超声增强多功能纳米颗粒：转移性乳腺癌成像与协同治疗新平台

摘要

乳腺癌转移严重影响预后。声动力疗法（SDT）凭借深穿透、无创优势展现治癌潜力。为克服单一疗法局限，构建多功能纳米平台实现协同治疗。本研究开发新型多功能纳米系统，采用精心设计的PLGA核壳结构封装氯化钆（Ce6，用于SDT）、全氟戊烷（PFP，用于超声成像）和多西他赛（DTX，用于化疗）。所得Ce6/PFP/DTX/PLGA纳米颗粒（CPDP NPs）具备优异生物相容性和稳定性。低强度聚焦超声（LIFU）照射下，可实现体外和体内增强超声成像。结合LIFU，纳米颗粒通过Ce6诱导细胞毒性活性氧（ROS）及DTX释放产生协同治疗效应，显著减少肺转移结节。结果表明，结合化疗的SDT导向纳米平台是提升协同治疗效果、抑制乳腺癌肺转移的有前景策略。

引言

乳腺癌作为威胁女性健康的恶性肿瘤，因高异质性和高转移能力，远端转移占死亡率90%以上，晚期患者5年生存率仅26%，临床预后差。手术和化疗虽有效，但化疗药物多西他赛（DTX）虽为治疗转移性和晚期乳腺癌的一线药物，通过破坏有丝分裂和细胞增殖发挥抗肿瘤作用，却伴随全身毒性副作用，限制疗效。单一疗法难以满足不同分期和个体条件下的治疗需求，亟需降低毒副作用并增强DTX疗效。

超声因无辐射、无创、性价比高先用于临床诊断，近年结合纳米材料在治疗领域获关注。声动力疗法（SDT）利用超声触发空化和“声穿孔效应”产生ROS，诱导癌细胞DNA损伤和凋亡。与光动力疗法（PDT）浅表应用不同，SDT配合低强度聚焦超声（LIFU）治疗深部肿瘤效果更佳，且能避免热损伤。氯化钆（Ce6）作为第二代卟啉家族成员，因优异的ROS生成能力和肿瘤亲和性，可作为声敏剂应用。但单独使用Ce6存在稳定性差和皮肤光毒性问题，限制SDT应用。

纳米技术在生物传感、环境污染治理等领域发挥重要作用。纳米颗粒具有尺寸小、比表面积大、内扩散阻力小等优势，广泛应用于MOF、二氧化钛、石墨烯等材料。纳米技术与癌症治疗结合为联合治疗策略铺平道路。精心设计的纳米颗粒利用增强渗透和滞留效应（EPR效应）提高化疗药物在肿瘤部位富集，降低副作用。全氟戊烷（PFP）在照射下可液-气相变，作为新型超声分子探针用于超声成像和治疗，初始液态便于封装，且封装PFP能避免微米级微泡尺寸限制，借助EPR效应增强肿瘤部位超声成像。多疗法联合在纳米系统癌症治疗中价值巨大，SDT与化疗结合已被验证能革新传统疗效。Xu等人证实SDT可增强化疗药物疗效，激活线粒体靶向肿瘤细胞凋亡，揭示协同治疗模式。

基于上述启发，本研究构建一体化纳米颗粒（CPDP NPs），建立诊疗一体化系统：以PLGA为外层材料，利用其优异安全性和代谢稳定性；PFP经LIFU触发相变增强超声成像；Ce6作为理想二代声敏剂在LIFU下诱导ROS生成；配合DTX释放实现化疗与SDT协同治疗。核壳结构确保给药稳定、不损伤正常组织，提高封装效率，保护内含物（特别是PFP有效液-气转变）。该协同策略：一、有效封装降低DTX副作用，缓解恶性肿瘤治疗痛苦；二、SDT联合化疗显著增强治疗效果；三、PFP增强超声成像优化诊断并验证抗肿瘤疗效；四、系统安全稳定、生物相容性好。体外体内实验均证实肺转移和肿瘤生长显著抑制，结合超声成像能力，有望成为临床应用的有前景治疗策略。

材料与方法

材料

PLGA-COOH（Mw 12,000 Da）购自济南大刚生物材料（中国）。全氟戊烷（PFP）和琼脂糖购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。氯化钆（Ce6）购自美罗制药（中国大连）。CCK-8细胞毒性检测试剂盒购自Dojindo分子技术（日本东京）。2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）购自MedChemExpress（美国新泽西）。碘化丙啶（PI）购自索莱宝科技（中国北京）。Annexin V-FITC/PI购自BD Biosciences（美国）。多西他赛（DTX）购自MedChemExpress（美国新泽西）。其他试剂均为分析纯。RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco（ThermoFisher，美国），紫外分光光度计（UV-Vis，日立，日本）。

