一种无需有机溶剂的靶向纳米药物增强抗癌功​​效的新方法

背景

在过去的二十年中，研究的重点集中在改善化疗的次优药代动力学特性以提高其疗效 [1, 2]。取得了重大进展，并成功制备了许多基于纳米颗粒的多功能给药系统，展示了长循环[3, 4]、靶向[5,6,7]、成像[8]等广泛的综合特性。 ,9,10]、pH敏感性[11, 12]和药物缓释[9, 13]。

近年来，非球形颗粒形状因其对药物递送的潜在影响而受到越来越多的关注 [14,15,16,17,18,19]。已经有证据表明，形状对颗粒的许多特性有影响，例如生物分布和降解 [20,21,22]。最重要的是，细胞内化被证明强烈依赖于形状 [23,24,25]。因为这些颗粒必须能够进入癌细胞并作用于它们的治疗目标以杀死它们。并且很多研究发现癌细胞偏好高纵横比的颗粒[10, 26]。

然而，这些方法中的大多数严重依赖有机溶剂，主要是由于纳米颗粒制备过程中需要疏水基团 [27]。这些有机溶剂可能残留在颗粒内，无法通过常规做法（例如减压蒸馏或冷冻干燥）完全去除。结果，药物中残留微量有机溶剂，称为残留溶剂。虽然残留溶剂很少，可能符合药典特别规定，严格控制药品中残留溶剂的最大允许量，但残留溶剂会在体内积累，加重病情或引起其他严重后果。问题。因此，制造商一直渴望最大限度地减少药物生产过程中使用的有机溶剂的量。因此，将“绿色”化学用于制药行业，对于医药、人类健康和环境而言，将是一个相当大的飞跃，尽管面临诸多困难。

在这项研究中，我们通过完全绿色的方法开发了负载 HCPT 的叶酸 (FA) 改性纳米针 (HFND)，该纳米针具有高纵横比和锋利的末端，且不使用任何有机溶剂。 HCPT 和 FA 改性壳聚糖 (CS-FA) 的 pH 控制沉淀导致纳米针成核，以纳米晶 HCPT 为核心，包裹着 CS-FA 作为空间稳定剂。发现 HFND 具有良好的定位和成像能力。然后系统地研究了体外和体内研究。这些结果凸显了 FA 修饰的成像功能纳米针在高效化疗以及癌症诊断方面的巨大潜力。

方法

材料

所有化学品均为分析级，无需进一步纯化即可直接使用。所有实验均使用去离子 (DI) 水。 FA购自Bio Basic Inc. 10-羟基喜树碱（HCPT；纯度>99%）购自力士珍药业有限公司。壳聚糖（Mw =70 000，脱乙酰度90%）购自浙江奥星。 N -羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）购自Sigma-Aldrich。

FA-壳聚糖偶联物的合成

将 FA (10 毫克)、壳聚糖 (20 毫克)、EDC (4 毫克) 和 NHS (4 毫克) 加入 2 毫升 PBS 缓冲溶液 (pH 5.5) 并在室温下搅拌 12 小时以获得 CS-FA 悬浮液.然后，将悬浮液对缓冲溶液 (pH 10) 进行透析以去除过量的 FA 分子。将剩余的悬浮液离心 (5000 rpm) 并冻干 24 小时以获得干燥的 CS-FA 粉末。

HFND 的制备

将 HCPT（10 μg）溶解在 200 μL NaOH 水溶液（0.1 M）中得到溶液 A，将 CS-FA（10 μg）溶解在 200 μL HCl（0.1 M）中得到溶液 B。然后，溶液 A在剧烈搅拌下将溶液 B 和溶液 B 逐滴加入纯水 (1 mL) 中，持续 30 秒，并将混合物在冰浴中超声处理 (200 W) 6 分钟。将悬浮液离心（10,000 rpm，5 分钟）并冻干 24 小时。 NDs的制备采用壳聚糖溶液代替B溶液。

