以叶酸受体为靶点的生物类黄酮染料木素负载壳聚糖纳米颗粒可增强对宫颈癌的抗癌作用

背景

人类宫颈癌是全球育龄期女性常见的癌症之一，主要由人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)引起[1]。 “国际癌症研究机构”将免疫防御降低、吸烟和不规律的性活动列为宫颈癌的主要原因[2]。医疗技术和诊断的最新进展对降低宫颈癌的死亡率有很大影响；尽管如此，此类癌症在中国等发展中国家仍在增加。两种预防性 HPV 疫苗（Gardasil 和 Cervarix）已上市用于治疗宫颈癌；然而，它仅在成年患者中显示出有效性，而未能在所有患者中得到鼓舞 [3, 4]。因此，经常使用化疗、手术和放疗等治疗方案；然而，没有一种能有效治疗宫颈癌。据报道，化学治疗剂或其他小分子在特异性递送时可提高癌症治疗效率[5]。

最近，天然化合物在癌症治疗中受到了极大的关注，因为与化疗药物相比，它的毒性更小[6]。特别是，据报道，许多植物中存在的黄酮类化合物具有抗炎和抗癌特性。染料木素（4',5,7-三羟基异黄酮）（GEN）是一种潜在有效的大豆异黄酮，由于其强大的抗癌特性而受到越来越多的关注 [7, 8]。研究表明，GEN 抑制蛋白酪氨酸激酶和 NF-κB，并在 G2/M 期阻止细胞周期。这将导致与细胞增殖和癌细胞生长相关的基因下调 [9, 10]。 G2/M 期阻滞会抑制癌细胞的迁移、侵袭，并诱导细胞凋亡和细胞死亡[11]。然而，GEN 的临床潜力因其有限的溶解度（~1.45 μg/ml）和有限的生物利用度而受到阻碍 [12]。因此，迫切需要改善GEN的理化性质及其抗癌特性。

由于纳米技术能够改善各种小分子的抗癌特性，纳米技术在医学中的应用越来越受到关注[13]。将药物封装在纳米颗粒中具有许多优点，例如高稳定性、增强的载药量、更高的内在化、有利的生物分布和改善的药代动力学 [14]。重要的是，纳米粒子通过在肿瘤组织中优先积累来增加包封化合物的抗癌作用。此外，纳米粒子可以逆转肿瘤细胞的多药耐药性 (MDR) [15, 16]。在本研究中，我们采用了天然衍生的壳聚糖纳米颗粒，因为它具有出色的生物降解性和生物相容性。此外，壳聚糖的伯胺基团提供了一些重要的特性，包括水溶性和血液相容性。此外，胺基可用于改变纳米颗粒的表面[17]。为了提高目标特异性，我们在壳聚糖纳米粒子的表面结合了叶酸。由于叶酸在宫颈癌细胞中的过度表达，叶酸被选为靶向配体。叶酸受体在宫颈癌细胞中大量或大量存在。具体而言，FRs-α 也存在于正常细胞中，但不暴露于血液循环中，而在癌细胞的情况下，它高度暴露于血液循环中，使其成为可能通过内吞作用内化的叶酸偶联纳米颗粒的有吸引力的靶标机制 [18, 19]。

在本研究中，我们主要旨在通过封装在 FA 偶联的壳聚糖纳米颗粒中来增加 GEN 对 FR-α 过表达的 HeLa 宫颈癌细胞的抗癌特性。纳米粒子的特征在于粒度、形状和体外释放动力学。通过在 HeLa 癌细胞中的细胞摄取试验研究了 FA 的靶向作用。通过细胞毒性试验、活/死试验和细胞凋亡分析研究了GEN和GEN负载纳米粒的抗癌作用。

方法

材料

染料木素购自 Aladdin Chemicals（中华人民共和国上海）。叶酸、壳聚糖（85% 脱乙酰）购自 Sigma-Aldrich，中国。 EDC 和 NHS 也购自 Sigma-Aldrich，中国。所有其他化学品均为试剂级，未经任何修改即可使用。

