加载白藜芦醇的白蛋白纳米颗粒具有延长血液循环和改善生物相容性的高效靶向胰腺肿瘤治疗

背景

胰腺癌是一种破坏性疾病，中位生存期不到 6 个月，5 年生存率仅为 6% [1]。胰腺癌的传统临床治疗方法是手术切除、放疗和化疗[2, 3]。然而，这些方法可能会受到严重副作用的限制，例如切除不完全后癌细胞的扩散，放疗过程中对正常细胞的严重毒性，以及较差的存活率[4]。虽然低靶点效应和高副作用也限制了抗癌药物在化疗中的应用，但越来越多的新型化疗药物正在开发中。除了合成药物外，许多中草药提取物也被发现对某些癌症类型有效。白藜芦醇 (RV) 是一种从葡萄和大豆等植物中提取的天然提取物 [5]，在血小板聚集和抑制血管舒张以及降低血液粘度方面具有广泛的作用 [6, 7]。并且近几十年来，人们还发现它对某些癌症，如肝癌、乳腺癌和卵巢癌有很大的抗癌作用[8, 9]。然而，利用RV作为潜在的抗癌药物在进一步的临床应用中存在一些缺点，如溶解度差、血液循环低和缺乏选择性[4, 10]。

在保护药物结构完整性的前提下，封装策略引起了许多研究人员的兴趣，与传统的“免费”药物相比，封装策略已被证明可以有效克服上述一些缺点[11]。例如，它可以改善溶解度差和生物利用度低、降低快速肾清除率以及增加细胞选择性 [12]。目前，使用了许多封装方法，例如通过脂质体、基于聚合物的纳米粒子、水凝胶和血清白蛋白 [13,14,15,16]。在这些方法中，使用血清白蛋白已成为递送不溶性抗癌药物的最令人兴奋的载体之一。人血清白蛋白 (HSA) 是一种内源性蛋白质，无毒、无免疫原性且具有良好的生物相容性 [17]。它已被广泛用作药物递送的大分子蛋白质载体[18]。因此，HSA 能够提高亲脂性药物的溶解度。此外，表面上功能性羧基和氨基的存在促进了白蛋白纳米颗粒的表面功能化 [19, 20]。例如，通过共价结合，白蛋白纳米粒子的表面可以装饰有荧光染料、目标分子和功能性 RNA [21, 22]。此外，它可以很容易地与亲水性聚合物（如 PEG）进行功能化，以延长血液循环 [23]。

在这项研究中，HSA 用于封装亲脂性 RV 作为纳米药物，该纳米药物通过 PEG“桥”（HRP-RGD NPs）用肿瘤靶向分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）进行表面功能化。制备的 HRP-RGD NPs 表现出良好的体外和体内生物相容性，并延长血液循环。还评估了细胞摄取和体内肿瘤生物分布，以验证其在 PANC-1 细胞中的靶向潜力。此外，在体外和体内研究了 HRP-RGD NPs 的靶向抗癌功效。这些结果表明，HRP-RGD NPs可能是一种多功能的纳米平台，可用于靶向化疗应用的潜在肿瘤治疗药物。

方法

材料

人血清白蛋白（HSA，冻干粉，≥96%），白藜芦醇（RV，≥99%），1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC），异硫氰酸荧光素（FITC），精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD, ≥97%), 3-(2-pyridyldithio) 丙酸 N -羟基琥珀酰亚胺酯 (SPDP)、Hoechst 33258 染料和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 购自 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)。 NH2-PEG2000-COOH 购自 Seebio Biotech Inc.（中国上海）。 N -琥珀酰亚胺S -乙酰硫代乙酸盐 (SATA) 购自 Pierce Biotech Inc. (Rockford, IL, USA)。 DMSO、胰蛋白酶-EDTA溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素溶液和DMEM培养基购自Sigma。