特征化

在 15 kV 下通过 SEM (UV-70) 检查 HFND 的形态。尺寸和 zeta 电位值由 Malvern Zetasizer Nano-ZS 机器（Malvern Instruments，Malvern）确定。进行三个平行测量以确定平均值。 HFND 的结晶度使用 XRD (X’pert PRO) 进行分析。 HFND 中 FA 的含量通过紫外分光光度法 (Beckman DU800) 测定。所有样品均在 281 nm 处进行分析。预先绘制标准曲线以确定 FA 浓度。 HFND 中 HCPT 的含量通过 383 nm 的荧光分光光度法测定。预先绘制标准曲线以确定HCPT的浓度。含量和包封率由方程计算。 （1、2、3 和 4）：

体外药物释放研究

HFNDs 的体外药物释放研究是使用透析技术进行的。将 HFND 分散在 PBS 缓冲溶液 (10 mL) 中并置于预溶胀的透析袋 (MWCO 3500 Da) 中。然后将透析袋浸入 PBS (0.1 M, 200 mL, pH 7.4) 中并在 37 °C 的摇床培养箱 (100 rpm) 中连续振荡。所有样品均采用荧光分光光度法测定。

细胞的共聚焦成像

使用 Leica 激光扫描共聚焦显微镜进行细胞的共聚焦成像。 HCPT 的成像在 382 nm 激光激发下进行，并在 500-550 nm 范围内收集发射。接种 HeLa 细胞并在 37°C 下预孵育 24 小时（5% CO2），然后与 HFND 孵育 8 小时。

通过荧光测量测量的细胞摄取

HeLa 细胞接种于 24 孔板（1 × 10 ⁶ 毫升/孔）。然后将板在加湿气氛 (5% CO 2 )中在 37°C 下孵育 24 小时。然后将细胞与等量 HCPT 浓度的 NDs 和 HFNDs 一起孵育。药物处理的细胞在 37°C 下孵育 6 小时，然后用 PBS 洗涤两次，并用胰蛋白酶 (0.05%)/EDTA 处理消化。将悬浮液离心（1000 rpm，4°C）4 分钟。细胞沉淀用 PBS 洗涤以去除培养基中的背景荧光。洗涤和离心两个循环后，将细胞用 2 mL PBS 重悬，并通过强力超声彻底破碎。通过荧光光谱法（在 382 nm 激发）分析超声处理的混合物中 HCPT 的量。测定无药物空白细胞，测定细胞自发荧光水平作为对照。

细胞毒性测定

MTT法测定HFNDs的细胞毒性。简而言之，将足够数量的指数期 HeLa 细胞一式五份接种在 96 孔平底微量培养板中，并在药物/颗粒存在下孵育 24 小时。在本研究中，每孔中加入 20 μL 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四唑溴化物 (MTT) 溶液（PBS 中 5 mg/mL），并且将板在 37°C 下再孵育 4 小时。然后，加入体积为 150 μL 的二甲基亚砜 (DMSO)，并将板在 37°C 的水浴搅拌器上搅拌 30 分钟。使用酶标仪（680 型；Bio-Rad）测量 570 nm 处的吸光度。

生物分布

对于体内荧光成像，DiR 被封装在 NDs 和 HFNDs 中。 DiR-NDs 和 DiR-HFNDs 通过尾静脉以每公斤小鼠体重的 DiR-HCPT 的等效剂量静脉注射到荷荷瘤裸鼠体内。在预定的时间间隔内，小鼠被麻醉并用 Maestro 体内成像系统（Cambridge Research &Instrumentation，Woburn，MA，USA）成像。 24 小时后，处死小鼠，切除肿瘤以及主要器官（脾、肝、肾、肺和心脏），然后用 0.9% NaCl 清洗表面用于离体成像。

体内肿瘤抑制

当 HeLa 荷瘤小鼠的 HeLa 肿瘤体积约为 60 mm ³ ，将小鼠随机分为四组，每 3 天静脉注射 0.9% NaCl、游离 HCPT、ND 和 HFND，剂量为每只小鼠 80 μg HCPT。每 3 天监测一次肿瘤体积和体重。肿瘤体积由下式计算：肿瘤体积 =0.5 × 长度 × 宽度 ² .

