基于固态纳米孔内表面改性的过氧化氢传感

背景

纳米孔检测技术源于库尔特计数器[1]和细胞离子通道[2]。 Nanopore 检测通过它的溶液中存在的带电分子。纳米孔中分子的出现可以明显改变孔的电导，从而改变电流信号。电流的变化提供了有关孔内分子大小和浓度的信息，以揭示分子易位行为的动力学过程[3]。一些纳米级物体可以使用纳米孔进行检测，例如纳米粒子 [4,5,6]、病毒 [7,8,9]、蛋白质分子 [10,11,12,13] 和 DNA 序列 [14,15,16] ,17]。纳米孔有两种类型。生物学纳米孔和固态纳米孔。生物纳米孔具有更低的信噪比（SNR）和更高的分辨率。可以使用生物纳米孔检测小的和未折叠的蛋白质 [18,19,20,21,22,23]。固态纳米孔尺寸可调，稳定性更高。固态纳米孔通常钻在薄膜上，该薄膜将流体单元分成两部分 [24]。将偏置电压施加到含有纳米孔的薄膜上，从而产生从一个细胞到另一个细胞的离子电流 [25]。通过固态纳米孔检测和分析包括折叠和未折叠结构的蛋白质分子 [26,27,28,29]。还可以使用固态纳米孔检测蛋白质的相互作用 [30, 31]。此外，它具有检测蛋白质动力学的能力 [32, 33]。为了解决检测范围的限制，化学修饰的固​​态纳米孔已被广泛应用[34,35,36,37,38,39]，化学修饰的固​​态纳米孔已应用于检测单链DNA [40] 和蛋白质 [41]。

很多定量方法已经应用于检测H2O2，其中大部分是基于光谱法[42,43,44,45]，化学发光法[46,47,48,49]，安培法[50,51,52] ,53] 和电化学 [54,55,56,57]。传统的光谱和化学发光方法通常既费时又费钱。该固态纳米孔传感器功耗低，结构简单，可用于检测小分子。

在这里，我们提出了一种用辣根过氧化物酶 (HRP) 修饰的固态纳米孔。 HRP 固定在固态纳米孔的内表面，固定的 HRP 在 H2O2 存在下在单个纳米孔通道内发生的氧化还原反应中保持活性 [58]。 ABTS ^•+ 氧化还原反应生成的 ABTS ^•+ 通过纳米孔。可以检测易位事件。过氧化氢检测，固态结构简单，可检测聚集的ABTS ^•+ 通过使用低试剂消耗。这种辣根过氧化物酶 (HRP) 酶修饰的固态纳米孔可以通过聚集的 ABTS ^•+ 间接完成过氧化氢 (H2O2) 传感 检测。对单分子检测和分子组装内部固态纳米孔具有指导意义。

方法

化学品和材料

辣根过氧化物酶 (HRP) 分子 (1mg mL ^-1 , Enzyme Commission No.1.11.1.7, 44 kDa) 购自 Xiya Reagent (Chengdu, China)。将样品 (HRP) 溶解在 0.02 μm 过滤的 0.1 M PBS 中，储存在 4°C，并在制备后两天内使用。氯化钾 (KCl)、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺 (EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 和 2,2'-偶氮基-双 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) ((ABTS ), 98%) 购自帝博化工科技有限公司（中国上海）。过氧化氢（H2O2，30%）购自国药集团化学试剂有限公司。（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（3-APTES）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。使用来自 Milli-Q 水净化系统（电阻率为 18.2 MΩ/cm，25°C，Millipore Corporation，Billerica，MA，USA）的非纯水进行实验，并在 FEI Strata 201 FIB 系统（FEI Co., Hillsboro, OR, USA)、Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS) 和 Axopatch 700B (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA)。我们使用过的仪器的图片已添加到补充材料中（参见附加文件 1：图 S1）。