HSA-RV 纳米颗粒的合成

HSA-RV 纳米粒子是通过一种简单的去溶剂化方法合成的 [24]。具体而言，将 6 mg RV 溶解在 DMSO 中至 1 mg/mL，并在轻微搅拌下与 10 mg HSA 混合在 1 mL 水中，在室温下搅拌 6 h 后形成硬化凝聚层，然后通过交叉处理- 与 0.5% 戊二醛 (100 μL) 连接。然后，通过在水中透析 1 天去除有机溶剂，从而产生 HSA-RV 纳米颗粒。如上所述制备空白 HSA 纳米粒子，不同的是不含 RV 的 DMSO 与 HSA 溶液混合 6 小时。

HRP-RGD NPs 的合成和表征

HSA-RV 纳米粒子通过传统的交联剂 SPDP 与 HS-PEG-RGD 结合，如文献 [25] 中所述。简而言之，将 20 mg NH2-PEG2000-COOH 用 2 mg SATA 处理 3 小时并通过脱盐纯化。将得到的 SATA-PEG 添加到 10 毫克 RGD 肽和 8 毫克 EDC 中 3 小时。然后将 SATA 保护的 PEG-RGD 与 1 mL 羟胺在磷酸钠中反应 3 小时。通过脱盐纯化后，得到 HS-PEG-RGD。接下来，获得的 HS-PEG-RGD 通过二硫键与 HSA-RV 纳米颗粒结合。简而言之，HSA-RV 纳米颗粒的氨基首先被 SPDP 激活，然后重新悬浮在 10 mL PBS 中，并与过量的 HS-PEG-RGD 或 HS-PEG 反应 24 小时。得到的溶液用 PBS 重复洗涤，并通过 Millipore 过滤器 (100 kDa) 过滤以去除任何剩余的 PEG-RGD 和其他有机溶剂，从而产生 HRP-RGD NP。通过扫描电子显微镜（SEM，Philips XL-30 FEG，Eindhoven，Netherlands）和 Zetasizer Nano ZS 系统（Malvern Instruments，Malvern，UK）分别检测纳米颗粒的形态和尺寸。通过紫外-可见分光光度计（UV1800，Shimadzu，Japan）获得吸收光谱。荧光光谱由荧光光谱仪（F-4500，Hitachi，Japan）记录。

药物加载和释放

将 6 毫克 RV 溶于 DMSO 至 1 毫克/毫升，并在轻微搅拌下与 10 毫克 HSA 混合在 1 毫升水中，室温下搅拌 6 小时后形成硬化凝聚层，然后进行交联处理0.5% 戊二醛 (100 μL)。然后，通过在水中透析 1 天去除有机溶剂和游离 RV。透析液用于根据校准曲线通过紫外-可见分光光度计在 306 nm 处量化游离 RV。 HRP-RGD NPs中的药物量为添加的RV总量减去游离RV的量。

HRP-RGD NPs 的 RV 释放是通过动态透析技术（透析袋的截止 Mw 为 8-12 kDa）在 pH 5.0、7.4 和 9.0 PBS 下分别在 37°C 下检测到的。使用标准校准曲线计算药物浓度。封装效率 =W 1/W 2 × 100%，其中 W 1 代表 RV 在 HRP-RGD NPs 中的权重，W 2是添加的RV重量。累积释放 =W a/W b × 100%，其中 W a 代表释放的 RV 量，W b 是 HRP-RGD NPs 中存在的总 RV。

体外溶血分析

如先前工作中所述进行体外溶血测定[26]。具体而言，将 0.2 mL 红细胞（RBC，在 PBS 中）与 0.8 mL HRP-RGD NP（在 PBS 中）以预定浓度（10、50、100 和 200 μg/mL）混合。用去离子水或 PBS 孵育的红细胞分别设置为阳性或阴性对照。在 37°C 下孵育 3 小时后，将上述悬浮液组以 10,000 rpm 离心 1 分钟，并通过紫外-可见分光光度计监测 541 nm 处的上清液的吸光度。溶血率 =(ODt − ODnc)/(ODpc − ODnc) × 100%，其中ODt、ODpc、ODnc分别为供试品、阳性对照和阴性对照上清液的吸光度。

