是研究热点。四环素（Tet）属双苄基异喹啉生物碱，对化疗增敏效果满意。前期工作证实Tet与CDDP联用通过抑制切除修复交叉互补组1（ERCC1）、胸苷酸合成酶（TS）、β-微管蛋白III等化疗相关基因表达，呈现显著协同抗癌活性。但Tet临床应用受其水溶性差、口服生物利用度低限制。此外，亲水性CDDP易分布于细胞外基质（ECM），疏水性Tet穿透脂质膜经细胞转运，两药难以真正协同作用。因此亟需寻找能同时高效递送两药的途径，在减少副作用前提下提高抗肿瘤效果。

纳米技术近年进展为癌症诊疗提供新思路。两亲性共聚物构建的纳米颗粒（NPs），特别是聚乙二醇（PEG）修饰的NPs，能减少血清蛋白吸附、避免网状内皮系统（RES）摄取。载疏水药物时可巧妙增加溶解度，延长并增加药物在血液循环和肿瘤部位的滞留。随着共聚物NPs临床应用，其生物相容性备受关注。例如近期发现某些注射用二氧化钛、二氧化硅、金纳米颗粒在动物模型中加速癌细胞血管内渗出和外渗。由生物相容性好、安全性高的纳米材料（特别是FDA批准材料）制备的NPs是更好的药物载体候选者。

前期已构建CDDP负载NPs和基于PEG-PCL的Tet负载NPs，两者体内抗肿瘤效果均获验证。本研究采用PEG-PCL实现CDDP与Tet共递送。近中性电荷的PEG形成NPs亲水性外壳，隐藏抗原表位、防止免疫反应。荧光显微镜证实细胞可同时摄取NPs递送的亲水和疏水药物。体外研究不仅在不同肿瘤细胞系，而且在肿瘤组织上均显示CDDP-Tet NPs抑制肿瘤生长优于游离药物。体内研究观察到NPs组抗肿瘤疗效增强、副作用减轻。此外，¹⁸FDG-PET/CT成像显示NPs组肿瘤代谢率最低，表明CDDP-Tet NPs具有延缓肿瘤生长能力。

材料与方法

试剂与细胞

CDDP（分子式PtCl₂(NH₃)₂）购自山东博源制药有限公司。四环素（分子式C₃₈H₄₂N₂O₆）以粉末形式（纯度>98%）购自江西宜博医药开发公司。甲氧基聚乙二醇[MePEG；重均分子量(Mw)=4 kDa；南京威尔化工有限公司]经甲苯共沸蒸馏脱水，50°C真空干燥12小时后使用。ε-己内酯（ε-CL；Aldrich, 美国）经CaH₂干燥后减压蒸馏纯化。聚乙烯醇（PVA；聚合度=500，醇解度=88%；上海东仓国际贸易有限公司）和辛酸亚锡（分子式SnCl₂）（Sigma）开封即用。RPMI 1640培养基（Gibco, 美国）、小牛血清（兰州民海生物工程，中国）、二甲基噻唑基-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT；Amersco, 美国）开封即用。

人高分化胃癌细胞系MKN₂₈、人结直肠腺癌细胞系LoVo、人宫颈癌细胞系Hela、小鼠肝癌细胞系H₂₂购自上海细胞生物学研究所。所有细胞系于含10%牛血清、青霉素（100 U/mL）-链霉素（100 g/mL）、丙酮酸、谷氨酰胺、胰岛素的RPMI 1640培养基中培养（37°C, 5% CO₂，水饱和大气）。

共聚物合成

按前文描述，mPEG-PCL和HO-PCL共聚物通过开环共聚合合成。简述：预定量ε-CL加入含PEG和少量辛酸亚锡（0.1% wt/wt）的聚合管，接真空系统密封，130°C油浴反应48小时。HO-PCL合成类似但无需干燥PEG。聚合完成后，粗产物氯仿溶解后沉淀于过量冷甲醇中除去未反应单体和低聚物，过滤、水洗数次、减压彻底干燥。