固态纳米孔制造和电气测量

首先，将 Si3N4（100nm 厚）薄膜沉积在 300μm 厚的 Si 衬底上。其次是光刻（开窗尺寸为500 × 500 μm ² ）。然后，使用 FEI Strata 201 FIB 系统（FEI Co., Hillsboro, OR, USA）在 30 kV 的加速电位下用 Ga + 离子轰击膜的表面，同时测量电流为 1 pA。在点模式下研磨时间为 1.5 s。最后，获得固态纳米孔芯片并在新鲜制备的食人鱼溶液中在 80°C 下清洗 30 分钟，然后用超纯水冲洗。清洗后，芯片被组装在一个定制的特氟龙电池中，带有两个 Viton O 型圈以分隔芯片的两侧，并形成两个储层，以确保离子电流通过纳米孔的唯一路径。我们使用过的设备的图片已添加到补充材料中（参见附加文件 1：图 S2）。电极 (Ag/AgCl) 连接到流体池和膜片钳放大器 (Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA)，使离子电流在恒定电压下可测量，信号采样率为 100 kHz .放大器内部低通八极贝塞尔滤波器设置为 10 kHz [3]。整个仪器放置在一个双法拉第笼罩内。

结果与讨论

用 HRP 固定纳米孔

将选定的直径约 50nm 的纳米孔浸入 80°C 的食人鱼溶液中 30 分钟。用食人鱼溶液处理后，纳米孔的内表面能够带上硅羟基。随后，用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（3-APTES）活化整个薄膜。 3-APTES处理的结果是在薄膜表面产生了氨基(-NH2)基团。

用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（3-APTES）活化后，将纳米孔芯片放入 N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺（EDC）（10 mM）和 N-羟基琥珀酰亚胺（ NHS) (20 mM)。此后，将纳米孔芯片引入辣根过氧化物酶 (HRP) (10 ng/ml)。根据本课题组以往的研究结果[3]，在0.1～2M KCl、pH 7.0的不同盐浓度下，HRP不发生聚集。由于 pI 辣根过氧化物酶的值为 4.3 ± 0.2，我们还证明了 HRP 在 0.1 M KCl pH 6.0 和 pH 7.0 中不会聚集。 EDC 试剂将 HRP 的羧基 (-COOH) 活化成高反应性的邻酰基异脲中间体。此外，在 NHS 存在下，中间体进一步转化为更稳定的琥珀酰亚胺胺反应性酯 [58]。结果，中间体与纳米孔内表面产生的（-NH2）共价偶联形成稳定的酰胺键（图1）。

在单个固态纳米孔通道中进行改性过程。 一 辣根过氧化物酶 (HRP) 通过碳二亚胺偶联化学共价连接到单个纳米孔通道的示意图。 HRP 的羧基 (-COOH) 基团被 EDC 溶液激活，使 HRP 能够与纳米孔芯片表面产生的 (-NH2) 反应。 b 固定化HRPs过氧化氢传感器方案，传感器内表面用HRPs修饰。当 H2O2 和 ABTS 发生时，ABTS ^•+ 产生。 HRP的晶体结构经作者许可使用[3]

这些过程引导我们将 HRP 固定在单个纳米孔的内表面。通过测量电流-电压(I-V ）修饰前后的单个纳米孔（图 2）。

执行典型的电流-电压 (I-V ) 未改性（原始）和改性纳米孔在 0.1 M KCl 中的曲线，用 0.1 M PBS 在 pH 7.0 缓冲。 黑线 是 I-V 未修饰纳米孔的曲线和红线 是 I-V 用 HRP 修饰的纳米孔的曲线。 插入 是单个纳米孔（直径约 50 nm 顺式）和纳米孔传感器的扫描电子显微镜 (SEM)。 100纳米是尺度

HRP 改性固态纳米孔的表征

这里，单个 Si3N4 纳米孔通道的形状是圆柱形的。图 2 显示了典型的电流-电压 (I-V ) 未改性（原始）和改性纳米孔在 0.1 M KCl 中的曲线，用 0.1 M PBS 在 pH 7.0 缓冲。用HRP酶修饰纳米孔内表面后，孔径变小。