载有 GEN 的叶酸偶联壳聚糖纳米颗粒的制备

在制备纳米颗粒之前，先制备叶酸壳聚糖偶联物。简而言之，将 44.1 mg 叶酸与 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDAC.HCl) 和 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 的混合物（摩尔比 1:1.5:1.5）一起溶解在 DMSO 中）。将混合物搅拌 30 分钟以激活官能团。在连续搅拌下将有机溶液逐滴加入壳聚糖溶液（0.5% w/w）中。在黑暗条件下继续搅拌过夜。通过加入 1 M 氢氧化钠使 pH 值达到 8。最后离心分离黄色沉淀，用碳酸钠洗涤，再用水透析。

为了制备纳米颗粒，将 GEN、壳聚糖和壳聚糖-FA 偶联物 (10:1) 溶解在 DMSO 中。然后在连续搅拌下将 DMSO 溶液滴加到 0.5% Tween 80 溶液中。将混合物搅拌 3 小时，在所有溶剂蒸发后，将悬浮液在 4°C 下以 10,000 rpm 离心 30 分钟。去除上清液并通过HPLC方法评价。在 25°C 下使用反相 C-18 柱通过 HPLC（LC 1100，安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉，美国）对样品进行定量。甲醇/水的流动相 (60/40, v /v) 用作流动相，流速为 1 ml/min。

粒度和表面形态分析

通过 Malvern Mastersizer 2000 (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments Ltd., UK) 观察纳米颗粒的粒径和粒径分布。样品在分析前适当稀释。所有测量一式三份进行。

通过透射电子显微镜（TEM，JEM-1230，JEOL，Tokyo，Japan）评估纳米颗粒的表面形态。简而言之，将纳米颗粒分散体与 2% PTX 混合并放在 TEM 网格上并在低红外辐射下干燥 10 分钟。样品用磷钨酸（2%）复染，在加速电压为100 kV的TEM下观察。

体外药物释放研究

药物释放研究采用透析法进行。简而言之，将 5 毫克当量的 GEN 纳米粒子悬浮在 1 毫升释放缓冲液（PBS，pH 7.4）中并转移到透析管（MWCO：3500）中。将透析管置于含有 25ml 释放缓冲液的 Falcon 管中。将 Falcon 管置于摇床中，在 37°C 温和搅拌。在预先指定的时间间隔内，取特定体积的样品并更换为新鲜的缓冲液或培养基。采用高效液相色谱法研究了药物从释放介质中释放出来的情况。

细胞培养

人宫颈癌细胞系（HeLa 细胞）获自美国 ATCC，MS，并在含有 10% FBS 和抗生素混合物的 DMEM 中于 37°C 下在含有 5% 二氧化碳的湿润气氛中生长。

细胞摄取

通过细胞摄取分析研究了纳米颗粒（GCN 和 FGCN）的靶向效率。在这项研究中，使用的荧光探针是 Coumarin-6。将细胞置于 96 孔板中并使其附着 24 小时。去除培养基并更换为含有 GCN 和 FGCN 的新鲜培养基，并孵育不同的时间间隔。然后用PBS洗涤细胞、裂解(Triton-X)、离心并收集上清液。上清液用于通过酶标仪（GENios，Tecan，Switzerland）评估荧光强度。在 430 nm 激发波长和 485 nm 发射波长下测量吸收。

细胞摄取成像

共聚焦激光扫描显微镜（Olympus Fluoview FV-1000，Tokyo，Japan）用于确定癌细胞中的定性细胞摄取。 2 × 10 ⁵ 将细胞接种在 6 孔板中并孵育 24 小时。移除培养基并替换为含有 GCN 和 FGCN 的新鲜培养基并孵育 2 小时。用PBS洗涤细胞，固定并再次洗涤。然后用CLSM观察细胞。