细胞培养

人胰腺肿瘤 PANC-1 细胞购自中国科学院典型培养物保藏中心细胞库（中国上海），在加湿培养箱（5% CO2) 在 37°C。

细胞摄取

对于细胞摄取，FITC 用于标记 HRP-RGD NP。 PANC-1 细胞粘附在 6 孔板的载玻片上，并分别与 HRP NP、HRP-RGD NP + 游离 RGD 封闭和 HRP-RGD NP 以相同浓度的标记 FITC 孵育 5 小时。然后，将细胞用 PBS 洗涤三次并用 0.2 mL 戊二醛固定，然后用 DAPI 染色 10 分钟。激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SP8 CARS，Wetzlar，Germany）捕获细胞荧光图像。

此外，通过使用流式细胞术（FCM、FACSCalibur、FACSCanto II）分析了 PNAC-1 细胞在相同浓度标记 FITC 下的 HRP NPs、HRP-RGD NPs + 游离 RGD 阻断和 HRP-RGD NPs 的摄取率通过测量 FITC 荧光。每次 FCM 分析都记录了数万个细胞。 FITC荧光由488nm激光激发。

体外细胞毒性

RV 载体 HP-RGD NPs 的细胞毒性通过使用标准细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定（Bestbio，China）进行。 PNAC-1 细胞 (1 × 10 ⁵ 细胞/毫升，0.5 毫升）接种在 96 孔板中并培养 24 小时。丢弃旧培养基后，将含有 10、50、100 和 200 μg/mL HRP-RGD NP 的新鲜培养基与 PNAC-1 细胞一起孵育 24 小时。 PBS温和洗涤细胞3次。然后将 100 μL CCK-8 工作溶液（10% CCK-8 + 90% DMEM）添加到每个孔中，然后在 37°C 下孵育 0.5 小时。使用酶标仪（Infinite 200 Pro，Tecan，Austria）检测 450 nm 处的吸光度值。此外，通过上述 CCK-8 测定评估了具有相同 RV 浓度的 RV（溶于 DMSO）、HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 对 PNAC-1 细胞的体外抗癌功效。所有实验均分四次进行。此外，通过Hoechst 33258染色检测细胞凋亡的形态学检查。激光扫描共聚焦显微镜观察并记录Hoechst 33258在细胞内的荧光。

动物模型

Balb/c 裸鼠，4-5 周，购自 Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd.（中国上海）。所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并经泰山医科大学实验动物管理办公室批准。通过注射1 × 10 ⁶ 建立小鼠右背部皮下移植瘤模型 每只小鼠的 PNAC-1 细胞，当肿瘤体积约为 80 mm ³ , 这些小鼠被随机分成不同的组 (n =5) 进一步使用。

血液循环和肿瘤生物分布

正常小鼠静脉注射RV、HRP NPs和HRP-RGD NPs。之后，在不同时间从眼眶丛收集血液样本。每个血样溶解在 900 μL 裂解缓冲液中。血液中 RV、HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 的浓度通过紫外-可见分光光度计通过每个溶解血样的 RV 吸收光谱确定。样品浓度定义为每克组织注射剂量的百分比（ID%/g）。

在荷瘤小鼠中进行肿瘤中的生物分布。分别在静脉注射 RV、HRP NP 和 HRP-RGD NP 后 24 小时称重肿瘤组织并用王水溶液消化过夜。 RV、HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 在肿瘤中的浓度通过紫外-可见分光光度计通过每个溶解的肿瘤组织的 RV 吸收光谱确定。样品浓度定义为每克组织注射剂量的百分比（ID%/g）。

体内抗癌功效

不同组小鼠静脉注射生理盐水、RV、HRP NPs和HRP-RGD NPs（剂量等于RV，n =5, 10 mg/kg)。在治疗过程中，每 3 天监测一次荷瘤小鼠的肿瘤大小和体重。肿瘤体积的计算公式为：V =(长×宽 ² )/2。相对肿瘤体积 =V /V 0，其中 V 0为初始治疗前的肿瘤体积。