CPDP NPs合成

采用W/O/W双乳液法制备Ce6-PFP-DTX/PLGA纳米颗粒（CPDP NPs）。简述：2 mg Ce6溶于500 μL甲醇；50 mg PLGA-COOH和2 mg DTX溶于4 mL二氯甲烷，加入上述Ce6溶液；再加入200 μL PFP。超声探针（Sonics & Materials，美国）乳化得第一乳液（5 s开/5 s关，3 min）。加入8 mL 4%聚乙烯醇（PVA）水溶液，同探针乳化2 min得第二乳液。加入10 mL 2%异丙醇，室温机械搅拌≥4 h挥发二氯甲烷。12,000 rpm离心3次（每次5 min）收集CPDP NPs，4°C保存。PDP NPs制备同法但不加Ce6。全程冰上操作、避光进行。

CPDP NPs表征

马尔文Zetasizer Nano测定粒径和Zeta电位。透射电镜（TEM）和光学显微镜表征形貌。CPDP NPs分散于磷酸缓冲液（PBS）中测量7天粒径变化评估稳定性，每样品三次测量。封装效率计算公式：封装效率(%) = (载药量/总投料量) × 100%。紫外-可见光谱（UH5300，日立）验证各组分封装，TEM进一步分析。

药物释放速率

采用pH 7.4（PBS）和pH 5.6（乙酸缓冲液，ABS）两种缓冲液测定Ce6和DTX累积释放。CPDP NPs分散于1 mL PBS或ABS后封入透析袋（Mw: 10,000），置于含149 mL同缓冲液的玻璃瓶中（总体积150 mL），37°C恒温振荡。不同时间点（0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h）取样并等量补充新鲜培养基，各组重复3次。Synergy Hybrid多模式酶标仪（BioTek，美国）分别在403 nm和229 nm测定Ce6和DTX浓度，计算各时间点释放率。

体外超声成像

CPDP NPs乳液（1 mg/mL）经LIFU换能器（荣海超声医学工程研究中心，中国重庆）照射，50%占空比，1 s脉冲宽度，不同强度（1-2 W/cm²）不同时间。照射后加入预制琼脂糖模型，飞利浦EPIQ5超声诊断仪（探头频率12 MHz，MI: 0.06）观察2D和CEUS成像，ImageJ软件分析灰度值。

细胞摄取与LIFU诱导ROS生成

小鼠乳腺癌细胞系4T1（中国科学院上海细胞库）于RPMI 1640含10% FBS、1% 双抗，37°C、5% CO₂培养。细胞爬片培养（1×10⁴ cells/dish）不同时间（1, 2, 4, 8 h）共孵育，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察摄取情况。ROS检测分5组：对照、CPDP NPs、LIFU、Ce6+LIFU、CPDP NPs+LIFU。常规培养24 h后更换含CPDP NPs（200 μL, 0.8 mg/mL）或Ce6溶液（200 μL）培养基，共孵育3 h。按分组施行LIFU照射（2 W/cm², 120 s）。共孵育及LIFU处理后加入100 μL稀释DCFH-DA溶液，原培养箱孵育15 min。CLSM确认ROS生成，ImageJ分析荧光强度。

体外细胞毒性与协同治疗能力

CCK-8法评估CPDP NPs细胞毒性。4T1细胞接种96孔板（1×10⁴/孔）24 h，CPDP NPs用无血清培养基稀释至不同浓度（0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 mg/mL, n=3），有无LIFU照射（2 W/cm², 120 s），再共培养24 h测定细胞活力。

流式细胞术评估协同治疗凋亡效率。4T1细胞常规培养24 h分5组：(1) 对照，(2) 仅LIFU（2 W/cm²），(3) 仅CPDP NPs（0.8 mg/mL），(4) PDP NPs+LIFU，(5) CPDP NPs+LIFU。纳米颗粒共孵育（200 μL）及LIFU照射后，Annexin V（5 μL）和PI（5 μL）双染色20 min，流式细胞术分析。