21 天后，处死小鼠，然后切除肿瘤并称重。然后，将肿瘤在 4°C 下在 4% 多聚甲醛中固定过夜，包埋在石蜡中，切片（4 μm），苏木精和伊红（H＆E）染色，并使用数字显微镜系统观察。

统计分析

使用学生的 t 评估治疗结果的统计显着性 测试（双尾）； P <0.05 被认为在所有分析中具有统计学意义（95% 置信水平）。

结果与讨论

FA-壳聚糖偶联物的合成

首先，我们通过 FA 的羧基端基和壳聚糖的酰胺基之间的酰胺化反应将 FA 与壳聚糖偶联（图 1）。通过傅里叶变换红外 (FT-IR) 光谱证实了共轭 (CS-FA) 的结构。如图 2 所示，CS-FA 的 IR 光谱中 1605/cm 处的峰比壳聚糖的强，对应于新酰胺键的 C=O 伸缩振动。结果表明，FA通过酰胺键与壳聚糖的酰胺基成功偶联。为了研究共轭中 FA 的百分比，通过紫外分光光度法建立了标准曲线。 FA的百分比计算为23.4 ± 2.5%。

CS-FA偶联物的合成路线

(a的FTIR光谱 ) FA, (b ) 壳聚糖和 (c ) CS-FA

HFND 的准备

众所周知，HCPT在水中的溶解度极差，但在碱中可以溶解。壳聚糖正好相反：溶于酸，不溶于水。 CS-FA 表现出与壳聚糖相似的溶解度。因此，HCPT 和 CS-FA 分别溶解在碱和酸中。当两种溶液混合时，会发生中和反应。生成的混合物被控制为中性，这对于 HCPT 和 CS-FA 都是不良溶剂。 pH 值变化引发的溶解度降低为 HCPT 纳米针的成核和伴随的 CS-FA 共沉淀到生长的 HCPT 纳米针上提供了机会（图 3a）。超声下纳米针的动态成核和沉淀，加上软成分 CS-FA 的主动封闭，导致形成 HFND，而不是块状 HCPT 晶体。为了优化配方条件，设计了条件实验来研究 HCPT 与 CS-FA 的比例、超声波功率、所产生混合物的 pH 值以及所产生混合物的浓度对 HFND 形态的影响（表 1）。

一 制备 HFND 的完全绿色方法的图示。 b , c HFNDs的SEM图像

图 4 显示了不同条件下颗粒的形态。当 CS-FA 过多时，多余的 CS-FA 会附着在产生的颗粒表面（图 4a）。虽然 CS-FA 太少，但 CS-FA 无法阻止易于聚集的 HCPT 纳米针的生长（图 4b）。由于成核是由 pH 值变化引发的，所产生混合物的 pH 值在制备过程中起着重要作用。 pH 值应控制在中性，否则会破坏结晶（图 4c）。超声功率对 HFND 的形态也有很大影响。纳米针会在低功率下聚集（图 4d）并在高功率下分解成碎片（图 4e）。此外，发现产生的混合物的浓度对 HFND 的尺寸有很大影响。尺寸随着浓度的增加而减小（图 3b 和 4f）。

一 –f HFND 在不同条件下的 SEM 图像（详见表 1）。 g HFND 的粒径分布。 h HFND 的 Zeta 电位

图 3b、c 显示了 HFND 的优化针形形态，平均长度约为 800 nm，宽度约为 80 nm。 DLS 测量结果显示尺寸为 104.3 ± 5.7 nm（图 4g），zeta 电位为 +16.3 ± 1.9 mv（图 4h）。更重要的是，2wt% HFNDs 分散体至少在 2.5 天内显示出良好的稳定性。由于没有来自 CS-FA 的荧光信号，我们可以利用 HCPT 的荧光特性来测量 HFNDs 的 HCPT 载药量。 HFNDs的HCPT载药量为70.2 ± 3.1%，包封率为83.1%。 HFNDs的FA含量为7.0%，通过FA在CS-FA中的百分比计算得出。