组织学检查

不同组的健康Balb/c裸鼠静脉注射生理盐水（对照）、RV、HRP NPs和HRP-RGD NPs（剂量等于RV，n =5, 5mg/kg)。 35天后，处死小鼠并收集心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏。获得的主要器官用4%多聚甲醛固定过夜。然后，将这些器官在 25% 的蔗糖中脱水，切成 5 μm 的切片，并用苏木精和伊红 (H&E) 染色。染色切片在倒置相差显微镜下成像。

结果与讨论

HRP-RGD NPs 的合成和表征

根据一种简单的去溶剂化方法 [24]，RV 被 HSA 包裹，产生 HSA-RV 纳米颗粒。之后，HSA-RV 纳米粒子的表面通过传统的交联剂 SPDP [25] 与 HS-PEG-RGD 共价官能化，形成纳米复合 HRP-RGD NPs。 HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 显示出单峰和窄粒度分布（图 1a、b）。在 HRP NPs 表面结合 RGD 后，纳米颗粒的平均尺寸从 113 ± 3.1 nm 增加到 120 ± 2.6 nm。此外，HRP NPs和HRP-RGD NPs表现出均匀分散的球形形态（图1c，d）。

HRP NPs 的粒径分布 (a ) 和 HRP-RGD NPs (b ）。 HRP NPs 的 SEM 图像 (c ) 和 HRP-RGD NPs (d )

使用 UV-Vis 和荧光光谱来确认 HRP-RGD NP 中 RV 的存在。如图 2a 所示，HRP NP 和 HRP-RGD NP 在 304 nm 处具有 RV 的吸收峰，表明两种纳米颗粒中都存在 RV。此外，HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 在 325 nm 激发波长处显示出 RV 荧光信号，这与 RV 的荧光光谱一致（图 2b）。这些结果表明RV在与HRP NPs和HRP-RGD NPs结合后保留了其光学特性。

一 游离 RV、HRP NP 和 HRP-RGD NP 的吸收光谱。 b 游离RV、HRP NPs和HRP-RGD NPs的荧光光谱

RV 加载和释放

图 3a 显示了随着 RV 浓度的增加，RV 在 HRP-RGD NPs 中的包封效率变化曲线。获得的 HRP-RGD NP 的最大 RV EE 为 62.5 ± 4.21%。此外，如图 3b 所示，与在 pH 6.5、pH 7.4 下获得的释放速率相比，HRP-RGD NP 在 37°C 和 pH 5.0 下 60 小时后表现出最高的 RV 释放速率，为 58.4.2 ± 2.8%，和 37°C 下的 pH 值 9.0。据报道，正常血液 pH 值为 7.4，而肿瘤组织呈微酸性 [27]。这被证明是在肿瘤治疗中使用 HRP-RGD NPs 的一个有益特征。

一 RV 封装效率作为添加的 RV 浓度的函数。 b HRP-RGD NPs 的 RV 在 pH 5.0、6.5、7.4 和 9.0、37°C​​ 下的体外释放曲线

体外生物相容性

图 4a、b 显示了 7 天后 4°C 下 PBS 中 DMSO 溶解的 RV 和 HRP-RGD NP 的图像。前者呈针状晶体状的固体物质，而后者则有大量微细且均分散的球状颗粒，表明HSA纳米颗粒包裹后RV稳定性提高。此外，HRP-RGD NPs 在水、DMEM、PBS 和 FBS 中的平均大小在 4 周内几乎没有变化（图 4c），表明 HRP-RGD NPs 的高胶体稳定性，很可能归因于 PEG 和HSA封装。

a的显微镜图像 PBS 和 b 中的游离 RV（溶于 DMSO） 7 天后 PBS 中的 HRP-RGD NP。 c HRP-RGD NPs 在不同介质（水、DMEM、PBS 和 FBS）中的胶体稳定性测试。 d 4 周后 HRP-RGD NP 中的 RV 荧光稳定性。 e 与不同浓度的 HRP-RGD NPs 孵育 1 小时后红细胞的溶血率。 插图 显示 RBCs 暴露于不同浓度的蒸馏水、PBS 和 HRP-RGD NPs 后离心的照片