根据 Wanunu 等人的研究，考虑到纳米孔外部的电导，固态纳米孔的直径可以通过下式计算，

哪里，d 和 l 分别为孔的直径和长度，G 是纳米孔的开孔电导，σ 是离子溶液的电导率。

考虑几何效应，用HRP酶修饰固态纳米孔后，可以计算出有效尺寸。单个纳米孔的直径可以根据等式（1）计算。其中，电导值 (G 未修改 ) 是 ~15 nS 可以从 I-V 获得 未改性固态纳米孔的曲线。电导率 (σ ) 离子溶液 0.1 M KCl (25 °C)，用 0.1 M PBS 在 pH 7.0 缓冲为 ~1.28 S/m。因此，未改性纳米孔的直径约为 51 nm，与测量的直径相似。用同样的方法，得到电导值(G 修改 ) 为 ~7.5 nS，可以计算出改性纳米孔的直径 (~34 nm)。由于以下两个原因，直径可能减小，首先是用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（3-APTES）处理纳米孔的内表面，使纳米孔表面带有（-NH2）氨基。第二个原因是流体动力学直径 (D h ) 的 HRP 酶约为 8 nm [3]，固定化的 HRP 可以减小孔的直径。在此，HRPs修饰的直径~34 nm的固态纳米孔被用作过氧化氢检测通道。

氧化还原反应原理

氧化还原反应在单个修饰的纳米孔内进行，下面介绍的反应过程与提出的氧化还原反应非常吻合 [58]。在 H2O2 (0.5 mM) 存在下，固定在纳米孔内表面的 HRP 酶立即转化为化合物 1。然后，化合物1从还原底物分子ABTS（1.5 mM）接受一个电子生成化合物2。随后，化合物2通过另一个底物分子ABTS的电子转移被还原回静息酶。

阳离子产品 (ABTS ^•+ ) 的氧化还原反应在单个纳米孔中积累。纳米孔通道中积累分子的易位会改变电导（G )，因此电流的变化 (ΔI b ) 可以找到。

检测易位事件

使用辣根过氧化物酶 (HRP) 修饰的纳米孔进行实验，该纳米孔在 0.1 M KCl 中具有修饰的孔径 (~34 nm)，在 pH 7.0 下用 0.1 M PBS 缓冲。 2, 2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate (ABTS) (1.5 mM) 和过氧化氢 (H2O2) (0.5 mM) 被添加到纳米孔的反式隔室中。添加 ABTS 和 H2O2 后，实验使用从 -100 到 -800 mV 的偏置电压进行，并在 100 kHz 采样。在电压增加到 -400 mV 之前没有易位事件。图 3 显示了不同电压下易位事件的代表性离子电流轨迹-400 to -800 mV in 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0. 不同电压下长时间易位事件的实验数据被添加到补充材料中（见附加文件1：图S3）。

一 –e 在 -400 到 -800 mV 的不同电压下易位事件的示意图。当施加的电压从 -400 mV 增加到 -800 mV 时，易位事件的频率增加。 f 电流幅度随电压线性增加。 h 指数衰减函数 (t d ~ e ^−v/v0 ) 被用来拟合依赖于施加电压的停留时间

观察到毫秒电流阻断事件，在 0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0 中进行。通过将试剂H2O2和ABTS加入跨室，HRP酶固定在单个纳米孔通道的内表面，发生氧化还原反应。丰富的ABTS ^•+ 分子被产生，一个更小的分子 ABTS ^•+ 由于系统的分辨率，使用我们的固态纳米孔可能无法检测到 [3]。然而，这些分子在产生后会聚集。因此，可以检测到 ABTS ^•+ 分子。在这里，负电压被保持，并聚合了 ABTS ^•+ 分子通过纳米孔。当施加负电压时有电泳和电渗流。 HRP 在 0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0 中带负电[3]，结果会产生双电层，电渗向负极方向。由于这个原因，电泳和电渗是朝着同一方向发展的。聚合后的 ABTS ^•+ 在单个纳米孔通道中将通过固态纳米孔传输，向负极方向流动。