CDDP-Tet负载纳米颗粒制备

预定量CDDP和Tet采用双乳液法（DE）制备负载NPs。CDDP和Tet与1 mL含5 mg mPEG-PCL和15 mg HO-PCL的二氯甲烷（DCM）溶液乳化，冰浴超声15秒（15 W）得溶液W1。加入4 mL 3%（w/v）PVA溶液W2，超声30秒形成W1/O/W2双乳液。双乳液稀释至50 mL 0.3%（w/v）PVA水溶液，真空蒸发DCM。收集所得NPs，洗涤、冻干（图1）。

药物负载量与包封率

冻干CDDP-Tet负载NPs粉末溶于二甲基甲酰胺（DMF），30 μL该溶液与30 μL 2 mmol/L HCl混合，再加入2.94 mL 0.2 mmol/L SnCl₂（2 mmol/L HCl配制）溶液。1小时后用Shimadzu UV-1205分光光度计（京都，日本）403 nm处测吸光度，结合标准曲线计算NPs中药物总量。药物负载量（%）和包封率（%）分别按式（1）、（2）计算：

药物负载量（%）= NPs中药物重量 / NPs重量 × 100%

包封率（%）= NPs中药物重量 / 投料药物重量 × 100%

纳米颗粒体外细胞毒性与生物相容性研究

细胞摄取研究

基于前期工作，LoVo细胞接种于6孔板盖玻片上（约5×10⁵ cells/孔），37°C, 5% CO₂培养24小时。加入含罗丹明B（21 μg/mL）的NPs孵育2小时，4°C和37°C PBS各洗3-4次。盖玻片上LoVo细胞置于荧光显微镜下观察。

细胞毒性实验

采用标准MTT法测定药物体外细胞毒性，用MKN28和H₂₂细胞系。简述：96孔板接种细胞5000 cells/well，24小时后暴露于系列浓度游离CDDP、游离Tet、游离CDDP+Tet及CDDP-Tet负载NPs。孵育后每孔加20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续孵育4小时，活细胞将黄色MTT转化为深蓝甲瓒结晶，200 μL DMSO溶解，酶标仪（ELX800 Biotek, 美国）以490 nm测试波长、630 nm参比波长测光密度（OD）。细胞活率（%）= OD（测试孔）/ OD（参比孔）× 100%。空白NPs体外相容性同样用MKN₂₈和H₂₂细胞系经MTT法测定。所有MTT实验至少重复3次独立实验，每次三重复。

凋亡实验

采用Annexin V-FITC试剂盒（Bender MedSystem, 美国）检测细胞凋亡率变化。MKN₂₈细胞接种于6 cm培养皿24小时。分别更换含1 μg/mL游离CDDP、1 μg/mL CDDP负载NPs、200 μg/mL空白NPs的培养基，对照组换无药物培养基。培养48小时后加酶，收集细胞，PBS洗涤2次，100 μL缓冲液重悬。依次加入Annexin V 5 μL和PI 1 μL，混合，避光室温静置15分钟。加入400 mL缓冲液，经流式细胞仪（BD FACS CantoTM, 美国）分析细胞凋亡率。

组织培养药物反应实验（HDRA）

按前期研究实施HDRA。雄性ICR小鼠双侧腋下皮下接种4-6×10⁶ H₂₂细胞悬液。肿瘤长至400-600 mm³时颈椎脱位处死，取新鲜标本，生理盐水洗涤两次，浸入Hank's液，切成约15 mg小块。组织块置于24孔板，孔内预置浸泡含20%胎牛血清、阿米卡星硫酸盐（100 IU/mL）RPMI 1640培养基的1 cm方形明胶海绵。加入游离CDDP或两种不同浓度CDDP负载NPs。4个肿瘤标本不加药物作对照。37°C, 5% CO₂培养7天。加入I型胶原酶（100 μL, 0.6 mg/mL）和MTT（100 μL, 5 mg/mL）混合液（100 mg/mL琥珀酸钠配制），再孵育24小时，1 mL DMSO提取MTT甲瓒，各孔取100 μL转移至96孔板，酶标仪490/630 nm测OD。组织活率（%）= [OD（测试）/ 重量（测试, mg）] / [OD（对照）/ 重量（对照, mg）] × 100%。