图 4d 显示了 RV 和 HRP-RGD NPs 在 4°C 水溶液中的荧光稳定性。储存 4 周后，HRP-RGD NPs 的 RV 荧光强度保持其初始强度的 96.8% 以上；然而，RV 的荧光迅速下降至其初始强度的 12.1%，可能是由于 RV 从溶液中沉淀出来 [10]，进一步表明 HRP-RGD NPs 与游离 RV 相比的稳定性。此外，如图 4e 所示，低于 200 μg/mL 的 HRP-RGD NPs 处理的 RBC 未检测到显着的溶血现象，类似于阴性对照 PBS 处理组，说明 HRP-RGD NPs 的优异血液相容性.这些结果表明HSA封装提高了RV的稳定性和体外生物相容性，有利于生物医学应用。

细胞摄取

HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 由 FITC 标记。如图 5a 所示，细胞核显示蓝色荧光，被 DAPI 染色。在用 HRP-RGD NPs 处理的 PANC-1 细胞的核周区域观察到强烈的绿色荧光（FITC 信号），表明有足够量的 HRP-RGD NPs 进入细胞质。相比之下，在 HRP NPs 处理的 PANC-1 细胞中几乎没有显示绿色荧光。此外，用游离 RGD 预处理的 PANC-1 细胞也表现出温和的绿色荧光，这可能归因于 PANC-1 表面上的 RGD 受体被游离 RGD 阻断。通过 FCM 检测纳米颗粒的细胞摄取率，对于 HRP NPs、具有 RGD 阻断的 HRP-RGD NPs 和 HRP-RGD-处理过的 NPs，分别为 16.2 ± 4.9%、7.1 ± 5.1% 和 58.5 ± 3.5% 1 个细胞，分别为（图 5b）。这些结果表明靶分子RGD可以促进PANC-1细胞对HRP-RGD纳米粒的高效摄取[28, 29]。

一 与 HRP NPs、具有 RGD 阻断的 HRP-RGD NPs 和由 FITC 标记的 HRP-RGD NPs 孵育后 PANC-1 细胞的共聚焦荧光图像。 绿色 和蓝色 分别代表 FITC 荧光和 DAPI 染色的细胞核。 比例尺 =20μm。 b 流式细胞术检测PANC-1细胞对HRP NPs、具有RGD阻断的HRP-RGD NPs和HRP-RGD NPs的定量细胞摄取

体外细胞毒性

图 6a 显示了浓度范围为 0-200 μg/mL 的 HP-RGD NPs 通过 CCK-8 测定的细胞毒性，其中 PANC-1 细胞活力保持在 90% 以上。有人提出，低于 200 μg/mL 的 RV 载体 HP-RGD NP 水平没有显着的细胞毒性。此外，还评估了 HRP-RGD NPs 的体外抗癌作用。图 6b 显示游离 RV、HRP NP 和 HRP-RGD NP 在 RV 浓度范围在 0 和 50 μg/mL 之间时，通过剂量依赖性方式诱导细胞活力降低。与游离 RV 和 HRP NPs 相比，HRP-RGD NPs 在所有测试浓度下都会导致细胞活力的最大下降，这可能是由于 HRP-RGD NPs 对 PANC-1 细胞的稳定性和 RGD 靶向作用 [30, 31] .此外，用游离 RV、HRP NPs 和 HRP-RGD NPs（均在 30 μg/mL RV）处理的 PANC-1 细胞的细胞核被 Hoechst 33258 染色并在共聚焦荧光显微镜下观察。 HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 处理的细胞显示存在固缩核，与 RV 处理的细胞一致（图 6c-f），表明细胞死亡类型最有可能是细胞凋亡 [32]。

一 用 HP-RGD NPs 处理 24 小时后 PANC-1 细胞的细胞活力。 b 与不同浓度的 RV、HRP NP 和 HRP-RGD NP 孵育后 PANC-1 细胞的细胞活力。 PBS处理的PANC-1细胞核(c ), 房车 (d ), HRP NPs (e ), HRP-RGD NPs (f ) 处理 24 小时后由 Hoechst 33258 染色。使用数码相机记录图像。 比例尺 =20μm。 红色箭头 代表核固缩细胞