体外细胞转移抑制

划痕实验和Transwell实验考察转移抑制。划痕实验：6孔板培养4T1至80%融合度，10 μL枪头制造中轴线划痕，按上述5组处理，持续共孵育24 h，PBS洗涤3次，倒置显微镜（奥林巴斯，日本）观察。Transwell实验：上室铺Matrigel模拟细胞外基质，上室播种1×10⁵ cells/well（无血清培养基），下室加含10% FBS完全培养基，同分组处理24 h，下室细胞多聚甲醛固定、结晶紫染色，光学显微镜（奥林巴斯，日本）观察。

体内超声成像

4周龄雌性BALB/c小鼠和昆明小鼠购自宁夏医科大学实验动物中心。动物实验遵循宁夏医科大学动物福利伦理审查委员会批准指南。BALB/c小鼠右侧腋下皮下接种4T1细胞（1×10⁷/mL）建立移植瘤模型。瘤体长至60-80 mm³时，尾静脉注射CPDP NPs（200 μL, 1 mg/mL）。24 h后瘤部LIFU照射（2 W/cm², 120 s），飞利浦EPIQ5获取2D和CEUS成像，ImageJ分析灰度。

体内协同治疗效果

接种4T1细胞后每2天记录瘤体长宽，体积计算公式：V = 1/2 × 长 × 宽²。瘤体大小和小鼠体重每2天记录，瘤体照片每3天拍摄。瘤体积达60-80 mm³时随机分5组（对照、LIFU、CPDP NPs、PDP+LIFU、CPDP NPs+LIFU, n=3）。除对照组注射200 μL PBS外，其余尾静脉注射各纳米颗粒（200 μL）。24 h后瘤部LIFU照射（2 W/cm², 120 s），每3天重复1次，共18天。测量体重和瘤体积。实验结束处死小鼠，瘤组织行H&E、TUNEL、PCNA染色组织学分析。

体内生物安全性

健康雌性昆明小鼠（n=3）分4组：对照、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL。尾静脉注射CPDP NPs（200 μL），自由饮食饮水无进一步干预。每2天称体重。30天后处死，采血做血常规和生化分析，取心、肝、脾、肺、肾行H&E染色。

体内肺转移抑制

观察肺转移结节数及H&E组织学评估转移抑制效率。小鼠处死后取肺组织固定，拍摄癌结节照片，进一步H&E染色分析。

统计分析

所有测定数据重复3次，以均值±标准差（SD）表示，SPSS 19.0单因素方差分析或Student's t检验，p<0.05为统计学显著差异。

结果

CPDP NPs表征与药物释放效率

双乳液法制备CPDP NPs，同时封装相变材料PFP、声敏剂Ce6和化疗药DTX。分散于PBS或去离子水呈浅灰色。TEM和光学显微镜下CPDP NPs呈均匀球形、清晰核壳结构（图1a,b）。CPDP NPs和PDP NPs平均粒径分别为249.5±77.46 nm和246.6±81.01 nm，平均Zeta电位分别为-18.47±0.55 mV和-3.987±0.66 mV（图1c,d）。粒径保证经EPR效应被动富集肿瘤部位。电位差异主要因Ce6带负电荷。CPDP NPs负Zeta电位意味着较低血浆蛋白吸附，验证纳米颗粒相对稳定。7天内粒径分布维持在249.5-385.1 nm范围（图1e），显示良好稳定性。标准曲线计算得DTX和Ce6封装效率分别为83.84±1.39%和60.54±3.79%。

a TEM（标尺500 nm）和b 光镜图像（标尺20 μm）。c 粒径分布和d Zeta电位。e 7天内粒径分布。f Ce6和g DTX在不同pH下释放率（n=3）。h Ce6、DTX、PFP/PLGA和CPDP NPs的UV-Vis光谱。箭头指示CPDP NPs在Ce6和DTX特征峰处有吸收，证实有效封装。i 两种纳米颗粒TEM对比：PFP/PLGA壳薄核圆（左），CPDP NPs封装Ce6和DTX后壳增厚、核呈椭圆（右）

药物释放曲线（图1f,g）显示，pH 5.5下DTX释放指数较pH 7.4近两倍增，表明酸性肿瘤微环境中可实现合理DTX释放。结果表明精心设计的CPDP NPs可在酸性肿瘤环境中稳定、及时释放化疗药物，且为SDT做好准备。

UV-Vis光谱显示DTX和Ce6分别在229 nm和403 nm有特征吸收峰，PFP/PLGA无峰。CPDP NPs光谱在上述两波长附近呈现相似峰值，其余趋势同PFP/PLGA，证实多组分成功封装（图1h）。TEM进一步验证：PFP/PLGA壳薄核圆，CPDP NPs因封装DTX和Ce6壳层增厚、核呈椭圆（图1i）。