体内抗肿瘤疗效

肿瘤体积测量

体重18-20 g雄性ICR小鼠皮下接种H₂₂细胞系建立模型，SPF级饲养，符合鼓楼医院动物护理委员会指南。左腋下皮下注射0.2 mL含4-6×10⁶ H₂₂细胞悬液。随机分6组：对照组（生理盐水）、空白NPs组、游离CDDP（3 mg/kg）组、游离CDDP+Tet（CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg）组、CDDP-Tet负载NPs（CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg）组。每组6只。植瘤7-8天后开始给药，记为"Day 0"。给药时称重调整剂量，此后隔日称重。

免疫荧光实验

治疗第21天取对照组、游离CDDP+Tet组、CDDP-Tet NPs组肿瘤组织作组织学观察。肿瘤解剖、10%中性缓冲福尔马林固定、常规石蜡包埋、5 mm切片。经DAPI（蓝）和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL，绿）染色后，蔡司LSM510 Meta共聚焦显微镜观察。

¹⁸FDG-PET/CT成像

游离CDDP+Tet组和CDDP-Tet负载NPs组小鼠治疗第6天行PET/CT成像。示踪剂注射前禁食4小时。经尾静脉注射14.8 MBq（400 μCi）¹⁸F-FDG。Jemini JXL PET/CT扫描仪（Philips, 美国）采集图像。注射¹⁸F-FDG 45分钟后获取高分辨率PET图像及同视野CT图像。基于CT数据进行PET衰减和散射校正，厂商软件自动融合图像。获取肿瘤最大FDG摄取值计算标准摄取值（SUV），校正体重和注射活度。

统计学方法

数据采用Student's t检验分析。数据以均值±SD表示，P<0.05为统计学显著差异。

结果

共聚物合成与表征

按前期研究，以PEG-PCL与HO-PCL最佳比例1:3合成NPs。最佳PEG-PCL共聚物NPs直径、多分散指数、数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）见附件Table S1。CDDP和Tet共载时药物负载量和包封率亦测定（附件Table S2），与单载CDDP的PEG-PCL共聚物NPs相似。但Tet负载量和包封效率低于单载Tet的PEG-PCL共聚物NPs，可能与HO-PCL成分有关。

动态光散射（DLS）测定CDDP-Tet负载PEG-PCL共聚物NPs直径为359.1±5.3 nm，多分散指数约0.231。TEM和AFM观察（附件Fig S1a, S1b）显示NPs呈规则球形，尺寸与DLS数据一致。NPs内分散微小液滴，证实双乳液结构确实形成。

CDDP-Tet负载NPs细胞摄取

荧光染料负载NPs常用于探究细胞摄取，实现可视化实时检测。前期证实染料负载NPs经内吞进入细胞。本研究罗丹明B亲水、可在PI荧光通道检测，模拟CDDP；香豆素-6疏水、信号可在FITC荧光通道接收，模拟Tet。LoVo细胞与负载罗丹明B和香豆素-6的NPs共孵育2小时后，荧光显微镜和光学透镜（200×）检测。图2显示PI荧光通道、FITC荧光通道、PI/FITC双荧光通道均检测到荧光信号。结果证实NPs能同时携带香豆素-6和罗丹明B进入肿瘤细胞，推断CDDP和Tet可同载于NPs并被肿瘤细胞同步摄取。

纳米颗粒体外细胞毒性

胃癌细胞系MKN28中对比游离CDDP、游离Tet、游离CDDP+Tet、CDDP-Tet负载NPs细胞毒性。Tet浓度为CDDP的2.4倍。图3显示CDDP-Tet负载NPs细胞毒性最强。随浓度增加，游离Tet与NPs组差异及三个游离药物组差异均显著。人宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞H₂₂观察到类似结果（附件Fig S2a, S2b）。