易位事件统计分析

由于偏置电压在聚集 ABTS ^•+ 的易位中起关键作用 , 当前阻断聚合 ABTS 的影响 ^•+ 讨论了通过 HRP 修饰的纳米孔与施加的电压的关系。随着电压的增加，易位事件的发生频率大大提高（图 3f）。随着电压的增加，电流的幅度也会增加。然而，当偏置电压保持在-300 mV以下时，易位事件逐渐消失，这表明聚集的ABTS ^•+ 跨 HRP 修饰的纳米孔需要 -300 mV 阈值电压。图 4 显示了针对聚合 ABTS ^•+ 测量的易位事件平均电流幅度的直方图 在不同电压下。根据拟合曲线，电流阻塞的峰值（ΔI b ) 分别为 308.4 ± 27.795 pA、419.1 ± 20.354 pA、478.8 ± 32.857 pA、528.1 ± 36.98 pA、-0≉32.857 pA、-0≉36.98 pA、-0≉20.354 pA、-06.98 pA、-06.98-0≉-0≉20.16-0±0.6, -0±04, -0±0.6, -0±0.9电流的减少是由聚集的 ABTS ^•+ 引起的 分子在不同电压下通过纳米孔。电流幅度值符合一阶多项式函数，其产生的斜率为 -0.706 和截距为 49.262。然而，根据拟合曲线，停留时间的值为54.5 ± 21.374 ms、42.8 ± 20.181 ms、10.3 ± 3.05 ms、6.0 ± 1.744 ms、10,40≉-4.744 ms、10,40≉-0≉-4.0±4.0±4. 700 和 -800 mV。图 3h 显示了一个指数衰减函数 (t d ~ e ^−v/v0 ) 被用来拟合依赖于施加电压的停留时间。易位事件停留时间的直方图已添加到补充材料中（参见附加文件 1：图 S4）。

为聚合 ABTS ^•+ 测量的易位事件平均电流幅度的直方图 在不同电压（-400、-500、-600、-700、-800 mV）下，在 0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0 中。所有直方图均符合高斯分布

每个聚合 ABTS ^•+ 的当前封锁与事件停留时间 不同电压下的二维散点图（图 5）。所有汇总的 ABTS ^•+ 显示从 -400 到 -800 mV 的事件簇，主要事件簇是由于聚合的 ABTS ^•+ 通过HRPs修饰的固态纳米孔。

每个聚合 ABTS ^•+ 的当前阻塞与事件停留时间的二维散点图 在不同电压下。其相应的直方图放在右侧和上方。所有直方图均符合高斯分布

此外，分析了每个电压下的单个易位事件，并且电流阻断是由相同大小和带电物质引起的。因此，认为每个易位事件都是由单个聚集的 ABTS ^•+ 诱导的 .分析聚集ABTS ^•+ 的易位时间 在我们的实验中。当前封锁持续时间t d 被视为单个聚合ABTS的停留时间 ^•+ 从它产生的位置到纳米孔的出口。这里考虑了另一个条件，可能有一些HRP酶固定在纳米孔的入口处，它可能催化氧化还原反应。因此，进行了其他实验以验证氧化还原反应发生在单个纳米孔的内表面而不是入口处。为了验证，应用和分析了未经 HRP 修改的内容。这些纳米孔用 3-APTES 激活。将相同浓度的 HRPs (10 ng/ml)、ABTS (1.5 mM) 和 H2O2 (0.5 mM) 添加到纳米孔的反式隔室中，在 0.1 M KCl、0.1 M PBS、pH 7.0 中施加负偏压，由于电泳力，HRPs 无法通过纳米孔。由于氧化还原反应，聚集的ABTS ^•+ 产生，但没有发现易位事件。 ABTS ^•+ 与 HRP 产生静电效应并防止聚集的 ABTS ^•+ 穿过纳米孔。