细胞毒性分析

通过 MTT 测定方案研究游离 GEN、GCN 和 FGCN 的细胞杀伤效率。接种密度为 1 × 10 ⁴ 的 HeLa 细胞 将细胞置于 96 孔板中并使其附着 24 小时。第二天，在 100 μl 新鲜培养基中用游离 GEN、GCN 和 FGCN 处理细胞并孵育 24 小时。之后，除去培养基并用PBS洗涤两次。将 10 微升含有 MTT (5 mg/ml) 的 DMEM 置于 96 孔板中，并使其静置 4 小时。虹吸出MTT溶液并加入DMSO以溶解对应于活细胞的甲臜晶体。使用酶标仪（Bio-Tek Instruments Inc.，USA）在 570 nm 波长处研究甲臜的吸光度。 IC50 也使用 GraphPad Prizm 软件（版本 17）计算。

活/死检测

接种密度为 2 × 10 ⁵ 的 HeLa 细胞 将细胞接种在 6 孔板中并孵育 24 小时。第二天，在 100 μl 新鲜培养基中用游离 GEN、GCN 和 FGCN 处理细胞并孵育 24 小时。之后，除去培养基并用PBS洗涤两次。根据制造商（Molecular Probes，USA）给出的说明处理细胞。钙黄绿素AM和乙锭同二聚体分别是用于染色的活细胞和死细胞染料。

统计分析

使用t对数据进行统计分析 测试。一个 P 小于 0.05 的值用于显示统计显着性。所有实验一式三份进行。

结果与讨论

人类宫颈癌是世界范围内女性育龄期流行的癌症之一，主要由人乳头瘤病毒引起。因此，经常使用化疗、手术和放疗等治疗方案；然而，没有一种能有效治疗宫颈癌。据报道，化学治疗剂或其他小分子如果专门递送，可提高癌症治疗效率。最近，天然化合物在癌症治疗中受到了极大的关注，因为与化疗药物相比，它的毒性更小。染料木素因其强大的抗癌特性而受到越来越多的关注。然而，GEN 的临床潜力由于其溶解度差（~1.43 μg/ml）和低生物利用度而受到阻碍。在本研究中，我们主要旨在通过封装在 FA 偶联的壳聚糖纳米颗粒中来提高 GEN 对 FR-α 过表达的 HeLa 宫颈癌细胞的抗癌特性（图 1）。

载染料木黄酮叶酸偶联壳聚糖纳米粒制备示意图

载有 GEN 的纳米粒子系统的物理化学表征

粒子系统的大小和 zeta 电位在抗癌药物的细胞内化和全身性能中起着至关重要的作用。动态光散射 (DLS) 用于确定加载 GEN 的纳米粒子的粒度和粒度分布（图 2）。 GCN 的平均粒径约为 140 nm，而 FGCN 的平均粒径约为 165 nm，具有出色的多分散指数。 FGCN 的平均流体动力学直径小于 200 nm，这足以利用增强的渗透和保留效应穿透肿瘤组织。粒子的小尺寸可以抵抗纳米粒子从身体（RES）的快速清除特性[20]。表面电荷被认为是悬浮形式的颗粒稳定性的关键指标。 GCN 的平均 zeta 电位为 +26 mV，而 FGCN 为 +21.5 mV。表面电荷的轻微下降可能归因于壳聚糖的胺基团的取代。此外，GCN 和 FGCN 显示出超过 95% 的高捕获效率，表明其适用于系统应用。 FGCN 的粒径和 zeta 电位在储存 3 个月期间保持不变，表明其具有较高的储存稳定性（图 3）。

FGCN的透射电子显微镜

GCN 和 FGCN 在磷酸盐缓冲盐水 (pH 7.4) 中的体外释放曲线。药物释放量采用高效液相色谱法定量，实验一式三份

表面形态分析

优化后的 FGCN 的表面形貌通过 TEM 表征。纳米颗粒表现出球形形态并均匀分布在铜网格中。 TEM分析观察到的粒径与DLS观察一致（图4）。

HeLa 宫颈癌细胞中 GCN 和 FGCN 的细胞摄取分析。 一 通过荧光法定量分析纳米颗粒的细胞摄取。 b 基于共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 的细胞摄取分析。 Coumarin-6作为荧光探针