体外超声成像

PFP具优异相变能力，液-气转变不仅助纳米颗粒肿瘤部位聚集，还赋予增强超声成像能力。LIFU触发PFP相变即声滴汽化（ADV）效应。结果显示：LIFU照射前灰度强度较低；随LIFU强度和时间增加，2D和CEUS均呈现增强成像趋势（图2a）。ImageJ声学分析灰度值升高（图2b,c）佐证成像结果。最显著增强出现在LIFU强度2 W/cm²、持续120 s时。证明PFP成功封装于CPDP NPs，较高强度和更长LIFU照射显著提升超声成像能力。

a 不同LIFU强度和时长下的2D和CEUS超声图像。b 2D成像和c CEUS成像对应灰度强度分析（**p<0.01, n=3）

细胞摄取与LIFU诱导ROS生成

CLSM结果（图3）显示CPDP NPs细胞摄取随时间增强，8 h共孵育时聚集最显著。

4T1细胞不同时间摄取CPDP NPs（蓝：DAPI染核，红：DiR标记CPDP NPs，标尺50 μm）

SDT核心机制是生成ROS——一系列单电子还原产物——诱导癌细胞凋亡、抑制增殖。超声照射下声敏剂触发ROS生成，同时释放大量能量。鉴于超声和声敏剂均为SDT必需元素，设计细胞内ROS生成实验比较分组差异。图4a显示：游离Ce6+LIFU组ROS生成可忽略，可能因游离Ce6代谢快导致ROS生成不佳。相反，CPDP NPs+LIFU组荧光强度最强，推测封装Ce6受保护避免代谢，LIFU刺激后释放产生大量ROS。其他组无显著荧光信号（图4b）。

a 不同处理下ROS生成CLSM图像，b 对应荧光强度分析（****p<0.0001, n=3），标尺50 μm

体外细胞毒性与协同治疗能力

CCK-8检测CPDP NPs细胞毒性。无LIFU照射下，24 h共孵育后即使最高浓度（0.8 mg/mL）CPDP NPs对细胞存活率无明显影响，显示良好生物安全性（图5a）。有LIFU照射下，细胞活力显著下降，表明CPDP NPs联合LIFU显著触发4T1细胞死亡，与体外ROS生成结果一致。

a 有无LIFU下不同浓度CPDP NPs相对细胞活力。b 4T1细胞凋亡坏死流式检测，c 对应坏死凋亡率分析（****p<0.0001, ***p<0.001, n=3）

流式细胞术进一步评估SDT疗效。图5b,c显示：CPDP NPs+LIFU组细胞坏死和凋亡指数最高，其他组无显著坏死凋亡。CPDP NPs+LIFU组坏死凋亡率较单独CPDP NPs组高三倍，从侧面确证SDT显著肿瘤杀伤效率。有趣的是，CPDP NPs+LIFU组较PDP NPs+LIFU组坏死凋亡率显著增加，展现SDT与化疗协同治疗效率。

体外细胞转移抑制

肿瘤细胞侵袭迁移能力是肿瘤进展关键。图6a显示：CPDP NPs+LIFU组物理间隙闭合明显宽于其他组，表明迁移速度较慢。ImageJ分析（图6c）证实其迁移率显著降低。

a 划痕实验和b Transwell实验。c 划痕迁移率，d Transwell迁移细胞数（****p<0.0001, n=3）

Transwell实验同样显示：CPDP NPs+LIFU组穿膜细胞数显著减少（图6b），展现协同疗法优异抗迁移能力。无SDT时（仅CPDP NPs或仅LIFU组），肿瘤细胞数仅轻微下降（图6d）。总体而言，SDT联合化疗显著抑制4T1细胞体外转移。

体内超声成像

尾静脉注射CPDP NPs后，瘤部LIFU照射获取2D和CEUS成像（图7a）。两组图像差异明显：LIFU照射后CPDP NPs回波强度显著升高。平均回波强度数据进一步确认（图7b,c），与体外成像结果一致。

a 有无LIFU照射的2D和CEUS图像。b,c ImageJ灰度强度分析（**p<0.01, *p<0.05, n=3）

体内协同治疗效果

图8a,b显示：18天治疗后CPDP NPs+LIFU组瘤体积显著小于其他组，归因于SDT源ROS和化疗药协同效应。瘤体照片（图8a）同步验证协同疗效。各组小鼠体重无显著差异（图8c）。结果均表明CPDP NPs+LIFU组抑瘤率显著更高，协同治疗显著抑制肿瘤生长。

a 18天内不同治疗组瘤鼠图像（n=3）。b 瘤体积分析（**p<0.01）。c 瘤鼠体重变化（ns无显著性，n=3）。d H&E、PCNA、TUNEL染色（标尺200 μm）。e PCNA增殖指数分析。f TUNEL凋亡指数分析（****p<0.0001, n=3）