XRD 分析

众所周知，药物的形式极大地影响纳米颗粒的性质。因此，了解 HFND 中 HCPT 的形式非常重要。 X 射线衍射用于检测 HFND 中 HCPT 的形式（图 5）。很明显，纯HCPT显示出许多尖锐的结晶峰，代表了高结晶度的特征。虽然半结晶壳聚糖的宽峰仍然存在于 HFND 的 XRD 图中，但大部分峰属于 HCPT，表明 HCPT 的结晶度较高。简而言之，XRD 结果表明 HCPT 在 HFND 中处于结晶状态。此外，HFND 内 HCPT 的生长动力学发生了变化，这主要是由于 CS-FA 的主动封闭和限制作用。为了研究 CS-FA 在结晶过程中的影响，在不存在 CS-FA 的情况下制备了 HCPT 晶体。图 6 显示了 HCPT 晶体的形态。它们呈棒状，长度超过 10 μm，与 HFND 完全不同。这进一步表明CS-FA改变了HFNDs内HCPT的生长动力学。

(a的XRD图谱 ) 壳聚糖, (b ) HCPT 和 (c ) MHNDs

HCPT块状晶体的SEM图像

体外药物释放研究

由于药物释放行为是给药系统的一个重要特性，HFND 的体外释放研究是使用透析技术与游离 HCPT 粉末一起进行的。所有样品均通过高效液相色谱法 (HPLC) 进行分析。释放曲线如图 7 所示。游离 HCPT 的曲线表明，至少 30% 的药物在 1 小时的第一次采样时间被释放，到 18 小时几乎是 100%。然而，HFND 的释放曲线似乎是两种药物在 48 小时内的显着延长和持续释放。延长药物释放可归因于 CS-FA 的聚合物外壳可以限制药物在核心中的释放。这些优势可以促进HFNDs在持续给药系统中的应用。

MHND 在 PBS (pH 7.4) 中 37°C 的体外药物释放曲线。 (a ) 免费 HCPT； (b ) 高频ND

细胞摄取

无论药物递送系统如何到达靶肿瘤部位，通过全身给药或直接局部给药，如果它们能够穿透肿瘤区域以作用于它们的细胞内靶标是非常重要的。进行共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 以评估 HFND 的细胞摄取。为了评估 HeLa 细胞的细胞摄取效率，将 HFND 和 HCPT 负载的纳米针（ND；载药量 =64.7%）与 HeLa 细胞在 37°C 下孵育 8 小时（ND 由 HCPT 和壳聚糖通过以下方式制备）与 HFND 相同的方法）。如图 8 所示，在孵育 8 小时后，暴露于 HFND 的细胞检测到的 HCPT 荧光发射比暴露于 ND 的细胞强得多，说明颗粒表面的 FA 可以大大增强细胞摄取。

在 37°C 下进行 8 小时的细胞内药物递送。用 a 孵育的 HeLa 细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像 HFND 和 b ND

为了进一步证实 HFND 的细胞内化速率更快，进行了荧光测量以量化 HeLa 细胞中 HCPT 荧光发射强度的差异。与 CLSM 观察结果一致，HFNDs 在细胞内化过程中比 NDs 更受欢迎（图 9）。这进一步验证了HFNDs的靶向特性。

HeLa 细胞与 HFNDs (a ) 和 ND (b ) 在 37°C 下经过 8 小时的潜伏期； P <0.05

细胞毒性分析

为了进一步研究利用 HFNDs 进行局部给药的可能性，我们测试了 HFNDs 对癌细胞的杀伤能力。 HFNDs 的细胞毒性使用 MTT 测定法对 HeLa 细胞进行评估。游离的 HCPT 和含有等效浓度 HCPT 的 NDs 用作对照。 HCPT 的浓度为 0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 和 16 μg/mL。如图 10 所示，HCPT 的细胞毒性高于 ND，主要是因为 HCPT 的药物释放速率比 ND 快得多。然而，HFNDs 的细胞毒性高于 HCPT。这可能是由于 FA 在 HFND 表面的靶向特性，可以帮助粒子进入细胞并杀死它们。因此，HFNDs 对癌细胞表现出惊人的良好杀伤能力。这些结果证实了HFNDs表面的FA可以增加细胞对颗粒的摄取，从而通过与FA受体结合而提高对癌细胞的杀伤能力。