空白NPs毒性研究前期已做。前期研究显示空白NPs对肿瘤细胞系毒性极低，生物相容性良好。

CDDP-Tet负载NPs体外凋亡分析

检测1 μg/mL游离CDDP、2.4 μg/mL游离Tet、游离CDDP+Tet（1+2.4 μg/mL）、CDDP-Tet负载NPs（1+2.4 μg/mL）对MKN28细胞共培养48小时后凋亡率影响。凋亡率计为Q2+Q4（图4所示）。游离CDDP+Tet、游离CDDP、游离Tet三组凋亡率变化相似（图4a-c）。但CDDP-Tet负载NPs诱导MKN28凋亡率显著高于其他三组（图4d）。

组织培养药物反应实验（HDRA）

为更全面评价NPs抗肿瘤效果，用HDRA考察游离CDDP、游离CDDP+Tet、CDDP-Tet负载NPs对H₂₂细胞系抗肿瘤效果。HDRA作为预测化疗敏感性的临床方法，比细胞学实验更真实模拟肿瘤组织实际条件，其结果受药物渗透、细胞外pH、间质液压力等肿瘤微环境和微结构影响。

Tet浓度为CDDP的2.4倍。图5显示最低浓度下游离CDDP+Tet组抗肿瘤效果优于单用CDDP，随药物浓度增加效果趋同。与凋亡分析一致，CDDP-Tet负载NPs在所有测试浓度下抗肿瘤效果显著优于其他两组。

体内抗肿瘤疗效分析

疗效与副作用评价

H₂₂细胞系成瘤小鼠模型分别给予3 mg/kg游离CDDP、游离CDDP+Tet（CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg）、CDDP-Tet负载NPs（CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg）治疗。给药12天后取瘤，每2天测肿瘤大小确定最佳药物递送含量。肿瘤生长曲线（图6）显示：对照组和空白NPs组生长趋势相似，其余三给药组均显著抑制肿瘤。前6天游离CDDP+Tet组优于游离CDDP组，但6天后差异缩小，10天后游离CDDP+Tet甚至效果更差。

前6天游离CDDP+Tet组与CDDP-Tet负载NPs组抗肿瘤效果相似。因此CDDP-Tet负载NPs组自第6天起显示更优抗肿瘤疗效。附件Figure S3a显示各组肿瘤大小差异，NPs组肿瘤体积最小，直观反映显著抗肿瘤效果。除肿瘤抑制外，与游离CDDP或游离CDDP+Tet组相比，NPs组肿瘤表面血管较少。附件Figure S3b显示NPs组血管密度相对对照组和游离CDDP+Tet组最低。

为进一步研究体内肿瘤组织凋亡细胞比例，行TUNEL实验检测凋亡细胞。图7显示肿瘤凋亡细胞经绿色荧光染色指示凋亡。合并图像显示对照组和游离CDDP+Tet组绿色荧光区域较少，凋亡细胞较少；CDDP-Tet NPs组观察到大量绿色荧光区域，表明大量凋亡细胞。结果证实CDDP-Tet NPs可体内促进肿瘤凋亡。

除抗肿瘤疗效优于游离CDDP和游离CDDP+Tet组外，CDDP-Tet负载NPs副作用也更小。图8a显示游离CDDP和游离CDDP+Tet导致小鼠体重显著下降（vs对照组），提示直接给药毒性。空白NPs组体重变化与对照组相似，提示空白NPs毒性可忽略。NPs组与对照组体重前6天相当，第6-12天NPs组体重略低于对照组但高于游离CDDP或游离CDDP+Tet组。值得注意的是游离CDDP+Tet组前4天导致明显体重下降和食欲减退，提示药物吸收损害全身。相反，CDDP-Tet负载NPs在组织中缓慢释放、维持稳定浓度，副作用显著低于直接给药。肝脏活检进一步评价副作用（图8b）。与对照组相比，双药游离药组肝细胞界限模糊，部分肝细胞气球样变、细胞体缩小、核浓染、嗜酸性增加（黄箭头）；双药NPs组干细胞结构正常、细胞间隙清晰、无明显病理改变。提示NPs递送造成损伤极小。