血液循环和肿瘤生物分布

图 7a 显示了静脉注射小鼠后游离 RV、HRP NP 和 HRP-RGD NP 的血液循环时间。可以看出，HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 具有几乎相同的半衰期 (t 1/2) 的 7.5 ± 0.5 小时和 t 分别为 1/2 =6.57 ± 0.9 小时。虽然游离 RV 很快从血液循环系统中清除，t 1/2 =1.21 ± 0.09 小时。 HRP-RGD NPs 延长了 RV 的血液循环时间，大约增加了 5.43 倍 (t 1/2）。此外，注射纳米颗粒后 24 小时，HRP-RGD NPs 治疗组肿瘤组织中 RV 的含量比 HRP NPs 和游离 RV 治疗组高约 3.01 倍和 8.1 倍，分别（图 7b）。这些结果表明 HSA 和 PEG 封装可以延长循环时间以减少 RV 的消除，并在肿瘤组织中显示出显着的选择性积累性能 [33, 34]，可能是因为增强的渗透性和保留 (EPR) 和 RGD 靶向效果[35]。

一 静脉注射后小鼠游离 RV、HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 的血液循环曲线，由稀释的组织裂解液的 RV 吸光度确定。 b 用 RV、HRP NP 和 HRP-RGD NP 治疗后 24 小时肿瘤中 RV 的含量。 c 静脉注射生理盐水（对照）、RV、HRP NPs 和 HRP-RGD NPs 后荷瘤小鼠的相对肿瘤体积。 d 荷瘤小鼠静脉注射生理盐水（对照）、RV、HRP NPs和HRP-RGD NPs后的体重

体内抗癌功效

图 7c 显示了在静脉尾部注射后相同浓度的 RV 下游离 RV、HRP NP 和 HRP-RGD NP 的抗癌效率。作为对照，用盐水处理小鼠。 HRP-RGD NPs 治疗的小鼠显示出显着抑制的肿瘤生长，并且在治疗 35 天后没有复发。虽然游离 RV、HRP NPs 治疗组与对照组相似，但显示出不断增加的肿瘤生长。正如预期的那样，所有组中小鼠的体重在 35 天的治疗中没有显着下降（图 7d）。此外，在处理 35 天后，通过主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的 H&E 染色进一步评估了体内全身毒性（图 8）。所有测试组的相应组织H&E染色图像均未发现明显的组织毒性或异常，进一步保证了HRP-RGD NPs在生物医学应用中的体内安全性。

心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺的代表性 HE 染色图像。 比例尺 =100 μm

结论

总之，我们已经说明了 HRP-RGD NPs 如何用作高效的胰腺肿瘤靶向治疗剂。结果表明，与游离 RV 相比，HRP-RGD NPs 在体外表现出更好的胶体稳定性和生物相容性。 RGD 作为靶分子促进了 HRP-RGD NPs 的高效细胞摄取。在 PEG 和 HSA 的存在下，HRP-RGD NPs 显示出显着延长的循环时间，可以克服游离 RV 的短血液循环。基于 RGD 靶向，肿瘤组织中 HRP-RGD NPs 的含量高于游离 RV 和 HRP NPs。此外，体外和体内研究表明，与游离的 RV 和 HRP NPs 相比，HRP-RGD NPs 具有极好的抗癌作用，可能由细胞凋亡引起。最后，HRP-RGD NPs 在治疗 35 天后在体内显示出高生物相容性和无显着全身毒性。这些结果表明，HRP-RGD NPs可以成为未来生物医学应用中很有前景的肿瘤化疗药物。

缩写

CCK-8：

细胞计数试剂盒-8

FBS：

胎牛血清

FITC：

异硫氰酸荧光素

HSA：

人血清白蛋白

PBS：

磷酸盐缓冲液

PEG：

聚乙二醇

RGD：

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸

RV：

白藜芦醇