用 (a ) 免费 HCPT，(b ) ND 和 (c ）孵育 24 小时后的 HFND。 P <0.05

生物分布

为了评估双药纳米针的肿瘤靶向能力，将 DiR 用作近红外荧光探针，以等效的 DiR 浓度封装到游离的 HCPT、ND 和 HFND 中。将0.9% NaCl、DiR-NDs和DiR-HFNDs静脉注射到人宫颈癌HeLa细胞来源的荷瘤小鼠体内，并研究它们的体内生物分布。

如图 11a 所示，虽然在 DiR-ND 组的肿瘤部位未检测到荧光信号，但在 DiR-HFND 组中观察到强荧光信号。当总荧光计数一直减少时，肿瘤部位的信号强度从 1 小时到 12 小时增强，表明 HFND 在此期间在肿瘤中积累。 24 小时后，处死小鼠，分离肿瘤组织和正常组织用于离体成像和分析（图 11b、c）。DiR-HFNDs 处理的小鼠肿瘤组织中的荧光强度显着高于其他老鼠。验证了FA的引入为纳米针提供了优异的肿瘤靶向功效，从而实现了更高效率的癌症治疗。

一 DiR 纳米颗粒在 HeLa 荷瘤小鼠中的分布和肿瘤积累，接受指定制剂的静脉注射。 b 从安乐死的 HeLa 荷瘤裸鼠身上采集的肿瘤和正常组织的离体荧光成像。图像是在注射后 24 小时拍摄的。 H、Li、Lu、K、S和T分别代表心、肝、肺、肾、脾和肿瘤。 c 全身注射后 24 小时收集的肿瘤组织中的 DiR 荧光强度。 P <0.05。 (a ) 0.9% NaCl, (b ) DiR-ND，和 (c ) DiR-HFNDs

体内肿瘤抑制

为了评估体内抗肿瘤作用，我们在昆明小鼠中产生了 HeLa 肿瘤异种移植物，并评估了静脉注射 0.9% NaCl、游离 HCPT、NDs 和 HFNDs 与相同浓度的 HCPT 后的肿瘤生长。与作为对照的 0.9% NaCl 处理的小鼠相比，接受游离 HCPT 或 NDs 的小鼠的肿瘤生长速率逐渐下降（图 12a），表明肿瘤生长抑制显着有效。值得注意的是，HFND 对肿瘤生长的抑制作用最为显着。在实验结束时，切除肿瘤并称重。如图 12c 所示，发现双药纳米针与其他组相比具有更好的治疗效果（P <0.05)。双药纳米针增强抗癌作用的另一个证据显示在组织学图像中（图 12d）。对于任何给药系统，应考虑游离 HCPT 介导的治疗中通常遇到的全身毒性，以确保安全性和有效性。在这项工作中，游离 HCPT 的给药导致小鼠无精打采/懒惰和严重的体重减轻（图 12b），表明化疗的不良副作用。相反，在用 NDs 和 HFNDs 治疗的小鼠中没有显示出明显的副作用。综上所述，说明抗癌效果好、毒性低的HFNDs将大大提高生活质量治疗的疗效。

不同（纳米）制剂的抗癌作用。 一 治疗期间小鼠肿瘤体积变化。 b 荷瘤小鼠在治疗过程中的体重变化。 c 不同制剂治疗后HeLa肿瘤的重量。 d 治疗后小鼠肿瘤的组织切片。 (a ) 0.9% NaCl 水溶液，(b ) 免费 HCPT，(c ) ND 和 (d ) HFND。所有制剂在荷有 HeLa 肿瘤的小鼠中使用相同浓度的 HCPT。 P <0.05

结论

本研究提出了一种完全绿色的方法来获得 FA 修饰的、载有 HCPT 的纳米针，用于具有高载药量、靶向性和成像能力的高效化疗。药物释放曲线显示 HFND 显示出持续和延长的释放。 CLSM 证明 HFNDs 比 NDs 更有效的细胞内化。 MTT 实验表明，HFNDs 不仅显示出比单个药物和 NDs 高得多的细胞毒性。这说明了 HFND 的良好靶向特性。这项工作为用完全绿色的方法设计新剂量的纳米粒子打开了一扇大门，这可能对未来的环境保护产生强大的影响。