体外药物释放动力学

GCN 和 FGCN 中 GEN 的释放采用透析法进行。 PBS 用于进行释放研究以模拟生理条件。正如预期的那样，GCN 和 FGCN 的释放特征几乎相似。两种制剂都表现出 GEN 的控释曲线和单相释放动力学。在 24 小时结束时，大约 35-40% 的药物从两个纳米颗粒系统中释放出来。 GEN释放率的趋势一直持续到研究期结束，最终释放了~90%的药物。表面上的叶酸缀合影响药物的低释放，表明存在缀合材料的影响。据报道，药物从 NP 的受控释放归因于药物到外部释放介质的路径长度的延长。总体而言，药物在 pH 7.4 条件下的受控释放表明大部分药物将保持完整，并会随着时间的推移在肿瘤组织中积累。

体外细胞摄取研究

GEN 的细胞内浓度对于引发其在癌细胞中的细胞毒性作用非常重要。因此，从治疗功效的角度来看，NP 系统的细胞摄取潜力非常重要。负载香豆素 6 的 GCN 和 FGCN 与癌细胞孵育不同的时间点。两种 NP 系统都表现出时间依赖性细胞摄取，在 4 小时时具有最大细胞摄取。正如预期的那样，叶酸受体靶向 FGCN 表现出统计学上的 (p <0.05) 在 HeLa 癌细胞中更高的细胞摄取。再次重申，在大多数情况下 FGCN 的主要吸收是由于颗粒表面 FA 的可用性，这可能促进配体与相应受体的相互作用，并且在 HeLa 细胞中大量存在 [21]。

显微成像进一步证实了细胞摄取。将细胞与受重视的制剂一起温育并温育 2 小时。正如所见，与 GCN 处理的细胞相比，FGCN 暴露的癌细胞观察到高荧光强度。这些结果表明，叶酸缀合的FGCN由于配体-受体（FA-FR-α）识别而对癌性HeLa细胞具有特异性亲和力。

体外细胞毒性

通过 MTT 测定方案研究了 GEN、GCN 和 FGCN 对 HeLa 癌细胞的体外细胞毒活性。正如所见，与游离 GEN 相比，GEN 纳米制剂在杀死癌细胞方面更有效。然而，所有制剂在癌细胞中都表现出典型的剂量依赖性细胞毒作用。正如预期的那样，叶酸标记的纳米制剂表现出统计学上的 (p <0.05) 与非靶向制剂相比具有更高的细胞毒性作用。 FGCN 的优异抗癌作用归因于癌细胞中特定受体介导的纳米颗粒内化，这可能会增加细胞内环境中的药物浓度。此外，纳米颗粒控制封装化合物释放的能力也有助于 FGCN 的高细胞毒性。 IC50 值用于评估制剂对癌细胞的真实细胞毒性作用。通常，它是杀死一半原始细胞所需的浓度。结果表明，当用 GCN 处理时，GEN 的 IC50 值从 33.8 降至 26.5 μg/ml。重要的是，孵育 24 小时后用 FGCN 处理时 IC50 值降低至 14.6 μg/ml。据报道，纳米颗粒可降低 MDR 效应，从而有望通过减少 P-糖蛋白介导的细胞外流来提高 GEN 的抗癌功效。 FGCN优越的抗癌作用与其在HeLa癌细胞中的高细胞摄取一致[22]。