图 6 显示了电导变化的二维散点图 (ΔG ) 与每个聚合 ABTS ^•+ 的事件停留时间 在不同电压下。可以发现，电导的变化（ΔG ) 主要集中在 0.8 nS。易位事件的形状几乎相同。 ΔG的平均值 在不同电压下约为 0.8 nS。可以推测，每个聚合ABTS ^•+ 的体积排除 分子几乎相同。可能是聚集 ABTS ^•+ 的静电和空间效应 分子可能会改变离子电流。分析后，两种典型的带正电荷聚集ABTS ^•+ 的电流迹线形状 观察到易位（图 7）。 -700 mV 的易位事件作为代表。分析了两种事件的百分比，可以观察到，随着电压的增加，1 类事件的百分比增加，而另一方面，2 类事件的百分比下降。认为较高的电压比较低的电压使易位更快。

ΔG的二维散点图示意图 与每个聚合 ABTS 的事件停留时间对比 ^•+ 在不同电压下。相应的拟合曲线位于上方。 插入 是不同电压的易位事件（从-400到-800 mV）

一 -700 mV 电压下的两种易位事件示意图。 b 不同电压（-400、-500、-600、-700、-800 mV）下两种事件的百分比

当前的阻断信号揭示了聚集的 ABTS ^•+ 的大小、构象和相互作用 通过单个纳米孔通道。对于电流形状的变化，推测了变化的过程。对于事件1，电流信号具有典型的波动部分，强度大，停留时间短。 ABTS ^•+ 从它产生的地方穿过纳米孔。当聚合 ABTS ^•+ 通过纳米孔，纳米孔的离子电流恢复到原来的水平（基线）（I 0 ）。对于事件2，电流信号有一个强度较深的波动部分，然后有一个水平阶段。这种信号形状可归因于聚集 ABTS ^•+ 的静电相互作用 HRPs 在纳米孔出口处，电流缓慢恢复到基线。为了更好地理解电流变化，我们需要从开孔电导变化 (G 毛孔 ) 盐浓度 (0.1 M KCl)。正如之前的研究中所讨论的，直径为 d 的带负电荷的纳米孔的开孔电导方程 长度为 l 在低盐浓度下可以描述为

其中 μ K 和 μ Cl 是 K ⁺ 的电泳运动 和 Cl ⁻ , n 氯化钾 是 K ⁺ 的数密度 和 Cl ⁻ , 基本电荷为 e, σ p 是纳米孔表面的表面电荷密度。本实验对固态纳米孔进行了化学修饰，改变了纳米孔的直径。纳米孔表面的表面电荷密度（σ p ) 无法准确获得。因此，开孔电导 (G 毛孔 ) 是根据等式 (1) 计算的。根据等式 (1)，开孔电导 (G 毛孔 ) 是 ~7.5 纳秒。据推测，电导的变化可归因于两个原因[15]。第一个原因是纳米孔中离子的体积排斥被聚集的ABTS ^•+ 占据 分子。结果，固态纳米孔的电导降低（ΔG ^- ）。第二个原因是，一些离子被聚集的 ABTS ^•+ 从纳米孔中带走 增加固态纳米孔电导的分子。在这些实验中，ABTS ^•+ 纳米孔内产生，不带离子。因此，固态纳米孔的电导变化（ΔG ) 仅由体积排除引起。因此，电导的总变化可以描述为

固态纳米孔电导的降低是由体积排阻引起的，可由下式计算

其中 γ 是颗粒形状因子，它是相同体积的球形与颗粒的表面积比。在这项工作中，聚合的 ABTS ^•+ 分子被简化为一个全局对象，因此 γ 的值 是 1 并且 Λ 是体积排除。本体溶液的电导率σ 是 1.28 S/m，0.1 M KCl (25°C)。