H&E、PCNA、TUNEL染色进一步验证治疗效果（图8d）。CPDP NPs+LIFU组PCNA增殖指数仅20.50%，较对照组低4倍，较单独LIFU和CPDP NPs组低3倍，较PDP+LIFU组低2倍，显示显著抗增殖效果（图8e）。TUNEL结果显示CPDP NPs+LIFU组凋亡指数达72.86%，远高于对照（9.66%）、LIFU（12.86%）、CPDP NPs（19.59%）和PDP NPs+LIFU（37.06%）（图8d,f）。体内外结果一致，证实协同治疗有效性。

体内生物安全性

除疗效外，纳米制剂生物安全性至关重要。图9a显示：各组小鼠体重非下降反逐渐增加，表明CPDP NPs负面影响可忽略。血常规、生化指标及各脏器H&E染色（图9b,c）在不同浓度组间无显著变化，证实CPDP NPs体内优异生物安全性。

a 不同浓度CPDP NPs下健康昆明小鼠体重变化（n=3）。b 30天内不同浓度CPDP NPs血液生化和常规检查（n=3）。c 同一处理下不同脏器（心、肝、脾、肺、肾）H&E结果（标尺50 μm）

体内肺转移抑制

肺是乳腺癌远端转移主要靶器官。图10a,b显示：与对照、LIFU、CPDP NPs、PDP+LIFU组相比，CPDP NPs+LIFU组肺转移结节数最显著减少，提示优异肺转移抑制效率。H&E染色（图10c）进一步佐证，该协同策略在小鼠模型中有效消除肺转移。

a 肺组织宏观外观。b 不同治疗组肺转移结节数分析（**p<0.01, n=3）。c 肺转移H&E染色（标尺50 μm）

讨论

乳腺癌转移严重影响预后。SDT凭借高效和深穿透能力被广泛认可。但单用声敏剂存在局限，单纯SDT可能不足。纳米技术与临床医学结合近年显著推进，具低毒、无创、生物相容性好等优势。研究者致力开发多功能治疗策略增强抗肿瘤效能。

生物安全性是纳米制剂首要考量。PLGA作为FDA批准材料，是理想载体。本研究构建纳米系统实现多功能治疗，PLGA作外层封装Ce6、PFP和DTX。CPDP NPs核壳结构、适宜粒径保证EPR效应富集。24 h共孵育细胞活力>80%，验证平台安全性。封装PFP相变保证CPDP NPs经LIFU激活作为造影剂，增强超声成像不仅确保理想治疗窗口，更推动精准诊疗一体化。

SDT关键在于ROS生成。对比游离Ce6，PLGA封装Ce6提供理想保护，ROS结果证实：单用Ce6仅产生极少量ROS，纳米封装Ce6产生大量ROS，经SDT疗效进一步验证。结果表明封装保护了Ce6的ROS生成能力，为后续抑瘤奠定基础。药物释放显示pH 5.5下Ce6释放极少（~20%），DTX释放>40%，差异可能源于两药封装效率不同或制备溶剂不同（DTX和PLGA直接溶于二氯甲烷，Ce6先溶甲醇再滴加二氯甲烷）。Ce6微量释放保证其在PLGA中有效保护，LIFU刺激下产生大量ROS获得高效SDT。药物释放率评估与ROS生成结果相互印证。现有研究提示单纯化疗难显著逆转肿瘤进展。本研究纳米平台有力证明：与单纯化疗相比，协同治疗体内外显著提升疗效。LIFU优化治疗策略，显著提高细胞凋亡率。值得注意的是，该协同策略在细胞和移植瘤模型均显著抑制肺转移，与前人报道一致。

结论

综上，本研究设计制备的安全稳定CPDP NPs联合LIFU照射可显著消除乳腺肿瘤进展及肺转移。凭借增强成像能力，该纳米平台亦被视为有前景的临床造影增强剂。因此，结合LIFU的新型协同策略可作为逆转转移性乳腺癌不良预后的有效治疗应用。