PET-CT成像

为更好比较各组体内治疗效果，小鼠治疗第6天行CT、PET/CT扫描。CT与PET融合图像见图9。PET/CT通过¹⁸FDG摄取检测高效反映代谢变化。CT显示游离CDDP+Tet组和CDDP-Tet负载NPs组肿瘤体积相当（图9a），但游离CDDP+Tet组肿瘤代谢率显著高于NPs组（图9b）。NPs组肿瘤部位强度降低象征肿瘤代谢率差，表明NPs具有延缓肿瘤生长能力。

讨论

考虑肿瘤异质性和复杂性，联合治疗已成临床肿瘤治疗标准策略。但两药简单组合因理化性质和药代动力学差异未必达预期效果。为按协同比例将不同药物递送至肿瘤细胞，本研究设计了联合治疗载体。CDDP亲水、Tet疏水给载药方法带来困难。本研究采用亲水冠层PEG、疏水核PCL的两亲性共聚物。改进双乳液法使Tet定位油相、CDDP定位水相，独特结构赋予NPs同时包封Tet和CDDP形成NPs的能力，两药定位于NPs不同层，实现低干扰、高稳定性。

共载CDDP和Tet的联合治疗载体可增强CDDP-Tet联合疗效。不仅细胞实验，HDRA实验中CDDP-Tet NPs显著抑制肿瘤组织活力，验证考虑肿瘤微环境模型下NPs抗肿瘤效果。体内研究肿瘤体积变化显示CDDP-Tet NPs有效抑制肿瘤生长、降低增殖水平。¹⁸FDG-PET/CT成像显示CDDP-Tet组肿瘤葡萄糖代谢受抑制更显著、更早，通过诱导更高肿瘤凋亡水平实现，免疫荧光实验证实。与游离CDDP+Tet相比，CDDP-Tet NPs起效更快更安全，可用三机制解释：

首先，作为脂溶性药物，Tet难以在ECM分布、难以扩散至肿瘤细胞周围。定位于NPs油相使Tet获得更好溶解度和生物利用度，与CDDP以相同协同比例到达肿瘤部位。此外，CDDP原有全身副作用，经纳米颗粒载运后易从渗漏肿瘤血管进入肿瘤组织间质，因淋巴引流不足产生的压力滞留于肿瘤内。肿瘤组织保留CDDP越多，正常器官损伤越小。被动靶向策略使CDDP-Tet NPs比游离CDDP+Tet安全得多，小鼠体重变化和肝脏活检可观察到。

药物耐受是癌症治疗最大挑战之一，不仅因单细胞水平基因改变，也因肿瘤组织和微环境。一方面Tet碱性，在酸性肿瘤微环境中质子化而难以穿越带负电肿瘤细胞膜，即pH诱导的生理药物耐受。另一方面实体瘤血管间距大、间质液压力高限制CDDP和Tet分布。纳米载体载运使Tet经内吞进入肿瘤细胞、不受肿瘤微环境影响，克服pH诱导生理药物耐受。纳米载体小尺寸使其进入肿瘤血管并在体内优先富集于肿瘤部位。

总之，本研究展示了同时递送化疗药物与化疗增敏剂的典型案例。纳米载体使两药被动靶向肿瘤部位、降低全身毒性。此外，NPs通过帮助增敏剂更多、更快进入肿瘤细胞，为生理药物耐受提供解决方案，在提高肿瘤化疗疗效中发挥重要作用。因此认为PEG-PCL嵌段共聚物NPs可作为联合化疗的有前景载体。

结论

基于前期研究，本文探讨PEG-PCL/HO-PCL NPs递送理化性质不同的两药联合应用。体外研究显示NPs具有优异抗肿瘤效果和良好生物相容性。体内研究肿瘤体积变化和¹⁸FDG-PET/CT成像观察到增强抗肿瘤疗效。NPs组小鼠副作用减轻。体内外均证实NPs促进肿瘤细胞凋亡。总之，该嵌段共聚物NPs可作为顺铂-四环素联合及其他联合给药的有前景载体，实现增强抗肿瘤效果和降低毒性，用于癌症治疗。