对于体积排除 (Λ )，我们可以从一些其他分子的易位事件中推断出来。用于连接电导变化 (ΔG ) 到分子的物理性质，欧姆定律可以应用于基于固态纳米孔的电解质溶液的体积变化 [59]。当分子在圆柱形固态纳米孔中发生易位事件时，电流瞬间下降。当固态纳米孔的电阻为整个电路电阻时，电导变化(ΔG ) 可以用下面的等式来描述

在这个等式中，A p H 效果 =V p 是固态纳米孔的体积，f (d 米 /D p ，流明/高 效果 ) 是修正因子（它忽略了表面电荷效应），在我们的实验中，我们简化了聚合的 ABTS ^•+ 分子到全局对象；因此，修正系数为 1。 d 米 /D p 是分子直径与纳米孔直径的比值，lm/H 效果 是分子有效长度与纳米孔有效长度的比值。式(5)可简化为

电导的平均值 (G 毛孔 ) 已对易位事件进行了分析。由式(5)可知，体积排除的平均值(Λ ) 在不同的电压 (-400, -500, -600, -700, -800 mV) 下可以获得。同时，所用纳米孔的尺寸是已知的，纳米孔的体积（V p ) 是 ~90746 nm ³ .考虑到等式（4），电导变化的值（ΔG ^- ) 可以计算为 ~0.6 nS。从不同电压（-400、-500、-600、-700、-800 mV）的易位事件实验中获得的电导变化的平均值为~0.784 nS。可以发现计算值与实验值接近。

在之前的一些研究中，已经实现了用不同技术检测过氧化氢分子。但是，通过纳米通道检测过氧化氢是罕见的。谭等人。 [3] 当 HRPs 进入纳米孔时，区分不同的事件信号，KCl 溶液中存在 ABTS 和 H2O2。 HRPs易位的不同类型信号被视为ABTS ^•+ 通过纳米孔。分析了酶催化底物产物易位的六个典型事件。他们推测了每种类型的可能过程。但是，没有足够的证据作证。穆巴拉克·阿里等。已经完成检测单个锥形纳米通道内的氧化还原反应产物[58]。他们发现阳离子自由基ABTS ^•+ 以电压依赖性方式降低 HRP 纳米通道中的离子电流，与锥形纳米通道中离子的电压依赖性浓度一致。电流阻塞的大小与溶液中的H2O2浓度相关。

结论

In conclusion, we fabricated a Si3N4 nanopore employing a FIB successfully, a single naonopore system whose surface was modified with covalently linked HRP enzymes. The effect of the immobilized HRPs enzymes in a single solid-state nanopore as a hydrogen peroxide (H2O2) sensor was affirmed by investigating products (ABTS ^•+ ) of the redox reactions occurring in presence of the substrates H2O2 and ABTS. The aggregated cationic radical ABTS ^•+ produced inside the solid-state nanopore and reduced the ionic current in the HRPs modified solid-state nanopore, are consistent with voltage-dependence. The current blockade trends showed linear dependence for applied biased voltages. The relationship between the dwell time versus applied biased voltage was the exponentially decaying (t d   ~ e ^−v/v0 ）。 Meanwhile, the aggregated ABTS ^•+ passed through the HRPs modified nanopores needed a −300 mV threshold voltage. The change of conductance (ΔG) has been calculated analytically and compared to the measured experimental values. The translocation events were produced by the certain size aggregated cationic radical ABTS ^•+ . We expect that using solid-state nanopores will allow lowering the detection limit and improve the system sensitivity. For our solid-state nanopore system, the structure is simple; it is not susceptible to fouling and can be used multiple times.

缩写

3-APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

ABTS:

3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid

EDC:

N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide

FIB:

Focused ion beam

HRP:

Horseradish peroxidase

KCl:

Potassium chloride

NHS:

N-hydroxysuccinimide

SEM：

扫描电镜

SNR:

Signal to noise ratio