微观分析

用抗癌药物治疗后对癌细胞进行形态学分析。将制剂暴露于癌细胞并孵育 24 小时。对照细胞正常并散布在孔板的盖玻片上，而制剂处理组的细胞收缩。与细胞毒性试验一致，不同制剂的癌细胞形态不同。如图所示，FGCN 处理的细胞数量较少，圆形形态表明制剂具有较高的细胞毒性。由于 GCN 在癌细胞中的摄取相当高，GCN 还诱导了癌细胞的显着变化。结果清楚地表明壳聚糖包覆的纳米粒子将有利于宫颈癌的治疗（图5）。

HeLa 癌细胞中 GEN、GCN 和 FGCN 的体外细胞毒性分析。用各自的制剂处理细胞并温育24小时。 **p <0.01 是 FGCN 和 GEN.A 之间的统计差异

活/死检测

通过活/死试验进一步研究了单个制剂的细胞毒性潜力。从绿色荧光强度可视化药物处理（24 小时）后存活和死亡的细胞数量。 Calcein AM 和溴化乙锭染料是代表性的活细胞和死细胞标记物，可应用于用制剂处理的细胞。药物处理后剩余的活细胞吸收钙黄绿素并发出绿色荧光（488 nm）。如图所示，未处理的细胞显示出高荧光强度（绿色荧光），游离 GEN 的处理也没有减少生长的细胞。另一方面，FGCN 显示出较少的活细胞和较高的死细胞（低荧光强度），表明有效的效果。 FGCN 处理组的高细胞死亡率归因于癌细胞中更高的纳米颗粒内化。结果与细胞毒性试验一致（图6）。

GEN、GCN和FGCN处理后HeLa癌细胞的形态学分析

细胞凋亡分析

在这项研究中，我们设计了一种独特的叶酸受体靶向递送系统，可以增加细胞内 GEN 的浓度，提高宫颈癌细胞的抗癌作用。因此，为了分析游离 GEN、GCN 和 FGCN NP 的凋亡诱导特性，在膜联蛋白 V/PI 双染色后通过流式细胞术评估细胞。图 7 显示，用游离 GEN 处理的细胞不会诱导癌细胞明显凋亡，而 GCN (~22%) 可有效诱导这些癌细胞的凋亡。正如预期的那样，FGCN 表现出显着的癌细胞凋亡（~55%），表明其具有优越的抗癌作用。制剂的较高抗癌作用是由于配体对相应受体的特异性亲和力，这反过来又增加了癌细胞中的药物浓度。结果清楚地表明，壳聚糖包覆的纳米粒子将有利于宫颈癌的治疗。抗癌药物的纳米技术平台增加了癌细胞的毒性，提高了抗肿瘤药物的治疗效果（图8）。

用 GEN、GCN 和 FGCN 处理后 HeLa 癌细胞的活/死分析。绿色荧光表示有活细胞

GEN、GCN和FGCN处理后HeLa癌细胞的凋亡分析。流式细胞仪分析细胞凋亡比例。 **p <0.01 是 FGCN 和 GEN 之间的统计差异

结论

在这项研究中，配制了新型叶酸偶联壳聚糖纳米颗粒，用于将生物类黄酮染料木黄酮 (GEN) 特异性递送至宫颈癌细胞。 FGCN 在 HeLa 细胞中表现出比 GCN 更强的内化潜力。结果表明，FGCN 对 HeLa 细胞具有特定的亲和力，这将有助于更好的治疗。与非靶向制剂相比，叶酸标记的纳米制剂表现出优异的细胞毒性作用。一致地，在孵育 24 小时后用 FGCN 处理时，GEN 的 IC50 值从 33.8 降至 14.6 μg/ml。细胞凋亡研究表明，就抗癌活性而言，FGCN 纳米颗粒是 GCN 或游离 GEN。总体而言，结果表明叶酸与输送系统的结合可能对宫颈癌的存活产生很大影响，这将有利于整体癌症治疗。临床动物模型的研究为本研究的下一步工作提供了展望。

缩写

EPR：

增强渗透和保留

FGCN：

叶酸偶联的GEN负载壳聚糖纳米粒

FR：

叶酸受体

GCN：

GEN负载壳聚糖纳米粒

GEN：

染料木素